FtsZ (236-245) 区域的两性螺旋特性对大肠埃希氏菌FtsZ组装和功能的影响
马青素^1,2, 张慧娟¹, 郑晓伟¹, 霍雨佳¹, 卢锋¹
1.河南大学医学院抗体药物河南省工程实验室, 河南 开封 475001;
2.河南省濮阳市人民医院, 河南 濮阳 457000

收稿日期：2016-07-22；修回日期：2016-12-26；网络出版日期：2017-01-19

_*通信作者：卢锋, Tel/Fax: +86-10-23880398; E-mail: lufeng@henu.edu.cn


摘要： [目的]探索大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli）FtsZ（236-245）结构域两性螺旋特性对FtsZ组装和FtsZ-FtsA相互作用的影响。[方法]利用分子克隆和定点突变技术，构建FtsZ及其突变体表达载体，亲和纯化获得相应目标蛋白；通过同源重组和P1转导构建QN23-QN29菌株；利用活细胞成像观察FtsZ及其突变体的胞内定位特点；膜蛋白分离和Western blot分析FtsZ突变体的膜结合特性变化；非变性胶分离和体外聚合分析检测定点突变对FtsZ单体组装特性的影响；免疫沉淀和Far western blot实验检测FtsZ/FtsZ*-FtsA间的相互作用。[结果]FtsZ^E237A/K和FtsZ^E241A/K突变体的功能活性降低、各突变体在E. coli内不能正确定位和形成功能性Z环；E237A/K和E241A/K位点突变致各突变体聚合能力降低、FtsZ*-FtsA的相互作用减弱和FtsZ的膜结合特性变化。[结论]E237和E241是影响FtsZ（236-245）区域两性螺旋特性和FtsZ组装及FtsZ-FtsA相互作用的重要氨基酸。
关键词： 大肠埃希氏菌 (E. coli) FtsZ突变体 (FtsZ*) FtsA 两性螺旋
Effect of amphipathic helix characteristics of FtsZ (236-245) domain on FtsZ assembly and its function in Escherichia coli strains
Qingsu Ma^1,2, Huijuan Zhang¹, Xiaowei Zheng¹, Yujia Huo¹, Feng Lu¹
1.Henan Engineering Laboratory of Antibody Medicine, Medical School of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China;
2.People's hospital of Puyang City, Puyang 457000, Henan Province, China

Received 22 July 2016; Revised 26 December 2016; Published online 19 January 2017
_*Corresponding author: Feng Lu, Tel/Fax: +86-10-23880398; E-mail: lufeng@henu.edu.cn

