几株新鞘氨醇杆菌的趋化性及其相关基因组成特点
廖晓敬, 杨璐溪, Hetharua Buce, 周梦凯, 郑天凌, 田蕴
厦门大学滨海湿地生态系统教育部重点实验室, 生命科学学院, 福建 厦门 361102

收稿日期：2016-07-05；修回日期：2016-11-05；网络出版日期：2016-11-29
基金项目：国家自然科学基金（41376117）；福建省自然科学基金（2013J01143）

_*通信作者：田蕴, Tel/Fax:+86-592-2184528;E-mail:tianyun@xmu.edu.cn


摘要： [目的]选择了几株隶属于新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）的有和没有多环芳烃（PAHs）降解能力的细菌，在基因组水平比较分析它们的趋化通路，并探究其中一些菌株对芳香化合物和三羧酸（TCA）循环中间代谢产物的趋化性。[方法]通过基因组的比较分析，研究了几株新鞘氨醇杆菌的趋化蛋白组成和趋化基因分布，并采用滴定法和游动平板法检测了相关菌对芳香族化合物和TCA循环中间代谢产物的趋化性。[结果]N. pentaromativorans US6-1、N. pentaromativorans F2、Novosphingobium indicum K13、Novosphingobium stygium DSM 12445、Novosphingobium sp.C2AC等5株新鞘氨醇杆菌对芳香族化合物和TCA循环中间代谢物具有不同程度的趋化性；所选的7株已完成基因组测序的新鞘氨醇杆菌N. pentaromativorans F2、N. pentaromativorans US6-1、Novosphingobium sp.PP1Y、Novosphingobium sp.AP12、Novosphingobium sp.Rr 2-17，Novosphingobium sp.B-7和Novosphingobium sp.DSM 19370均含有趋化蛋白MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY，且亲缘关系最近的US6-1、F2和PP1Y 3株菌的che基因簇中的基因排列一致，为cheW-Y-D-B-R-A-（X）；新鞘氨醇杆菌的趋化系统属Fla类型。[结论]几株新鞘氨醇杆菌都具有较为完整的趋化通路，且对多种芳烃及其代谢物的趋化性各不相同，其中菌株US6-1趋化现象最明显。
关键词： 趋化性 新鞘氨醇杆菌 趋化蛋白 芳烃化合物
Chemotaxis and characteristics of chemotactic genes in Novosphingobium strains
Xiaojing Liao, Luxi Yang, Hetharua Buce, Mengkai Zhou, Tianling Zheng, Yun Tian
Key Laboratory of the Ministry of Education for Coastal and Wetland Ecosystems, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian Province, China

Received 05 July 2016; Revised 05 November 2016; Published online 29 November 2016
_*Corresponding author: Yun Tian, Tel/Fax:+86-592-2184528;E-mail:tianyun@xmu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41376117) and by the Natural Science Foundation of Fujian Province of China (2013J01143)