Abstract: [Objective]To study the effect of amphipathic helix characteristics of FtsZ (236-245) domain on FtsZ assembly and interaction of FtsZ with FtsA in Escherichia coli strains.[Methods]We constructed FtsZ and its mutant's plasmids by molecular clone and site-directed mutagenesis, and purified targeted proteins using affinity chromatography. QN23-QN29 strains were constructed by linear DNA homologous recombination and P1 transduction. We observed cellular localization patterns of FtsZ and its mutants in E. coli by living cell imaging experiments, examined membrane binding properties of FtsZ mutants by membrane proteins isolation and Western blot analysis, and analyzed interaction of FtsZ/FtsZ* with FtsA by Co-immunoprecipitation and far Western blot. Native gel separation and in vitro polymerization experiments were done to check effects of FtsZ point mutation on FtsZ assembly.[Results]Yfp-labeled FtsZ^E237A/K and FtsZ^E241A/K mutant proteins failed to localize in E. coli strains, assemble into functional Z-ring structure, and had decreased function of FtsZ (wt). In vitro experiments showed that E237A/K and E241A/K mutations of FtsZ decreased the polymerization efficiency of FtsZ monomer, weakened FtsZ*-FtsA interaction and changed membrane binding properties of FtsZ.[Conclusion]FtsZ E237 and E241 are critical amino acids that affect the amphipathic helix characteristics of FtsZ (236-245) domain, FtsZ assembly and FtsZ-FtsA interaction in E. coli strains.
Key words: Escherichia coli FtsZ mutant (FtsZ*) FtsA amphipathic helix
在大肠埃希氏菌，细胞分裂是细菌生物学最重要且较少理解的问题之一。由于参入该过程的基因主要通过条件突变、在非允许温度条件下致菌体呈长丝状发现的，所以称此类基因为fts (filamentous temperature-sensitive) 基因^[1]。到目前为止，已知fts基因编码的蛋白至少有14种 (如FtsZ、FtsA、FtsL、FtsI、FtsN、FtsK、FtsQ、FtsW和FtsB等)^[2-5]，这些蛋白以FtsZ所形成的Z环为骨架结构，通过蛋白与蛋白的相互作用网，参与Z环的组装和稳定，进而调控细菌细胞的分裂和菌体的形态。
FtsZ为细菌分裂所必需的蛋白，是微管蛋白的原核类似物，在多种致病菌中高度保守。当FtsZ单体结构异常，往往会影响其进一步组装成功能性Z环和对细菌分裂的调控，导致菌体异常分裂或细菌死亡。在菌体内，FtsZ单体通过纵向和横向相互作用组装成结构复杂的复合体，这一过程受FtsA、zipA、FtsI和FtsN等多种蛋白的调节^[6-8]，但关于FtsZ单体是如何组装成功能性Z环、单体内哪些关键氨基酸决定着FtsZ的结构与功能和菌体内哪些蛋白参入和/或调控Z环的组装和稳定等，皆未完全清楚，而对于相关分子机制的揭示对以FtsZ为靶点进行新一代抗生素研发具有指导意义。
近年来，人们对影响FtsZ结构和功能的重要氨基酸研究多集中在FtsZ单体的纵向接触面 (即内表面，interface)，这与该区域是FtsZ结合GTP及发挥其GTPase功能的结构域有关。Monahan LG等发现，FtsZ单体组装成原丝 (protofilament) 后，通过侧面相互作用而进行的横向组装，是FtsZ能在即将分裂的菌体中部形成分裂体即功能性Z环的重要基础^[9-11]，但具体机制及涉及到侧面组装的关键氨基酸未明确；Loose等观察到，在细菌分裂的最后阶段，FtsA与FtsZ共定位于位于细菌中部的分裂体，而且FtsA-FtsZ的相互作用是多种致病菌正确分裂所必需的^[12]。本文通过对E. coli FtsZ的三维结构进一步分析，发现FtsZ (236-245) 结构域位于FtsZ单体的侧面，且具有两性螺旋特性；Stricker J等将同一结构域中的245位丝氨酸 (S) 突变为苯丙氨酸 (F) 时，致E. coli生长缓慢，菌体呈长丝状；活细胞成像显示FtsZ单体不能正确组装成功能性的Z环，而是沿菌体内膜呈点状分布^[13]。那么与S245处于两性螺旋同一极性面的E241和E237是否影响FtsZ组装和功能呢？本研究通过定点突变及相关分析，拟初步探索E241和E237对FtsZ功能和组装及FtsZ-FtsA相互作用的影响及分子机制。
1 材料和方法 1.1 主要试剂 T4 DNA连接酶、ES-Tag DNA聚合酶和限制性核酸内切酶购自宝生物工程 (大连) 有限公司；DNA凝胶回收试剂盒 (DP209-02) 和质粒小提试剂盒 (DP103-02) 购自TIANGEN公司；抗FtsZ抗体 (AS10715) 为美国Agrisera产品，抗His-tag抗体 (66005-1-Ig)、抗flag-tag抗体 (20543-1-AP) 和二抗-HRP (羊抗兔SA00001-2、羊抗鼠SA00001-1) 为Proteintech产品；细菌基因组DNA提取试剂盒 (CW0552) 和抗GFP标签抗体 (CW0087) 购自北京康为世纪，IPTG和L (+)-arabinose为Sigma产品；蛋白亲和纯化柱 (HisTrap HP，17-5247-01) 为GE公司产品；基因定点突变试剂盒 (Cat^#200518) 为美国Stratagene产品；免疫共沉淀试剂盒 (cat^#46147) 为Thermo产品。
1.2 菌株、质粒和载体 Escherichia coli MC1000 (F-araD139Δ(araABC-leu) 7679 galU galKΔ(lac) X74 rpsL thi)、BL21和DH5α，载体pMLB1113和pET30a (+) (Invitrogen)，质粒pKD3、pKD119和pFL11由实验室保存^[7-9](表 1)。
表 1. 研究中所使用的菌种和质粒 Table 1. Strains and plasmids used in this study

Strains or plasmids	Genotype and/or features	Resistance	Source
MC1000	F-, △ (araA-leu)7697, [ara139]B/r, Δ (codB-lacI)3, galk16, galE15 (GalS), λ-, e14-, relA1, rpsL150 (strR), spoT1, mcrB1	－	[14]
pMLB1113	Low copy number vector (18 per cell)	Ampicillin	[14]
pKD119	Red recombinase expression plasmid	Tetracycline	[15]
pKD3	Cat marker for gene deletion constructs	Chloramphenicol	[15]
pFL11	Plac-yfp::ftsZ	Ampicillin	[16]
pQN13	Plac-yfp::ftsZE237A	Ampicillin	This study
pQN14	Plac-yfp:ftsZE237D	Ampicillin	This study
pQN15	Plac-yfp::ftsZE237K	Ampicillin	This study
pQN16	Plac-yfp::ftsZE241A	Ampicillin	This study
pQN17	Plac-yfp::ftsZE241D	Ampicillin	This study
pQN18	Plac-yfp::ftsZE241K	Ampicillin	This study
pQN21	Plac-ftsA::his6	Ampicillin	This study
pFL15	Plac-ftsZ::his6	Ampicillin	[16]
FL37/pFL11	MC1000/pFL11 (ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZ)	Chloramphenicol	[16]
pQN24	Plac-ftsZE237A::his6	Ampicillin	This study
pQN25	Plac-ftsZE237D::his6	Ampicillin	This study
pQN26	Plac-ftsZE237K::his6	Ampicillin	This study
pQN27	Plac-ftsZE241A::his6	Ampicillin	This study
pQN28	Plac-ftsZE241D::his6	Ampicillin	This study
pQN29	Plac-ftsZE241K::his6	Ampicillin	This study
QN19	MC1000:mreB::his6-Cat	Chloramphenicol	This study
QN20	MC1000:mreB::his6	－	This study
QN21	QN20:ftsA::flag-Cat	Chloramphenicol	This study
QN22	MC1000:mreB::his6, ftsA::flag	－	This study
QN23	QN22:ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZ	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN24	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE237A	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN25	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE237D	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN26	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE237K	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN27	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE241A	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN28	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE241D	Chloramphenicol, Ampicillin	This study
QN29	QN22: ΔftsZ-Cat/Plac-yfp::ftsZE241K	Chloramphenicol, Ampicillin	This study