Abstract: [Objective]The present study aims to analyze the chemotaxis genes and proteins of several PAH-degrading Novosphingobium strains, and the chemotaxis of these strains toward aromatic compounds and intermediates.[Methods]Based on genome comparative analysis, we identified the chemotaxis genes organization and proteins distribution. We used drop and swarm plate assays to detect the chemotaxis of these strains toward aromatic compounds and intermediates of TCA cycle.[Results]We found that all these Novosphingobium strains showed chemotaxis, but the chemotatic ability varied. The completed genome sequenced strains N. pentaromativorans F2, N. pentaromativorans US6-1, N. pentaromativorans PP1Y, Novosphingobium sp. AP12, Novosphingobium sp. Rr 2-17, and Novosphingobium nitrogenifigens DSM 19370 contained MCP, CheW, CheA, CheB, CheR and CheY. Strain F2, US6-1 and PP1Y, shared a consistent order of chemotaxis genes in "che" cluster. The chemotatic system of these Novosphingobium strains belonged to the Fla chemotactic system.[Conclusion]These strains all contained a complete chmotaxis pathway. Their chemotactic ability toward aromatic compounds and intermediates varied, and the chemotaxis of US6-1 was obvious.
Key words: chemotaxis Novosphingobium chemotactic protein aromatic compounds
细菌趋化性 (chemotaxis) 是指有运动能力的细菌对有利环境的趋附 (正趋化) 和对有害环境的避离 (负趋化)，此行为是通过感应环境信号和调整鞭毛旋转方向获得。在大多数情况下，趋化物 (chemoattractant) 能作为细菌的碳源和能源。由于细菌代谢的多样性和复杂性，细菌对环境中的多种异生物质都有趋化性，包括多环芳烃等环境污染物。近年来关于细菌对环境异生污染物的趋化性研究越来越受到关注^[1-3]，已分离并鉴定了多种对环境有毒污染物具有趋化性的微生物，如Pseudomonas^[4-7]、Azospirillum^[8]、Burkholderia^[9]、Agrobacterium^[10]、Bradyrhizobium^[11]、Ralstonia^[12-13]和Comamonas^[14]等属的微生物。有毒趋化物种类繁多，从结构简单的芳香族化合物到复杂的硝基、氯代芳香族化合物，包含了绝大部分有机污染物^[12]。
二元信号系统 (TCS) 是细菌完成趋化功能的主要途径，TCS由跨膜分布且具有专一性的膜传感蛋白和胞质内调节蛋白组成：膜传感蛋白负责感受化学效应物刺激，胞质内调节蛋白将膜传感蛋白所接受的化学刺激转变成有效的鞭毛运动信号，进而产生相对应的趋化性运动。TCS在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌中研究的比较透彻。它们的趋化TCS跨膜传感器信号受体是甲基受体趋化蛋白 (methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs)，胞质内调节蛋白有组氨酸激酶CheA、偶联蛋白CheW和多种调节蛋白CheY/B/R等。细菌的一般趋化模型包括MCP、CheW、CheA、CheY和鞭毛相关蛋白。这些是趋化性细菌必备的核心组分，CheB和CheR几乎存在于所有趋化性细菌中，而CheZ、CheC、CheX、CheV和CheD等是趋化性细菌可能存在的组分。这些趋化蛋白根据其功能可分为4组：信号识别和转导组、应激反应组、适应组和信号移除组 (使CheY-P去磷酸化)。信号识别和转导组包含感受器和配体绑定蛋白，应激蛋白为CheA和CheY，适应蛋白改变CheA的活性，重置体系，信号移除蛋白确保CheY-P水平能够随外界刺激快速调节。
新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium) 普遍具有降解芳烃 (芳香族) 化合物的特性^[15-21]，是良好的芳烃污染环境的生物修复菌，但关于该属细菌对典型有机污染物趋化性的研究尚未见报道。为了了解该属细菌对其降解的芳香族化合物是否也具有趋化性，本论文以新鞘氨醇杆菌属细菌为研究对象，进行以下研究：(1) 对N. pentaromativorans US6-1和N. pentaromativorans F2及其他几株新鞘氨醇杆菌的趋化基因和趋化蛋白进行比较分析；(2) 检测6株新鞘氨醇杆菌对TCA循环中间产物和芳烃化合物的趋化性，以初步探究新鞘氨醇杆菌属细菌的趋化特性。