表选项






1.3 质粒构建 根据定点突变原理，分别设计FtsZ E237A、E237D、E237K、E241A、E241D和E241K定点突变引物，然后以pFL11 (P_lac-yfp::ftsZ) 质粒DNA为模板，按试剂盒 (Cat^#200518) 操作手册对目的基因进行定点突变，所得突变体表达质粒分别为pQN13 (P_lac-yfp::ftsZ^E237A)、pQN14 (P_lac-yfp::ftsZ^E237D)、pQN15 (P_lac-yfp::ftsZ^E237K)、pQN16 (P_lac-yfp::ftsZ^E241A)、pQN17 (P_lac-yfp::ftsZ^E241D) 和pQN18 (P_lac-yfp::ftsZ^E241K)。
以pQN13-pQN18质粒DNA为模板，使用pET30a (+) 载体，分别构建FtsZ各突变体原核表达质粒pQN24 (P_lac-ftsZ^E237A::his₆)、pQN25 (P_lac-ftsZ^E237D::his₆)、pQN26 (P_lac-ftsZ^E237K::his₆)、pQN27 (P_lac-ftsZ^E241A::his₆)、pQN28 (P_lac-ftsZ^E241D::his₆) 和pQN29 (P_lac-ftsZ^E241K::his₆)；以E. coli MC1000基因组DNA为模板，利用分子克隆技术，常规构建C端带His标签的FtsA融合表达质粒pQN21 (P_lac-ftsA::his₆)。上述构建的所有质粒皆通过测序证明。
1.4 菌株构建 根据文献[14]报道的方法，以大肠埃希氏菌MC1000为受体菌，利用同源重组技术分别构建QN18 (MC1000:mreB::his₆-cat)、QN19 (MC1000: mreB::his₆) 和QN20 (MC1000: ftsA::flag-cat) 菌株；以QN19为受体菌，通过P1转导技术构建QN21 (MC1000:mreB::his₆, ftsA::flag-cat)，再使用pCP20质粒，通过重组去除抗生素抗性基因，获得QN22 (MC1000: mreB::his₆, ftsA::flag) 菌株；以QN22为受体菌、FL37/pFL11 (ΔftsZ-Cat/P_lac-yfp::ftsZ) 为供体 (donor) 菌 (提供ftsZ基因敲除盒子: ΔftsZ-Cat)^[15]，通过P1转导分别获得QN23-QN29菌株 (详细信息见表 1)。为了便于表述，文中将E. coli表型mreB::his₆, ftsA::flag, ΔftsZ-Cat设为QN。
1.5 荧光显微镜观察FtsZ及其突变体的细胞内定位 根据前期的实验方法^{[11, 16-17]}，从LB琼脂平板上分别挑取相应菌株新鲜的单菌落，常规接种于5 mL LB中 (包含相应的抗生素，10 μmol/L IPTG)，30 ℃摇菌。当OD₆₀₀≈0.8左右时，取10 μL新鲜菌液滴于载玻片上并盖上盖玻片。荧光显微镜下观察YFP::FtsZ/FtsZ*在细胞内的定位特点 (物镜×100，目镜×10)。
1.6 FtsZ及其突变体的功能检测 QN23-QN29菌37 ℃过夜培养，次日测OD₆₀₀后用相同培养基稀释到OD₆₀₀≈0.05，在5 mL的培养体系中重新活化至OD₆₀₀≈0.5。系列稀释 (10^-1-10^-5) 各组菌液，每组样品每个稀释度取1.2 μL接种于LB琼脂板上 (含30 μg/mL Cat，100 μg/mL Amp，20 μmol/L IPTG)，37 ℃培养24 h。细菌生长曲线的绘制从OD₆₀₀≈0.05开始，第1个检测点为活化后1.5 h，以后每间隔1 h取样测1次菌液OD₆₀₀。
1.7 E. coli膜蛋白分离 QN23-QN29菌的培养条件和细菌的收集与免疫共沉淀相同。500 mL菌液离心所得的菌体沉淀反复冻融3次后，用预冷的15 mL 20%蔗糖溶液[使用HE缓冲液 (10 mmol/L Hepes pH 7.4，5 mmol/L EDTA) 配制]悬浮，使用超声破碎仪破碎细胞3次，每次20 s。细胞膜组份分离采用两步蔗糖梯度离心法^[18]，所得的SG0 (包含所有细胞膜) 组份用HE缓冲液洗涤1次，超速离心 (130000×g，30 min) 后的沉淀用400 μL TE缓冲液 (10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5) 悬浮，加入100 μL的20% SDS溶液后充分混匀；100 ℃煮5 min，离心 (12000×g，2 min)，所得样品-20 ℃冻存，供Western blot分析。
1.8 蛋白表达和纯化 分别用pQN24 (P_lac-ftsZ^E237A::his₆)、pQN25 (P_lac-ftsZ^E237D::his₆)、pQN26 (P_lac-ftsZ^E237K::his₆)、pQN27 (P_lac-ftsZ^E241A::his₆)、pQN28 (P_lac-ftsZ^E241D::his₆)、pQN29 (P_lac-ftsZ^E241K::his₆) 和pQN21 (P_lac-ftsA::his₆) 质粒转化BL21(DE3) 并诱导表达目标蛋白。具体纯化过程参照文献[19]方法进行。使用LB培养基、0.2 mmol/L IPTG、30 ℃条件下诱导培养4.5 h，离心收菌 (4696×g，10 min)；在50 mmol/L Tris (pH 7.9) 缓冲液中冻融2次后超声破碎菌体细胞；超速离心 (23480×g，30 min，4 ℃)得上清液，使用HisTrap HP柱亲和纯化靶蛋白并定量。
1.9 免疫共沉淀分析 QN23-QN29菌细胞裂解液的制备参照前期工作^{[17, 20]}。用5-10 mL的Buffer A [10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，0.5% Tween-20，5% glycerol，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF]溶解蛋白沉淀并加入适当体积的cocktail (50×)，定量其浓度后分装，-80 ℃保存。免疫共沉淀分析过程按试剂盒说明书 (cat^#46147，Thermo) 和文献[15]报道进行。每个反应管使用10 μg抗-Yfp抗体 (CW0087，康为世纪)、800 μg菌体总蛋白和25 μL protein A/G plus agarose beads，Co-IP蛋白洗脱液体积为50 μL。
1.10 Western blot和Far Western blot分析 Far Western blot按文献[21-22]进行。使用纯化的FtsA-his₆蛋白作为诱饵蛋白，2-3 μg该蛋白与适当体积的2% SDS上样缓冲液混合，100 ℃煮沸4 min，离心。常规进行SDS-PAGE电泳和转膜。为使Far Western blot分析膜上的蛋白复性，使用TEN50 buffer (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl) 将膜在4 ℃条件下孵育72 h，然后用含5%脱脂奶粉的HHB buffer (20 mmol/L HEPES，pH 7.7，75 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L DTT，0.05% Triton X-100) 室温下封闭膜1 h。用手术刀沿各泳道边缘将封闭后的NC膜切成等宽的长条，分别与1 mg的各细菌裂解蛋白 (在含有1%脱脂奶粉的HHB buffer中) 4 ℃过夜孵育；使用丽春红染色的转印膜作为对照。Western blot具体分析参考文献[17]。抗-FtsZ、抗-His、抗-Flag、抗-YFP和羊抗兔二抗的稀释度分别为1:1000、1:1000、1:1500、1:2000和1:20000，显色方法为ECL (P1020，北京普利莱)。
1.11 FtsZ及其突变体的体外聚合分析 用聚合buffer (50 mmol/L Mes，pH 6.5，50 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L CaCl₂) 将FtsZ或其突变体纯化蛋白稀释到6 μmol/L，30 ℃孵育3 min后加入GTP至终浓度1 mmol/L。轻轻混匀后室温静止20 min，超速离心 (100000×g，10 min)，然后分别取相同体积的上清 (Supernatant，S) 和沉淀 (Pellet，P) 进行Western blot分析。另外取等体积室温静止20 min的上述液体进行非变性胶凝胶电泳，转膜后使用抗-FtsZ抗体进行Western blot分析。
2 结果和分析 2.1 FtsZ (236-245) 区域的两性螺旋特性对FtsZ功能的影响 由于FtsZ是E. coli等细菌分裂所必需的蛋白，我们使用3D-JIGSAM软件对FtsZ的三维结构进行分析发现，FtsZ (236-245) 结构域具有两性螺旋特性，且位于FtsZ单体的外侧，进一步分析观察到E237、E241位点氨基酸位于FtsZ (236-245) 结构域同一性面 (图 1-A、B)，推测E237、E241可能是影响FtsZ功能的重要氨基酸。我们采用定点突变技术，将E237和E241分别突变为丙氨酸 (A)、天冬氨酸 (D) 和赖氨酸 (K) 后，通过平板补偿实验和生长曲线分析发现FtsZ^E237A/K和FtsZ^E241A/K突变体的功能明显降低 (图 1-C、D)，而FtsZ^E237D和FtsZ^E241D突变体功能活性变化较小，显示FtsZ (236-245) 结构域两性螺旋特性对FtsZ功能的重要性。

图 1. FtsZ (236-245) 区域的两性螺旋特性对FtsZ功能影响的分析 Figure 1. Effect of amphipathic helix characteristics of Escherichia coli FtsZ (236-245) domain on FtsZ function. A: 3D structure prediction of FtsZ; B: helical wheel projection of FtsZ (236-245) domain; C: plate complement assays; D: growth-curve analysis. MC1000, E. coli (wt); QN23: QN/Plac-yfp::ftsZ; QN24: QN/Plac-yfp::ftsZE237A; QN25: QN/Plac-yfp::ftsZE237D; QN26: QN/Plac-yfp::ftsZE237K; QN27: QN/Plac-yfp::ftsZE241A; QN28: QN/Plac-yfp::ftsZE241D; QN29: QN/Plac-yfp::ftsZE241K; QN: mreB::his6, ftsA::flag, △ftsZ-Cat.

图选项

2.2 E237和E241是影响FtsZ在E. coli中形成Z环的重要氨基酸 将E237和E241突变为性质不同的氨基酸为何影响FtsZ功能？推测各位点突变可能影响FtsZ单体在菌体内的组装。我们通过活细胞成像观察到，FtsZ^E237D和FtsZ^E241D突变体与野生型FtsZ相似，其单体可在菌体内部组装成功能性的Z环；FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体细胞内定位模式发生明显的改变，皆未见规则的Z环 (图 2-B、D、E和G)；FtsZ^E237A、FtsZ^E237K和FtsZ^E241K表现为横跨细胞两极的螺旋状，FtsZ^E241A突变体为膜周边定位模式；另外显示FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体致细胞的形态成长丝状。表明这些突变体因不能正确组装成功能性Z环，一定程度上抑制E. coli的分裂。研究中为了排除FtsZ (wt) 和其突变体 (FtsZ^*) 的表达水平可能对FtsZ/FtsZ^*定位的影响，我们通过Western blot分析观察到质粒表达的FtsZ/FtsZ^*与MC1000内源性FtsZ (wt) 的水平大致相同 (图 2-H)。

图 2. YFP::FtsZ及其突变体在E. coli中的荧光定位 (A-G) 和表达水平分析 (H) Figure 2. Analysis of fluorescence localization patterns (A-G) and expression levels (H) of YFP::FtsZ and its point mutants. A:QN/Plac-yfp::ftsZ; B: QN/Plac-yfp::ftsZE237A; C: QN/Plac-yfp::ftsZE237D; D: QN/Plac-yfp::ftsZE237K; E: QN/Plac-yfp::ftsZE241A; F: QN/Plac-yfp::ftsZE241D; G: QN/Plac-yfp::ftsZE241K; QN: mreB::his6, ftsA::flag, ΔftsZ-Cat.