1 材料和方法 1.1 实验菌株 菌株Novosphingobium pentaromativorans US6-1由韩国海洋研究院惠赠，是1株筛选自Ulsan海湾 (韩国) 沉积物的革兰氏染色阴性菌，嗜盐，菌落呈黄色，能广谱和高效地降解2环至5环的PAHs^[18]；菌株N. pentaromativorans F2为本实验室分离自红树林湿地沉积物的多环芳烃降解菌，可降解2-4环PAHs^[22]；菌株Novosphingobium sp. C2AC，N. stygium DSM 12445和N. indicum K13为石油降解菌，由中国海洋微生物菌种保藏中心 (MCCC) 提供。
1.2 培养基 2216E培养基 (g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，磷酸高铁0.01，陈海水750 mL，蒸馏水250 mL，pH 7.2。无机盐液体培养基 (MM2)：(NH₄)₂SO₄ 18 mmol/L，FeSO₄·7H₂O 1 μmol/L，KH₂PO₄/Na₂PO₄100 μmol/L，陈海水750 mL，蒸馏水250 mL，pH 7.2。
趋化缓冲液：K₂HPO₄·3H₂O 0.696 g，KH₂PO₄0.2654 g，EDTA 20 μmol/L，蒸馏水500 mL。
1.3 趋化性实验
1.3.1 菌体收集: 从冻存管中吸取500 μL菌液接种至50 mL的2216E液体培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床培养36 h后转接，同样培养36 h，菌液经6000 r/min离心8 min收集菌体。趋化缓冲液重悬洗涤，离心，反复3次，最后重悬至一定浓度。:
1.3.2 滴定法 (Drop assay): 对于结构式较简单的化合物 (单环化合物和TCA循环中间物) 采用滴定平板法检测实验菌株对其趋化性反应。: MM2作为趋化性缓冲液，含0.18%的琼脂，待MM2缓冲液冷却至40 ℃左右时加入菌液至OD₆₀₀=0.6后立刻倒平板，待平板冷却后在平板中央加待测物 (加10 μL 200 mmol/L溶于水的化合物，不溶或微溶的化合物加固体于平板中央)，最后，将所有平板放于28 ℃培养箱培养，3 h后开始观察拍照。:
1.3.3 游动平板法 (Swarm plate assay): 对于2环及以上的芳烃化合物 (1-羟基-2-萘甲酸、萘、菲、芘和苯并芘) 采用游动平板法检测菌株的趋化性反应。: CHE Buffer (6.1 mmol/L K₂HPO₄、3.9 mmol/L KH₂PO₄、20 μmol/L EDTA pH 7.0) 为趋化缓冲液，含0.18%的琼脂；以上芳烃化合物先用CHE Buffer溶解1周以上至饱和溶解度，再取水溶液用含0.18%琼脂的CHE Buffer稀释400倍倒平板，待凝固成半固体后于平板中央加8 μL菌液 (OD₆₀₀约为20)，置于28 ℃培养箱培养，定期观察拍照。: 1.4 新鞘氨醇杆菌的趋化基因及其编码蛋白的比较分析 在NCBI中搜索已完成全基因组测序的新鞘氨醇杆菌属的菌株，包括：Novosphingobium sp. PP1Y (NC_015580.1)^[23]，Novosphingobium sp. AP12 (NZ_AKKE00000000.1)^[24-25]，Novosphingobium sp. Rr2-17 (NZ_AKFJ00000000.1)^[24]，Novosphingobium sp. B-7 (NZ_APCQ00000000.1)^[26]，Novosphingobium sp. DSM19370 (NZ_AQWK00000000.1)^[27]。将以上5株新鞘氨醇杆菌属细菌的全基因组信息与具有PAHs降解能力的N. pentaromativorans US6-1和N. pentaromativorans F2进行趋化基因分布的对比分析，同时分析这7株菌及典型趋化性细菌E. coli和Bacillus属细菌的趋化蛋白组成并进行对比，用MiST (http://mistdb.com/) 数据库对核心趋化蛋白CheA的域结构可视化并进行分析。
2 结果和分析 2.1 新鞘氨醇杆菌中趋化蛋白的组成 新鞘氨醇杆菌属中已测序的F2、US6-1、PP1Y、Rr 2-17、AP12、B-7和DSM 19370等7株菌及典型趋化性细菌Escherichia coli 042和Bacillus amyloliquefaciens CC178的趋化蛋白的组成情况，如表 1所示，它们均含有MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY，而且MCP的数量均较多，新鞘氨醇杆菌的趋化蛋白的组成与Bacillus属细菌比较相似，均含CheD (除AP12外) 和CheC/X (除F2和PP1Y外)，而E. coli不含CheD，且用CheZ替代了CheC/X的功能，CheC、CheX和CheZ都是CheY磷酸酶，因此从近缘角度来说，新鞘氨醇杆菌的趋化机制相对更靠近Bacillus细菌，另外Bacillus细菌还含有CheV，CheV是一种偶联和适应蛋白，由CheW和反应调节接收区融合而成，兼具有CheW偶联MCP和CheA的功能，其反应调节区也能被磷酸化，并在适应阶段起作用。菌株Rr 2-17和DSM 19370趋化蛋白数量多且每种关键的趋化蛋白的数量都在2个以上，暗示其趋化系统更复杂，可能有多个趋化系统。
表 1. 几株新鞘氨醇杆菌、E. coli和Bacillus属细菌中趋化相关蛋白的组成 Table 1. Composition of chemotaxis related proteins in Novosphingobium bacteria, E. coli and Bacillus bacteria