图选项

2.3 FtsZ (236-245) 结构域两性螺旋特性是FtsZ与细胞膜相互作用的重要基础 轮状图分析发现，FtsZ (236-245) 结构域可形成两性螺旋，活细胞成像显示FtsZ^E237A和FtsZ^E241A突变体有较明显的膜周边定位特点。为进一步证实分析推测和实验结果，我们通过两步蔗糖梯度离心法分离QN23-QN29菌细胞膜蛋白，并使用已知膜结合蛋白MreB作内参对照。Western blot分析发现，与野生型FtsZ相比较，FtsZ^E237A和FtsZ^E241A突变体的膜结合特性明显增加，FtsZ^E237K和FtsZ^E241K突变体膜结合能力降低 (图 3-A)，通过辉度扫描进行定量分析显示差异有统计学意义 (P < 0.05)(图 3-B)，提示将E237和E241突变为性质不同的氨基酸，可改变FtsZ (236-245) 区域的两性螺旋特性，进而影响FtsZ与细胞膜的相互作用。

图 3. FtsZ (wt) 及其突变体FtsZE237A、FtsZE237D、FtsZE237K、FtsZE241A、FtsZE241D、FtsZE241K的膜结合特性分析 Figure 3. The membrane association analysis of FtsZ (wt) and its mutants FtsZE237A, FtsZE237D, FtsZE237K, FtsZE241A, FtsZE241A and FtsZE241K. A: Western blot; B: densitometric analysis of immunoblots. QN23: QN/Plac-yfp::ftsZ; QN24: QN/Plac-yfp::ftsZE237A; QN25: QN/Plac-yfp::ftsZE237D; QN26: QN/Plac-yfp::ftsZE237K; QN27: QN/Plac-yfp::ftsZE241A; QN28: QN/Plac-yfp::ftsZE241D; QN29: QN/Plac-yfp::ftsZE241K; QN: mreB::his6, ftsA::flag, ΔftsZ-Cat.

图选项

2.4 E237和E241位点氨基酸性质改变，影响FtsZ单体间相互作用 为了进一步探索FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体所引起的FtsZ功能和定位模式改变的机制，我们首先构建了C端带his标签的FtsZ及其突变体融合表达质粒pFL15 (P_lac-ftsZ::his₆)、pQN24 (P_lac-ftsZ^E237A::his₆)、pQN25 (P_lac-ftsZ^E237D::his₆)、pQN26 (P_lac-ftsZ^E237K::his₆)、pQN27 (P_lac-ftsZ^E241A::his₆)、pQN28 (P_lac-ftsZ^E241D::his₆) 和pQN29 (P_lac-ftsZ^E241K::his₆)，亲和纯化得到相应的蛋白并定量其浓度。SDS-PAGE电泳分离及考染观察，FtsZ及其定点突变体蛋白的纯度较高 (图 4-A)，Western blot分析也进一步证明相应蛋白的正确性 (图 4-B)。那么FtsZ各定点突变体的聚合特性是否发生改变？我们用聚合缓冲液将纯化的FtsZ/FtsZ*蛋白稀释到6 μmol/L，加入GTP至终浓度1 mmol/L，混匀后室温静止20 min。分别取相同体积的混合液进行非变性凝胶电泳分离和Western blot分析，结果显示：野生型FtsZ与FtsZ^E237D和FtsZ^E241D突变体主条带非常相似，但FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体与野生型FtsZ明显不同，所有4个突变体Western blot结果皆未显示FtsZ最大分子量的聚合体 (如条带1)，而且中等分子量大小的聚合体明显减少 (如条带2)，分子量最小的聚合体较野生型FtsZ显著增加 (图 4-C条带4)，提示E237和E241突变为极性不同的氨基酸，可改变单体的聚合特性，尤其是进一步聚合成较大分子的聚合体特性。

图 4. 表达纯化的FtsZ (wt) 及其突变体蛋白电泳分离和Western blot分析 Figure 4. Separation of the purified FtsZ (wt) and its mutants protein on SDS-PAGE/native PAGE and Western blot analysis. A: Coomassie staining; B: Western blot analysis after separated on SDS-PAGE; C: Western blot analysis after separated on native PAGE; 1-4: Different molecular weight polymerization of FtsZ/FtsZ*.

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为了验证E237A、E237K、E241A和E241K位点突变所引起的单体聚合特性的变化，我们将纯化的FtsZ (wt) 和FtsZ^E237A、FtsZ^E237D、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A、FtsZ^E241D、FtsZ^E241K蛋白室温聚合反应20 min后超速离心 (100000×g，10 min)，分别取相同体积的上清 (Supernatant，S) 和沉淀 (Pellet，P) 进行Western blot分析，显示结果与非变性胶分析结果一致。聚合反应20 min后，野生型FtsZ和FtsZ^E237D及FtsZ^E241D突变体蛋白大部分可形成聚合体存在于离心沉淀中，FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体只有小部分发生集合 (图 5)。

图 5. FtsZ (wt) 及其突变体蛋白的体外聚合分析 Figure 5. In vitro polymerization analysis of FtsZ (wt) and its mutants.-: absent of GTP; +: present of GTP.

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2.5 E237和E241是影响FtsZ-FtsA相互作用的重要氨基酸 以YFP::FtsZ/FtsZ*为靶分子，使用抗Yfp抗体和免疫共沉淀试剂盒 (cat#46147，Thermo) 进行分析发现，将E237和E241突变为性质不同的氨基酸后，与YFP::FtsZ-FtsA相互作用相比较，YFP::FtsZ^E237A、YFP::FtsZ^E237K、YFP::FtsZ^E241A和YFP::FtsZ^E241K突变体与FtsA相互作用明显减弱，YFP::FtsZ^E237D和YFP::FtsZ^E241D突变体与FtsA相互作用基本没有变化 (图 6)。

图 6. FtsZ及其位点突变体与FtsA相互作用的免疫共沉淀分析 Figure 6. Co-immunoprecipitation analysis of FtsZ/FtsZ*-FtsA interaction. PE: protein extract; FT: flow through; IP: immunoprecipitate; QN23: QN/Plac-yfp::ftsZ; QN24: QN/Plac-yfp::ftsZE237A; QN25: QN/Plac-yfp::ftsZE237D; QN26: QN/Plac-yfp::ftsZE237K; QN27: QN/Plac-yfp::ftsZE241A; QN28: QN/Plac-yfp::ftsZE241D; QN29: QN/Plac-yfp::ftsZE241K; QN: mreB::his6, ftsA::flag, ΔftsZ-Cat.

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为了证实上述免疫共沉淀结果，我们用表达纯化的FtsA蛋白为诱饵 (bait) 蛋白，经SDS-PAGE胶电泳分离、转膜和复性后，通过Far western blot分析发现，QN25和QN28细菌裂解液与复性转印膜孵育所得的Western blot分析结果与QN23相似，即FtsZ^E237D/FtsZ^E241D-FtsA相互作用与FtsZ-FtsA相比没有变化；FtsZ^E237A、FtsZ^E237K、FtsZ^E241A和FtsZ^E241K突变体与FtsA相互作用明显减弱，显示E237A、E237K、E241A和E241K位点突变致FtsZ-FtsA相互作用降低 (图 7)。

图 7. FtsZ及其突变体与FtsA相互作用的Far western blot分析 Figure 7. Far western blot analysis of FtsZ/FtsZ*-FtsA interaction. QN23: QN/Plac-yfp::ftsZ; QN24: QN/Plac-yfp::ftsZE237A; QN25: QN/Plac-yfp::ftsZE237D; QN26: QN/Plac-yfp::ftsZE237K; QN27: QN/Plac-yfp::ftsZE241A; QN28: QN/Plac-yfp::ftsZE241D; QN29: QN/Plac-yfp::ftsZE241K; QN: mreB::his6; ftsA::flag; △ftsZ-Cat.

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3 讨论 近年来，随着临床多种耐药菌的出现，寻找新的药物靶点，开发新一代抗菌药物已迫在眉睫。FtsZ是微管蛋白的原核类似物，因其在多种致病菌中高度保守，且是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、结核分枝杆菌、幽门螺旋杆菌等多种致病菌分裂所必需蛋白，现已成为生命科学新的研究热点。FtsZ单体在菌体内通过纵向相互作用形成原丝，进一步组装形成微丝，再在多种蛋白如FtsA、zipA、FtsK等的协调下形成束状结构，最后在即将分裂的菌体中部形成Z环和分离体 (divisome)，指导细菌的分裂。目前关于FtsZ组装的具体分子机制还未完全清楚，主要体现在影响FtsZ单体间相互作用和FtsZ三维结构的重要氨基酸未完全阐明，尤其是影响FtsZ侧面组装的关键氨基酸，这一定程度上限制了以FtsZ的局部结构域为靶点进行新的抗菌药物筛选。
Strauss MP等研究发现，蛋白局部区域的两性螺旋属性是目标蛋白的重要结构，当这种结构被破坏后，蛋白的组装和/或功能将受到严重影响^[23-24]，如FtsA (406-420) 区域和我们前期研究中发现的RNaseⅡ (3-19) 区域^[17]。我们通过对E. coli FtsZ三维结构进行分析发现，FtsZ (236-245) 区域位于FtsZ蛋白的外侧 (图 1-A)，轮状图分析该区域具有两性螺旋特性 (图 1-B)；Stricker等发现，位于同一区域的S245P突变体可致菌体异常分裂和FtsZ的异常组装^[13]，推测参入该区域两性螺旋形成的氨基酸可能是影响FtsZ组装和功能的重要氨基酸。我们将位于两性螺旋同一极性面的E273和E241突变为性质不同的氨基酸，显示FtsZ^E237A/K和FtsZ^E241A/K突变体的功能活性明显降低 (图 1-C、D)；膜蛋白分离及Western blot分析发现，将E237和E241突变为A (丙氨酸) 时，FtsZ的膜结合特性增强，E237和E241突变为碱性氨基酸K (赖氨酸) 时，其对应的突变体膜结合能力降低 (图 3)，提示E237和E241是FtsZ (236-241) 结构域的关键氨基酸，其极性改变可导致该结构域的两性螺旋特性改变，进而影响FtsZ的膜结合特性。虽然到目前为止，人们对FtsZ的氨基酸序列进行分析，没有发现其能与细胞膜直接结合的特异结构域，但FtsZ与细胞膜相互作用已有多个实验支持，且该相互作用是其在菌体内正确组装和形成功能性Z环的重要基础^[23-25]。本研究结果目前虽然不能区分E237和E241是影响FtsZ与细胞膜的直接相互作用还是间接相互作用，但我们首次确认E237和E241是能影响FtsZ (236-245) 区域结构及FtsZ与细胞膜相互作用和FtsZ功能的重要氨基酸，这一发现对以该区域为靶点设计小分子药物具有一定的指导意义。
FtsZ^E237A/K和FtsZ^E241A/K突变体不能在菌体的中部形成规则的Z环，且细胞多数呈长丝状 (图 2-B、D、E、G)，提示E237A/K和E241A/K突变可致FtsZ单体异常组装，进而影响菌体的正常分裂。为了进一步探索这些突变体异常组装的分子机制，我们尝试通过体外实验检测E237A/K和E241A/K位点突变是否改变了单体形成聚合体的特性。首先构建带his标签的各突变体融合表达质粒，通过亲和纯化得到相应的目标蛋白；非变性胶电泳分离和Western blot分析发现，与野生型FtsZ相比，将E237和E241突变为性质相同的氨基酸，FtsZ的聚合特性没有发生明显的改变，而E237A/K和E241A/K位点突变，可导致相应的突变体不能形成较大分子的聚合体 (图 4)。体外聚合分析也进一步证实了上述实验结果 (图 5)。
Loose M和Pichoff S等报道，FtsA和ZipA等蛋白通过与FtsZ C端的结构域相互作用，可将FtsZ附着在细胞的内膜，影响FtsZ组装成功能性Z环及Z环的稳定，进而影响细菌的分裂^{[12, 25]}。E237A/K和E241A/K位点突变可致FtsZ-FtsA相互作用明显降低 (图 6)，且Far western blot也得到相似的结果 (图 7)。那么，并不位于FtsZ C端的E237和E241为何能影响FtsZ-FtsA的相互作用呢？我们推测：(1) FtsZ的C端虽然是与FtsA相互作用的重要结构域，但这种相互作用需要蛋白具有一定的空间构象。将E237和E241突变为性质不同的氨基酸，可能改变FtsZ某一些区域的空间结构，从而对FtsZ和FtsA的相互作用产生一定的空间位阻；(2) FtsZ-FtsA相互作用需要FtsZ与细胞膜的适度相互作用辅助，这种适度相互作用可能影响FtsZ单体的折叠和C端结构域的充分暴露。具体机制还在进一步探索中。
本研究首次发现，FtsZ (237-245) 结构域的两性螺旋特性是FtsZ正确组装和FtsZ-FtsA相互作用的重要基础；E237和E241是影响FtsZ (237-245) 结构域两性螺旋特性的重要氨基酸。虽然，我们的结果目前还不能有效地区别E237A/K和E241A/K位点突变所致的FtsZ膜结合特性及FtsZ-FtsA相互作用的改变何者是影响FtsZ组装和功能的重要原因，但相关机制的进一步探索和揭示，将有助于加深对FtsZ组装的理解和对FtsZ作为新的抗菌药物靶点的开发和利用。

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