Strain	Size/Mb	MCP	CheW	CheA	CheR	CheB	CheCX	CheY	CheD	CheZ	CheV	Total
US6-1	5.34	7	1	1	2	2	1	1	1			16
F2	5.12	5	1	1	2	2		2	1			14
PP1Y	5.31	6	1	1	2	3		2	1			16
Rr 2-17	4.54	9	4	3	5	5	1	2	1			30
AP12	5.61	1	1	1	2	2	1	1				9
B-7	4.91	7	4	1	2	2		18	1			35
DSM 19370	4.15	9	2	2	2	3		15	1			34
E.coli 042	5.36	5	1	1	1	1		1		1		11
Bacillus amyloliquefaciens CC178	3.80	8	1	1	1	1	1	1	1		1	16

表选项






2.2 新鞘氨醇杆菌中趋化基因的分布 分析了N. pentaromativorans US6-1、N. pentaromativorans F2及其它几株已测序的新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp. PP1Y、Novosphingobium sp. AP12和Novosphingobium sp. Rr2-17) 的趋化基因，并就其排列方式绘制了趋化基因位置图。如图 1所示，它们的主要趋化基因均紧密相连形成che基因簇，组成1条完整的趋化通路，除Novosphingobium sp. Rr2-17外的其它新鞘氨醇杆菌均只有1个che基因簇，它们可能是趋化操纵子，其中N. pentaromativorans US6-1的che基因簇已经链特异性转录组测序证实其为趋化操纵子 (数据另刊发表)。比较可发现具有PAHs降解能力的菌株US6-1、F2和PP1Y的che基因簇中基因排列顺序一致，均是cheW-Y-D-B-R-A，基因簇大小也基本一致，已知原核生物中基因顺序不保守，因此该3株菌的趋化基因顺序保守的特点也反映出它们的亲缘关系较近，只是菌株US6-1和F2的在负链上，而菌株PP1Y的在正链上；而菌株AP12和Rr 2-17的趋化基因排列顺序与菌株US6-1和F2不同，但它们的趋化蛋白均由负链编码，其中菌株Rr 2-17有3个che基因簇 (che1，che2，che3)，菌株AP12和Rr 2-17的che1是以cheC-Y-A-R-B-W-mcp序列排列，且各基因大小基本相同，che2和che3基因簇上没有cheD而含cheC和mcp。菌株Rr2-17的趋化基因簇che3仅4个趋化核心基因。

图 1. 几株新鞘氨醇杆菌的趋化基因排列顺序 Figure 1. Chemotaxis gene orders in Novosphingobium strains. A: US6-1; B: F2; C: PP1Y; D: AP12; E: Rr2-17.

图选项

2.3 核心趋化蛋白CheA结构比较与分类 Wuichet和Zhulin^[23]分析了245个趋化系统并将趋化系统分为3类：调节鞭毛运动性的 (Fla)，涉及Tfp-based运动性的 (Tfp) 和可选择性的 (非运动性) 细胞功能 (ACF)。本文用MiST对已测序的不同种属细菌的CheA的域结构进行分析，部分展示于图 2，发现Fla、Tfp和ACF 3类趋化系统中的CheA的域结构有明显差异：Fla类趋化系统的CheA包含Hpt、Hinase_dim、HK CA:Che和CheW 4个结构域，Tfp类趋化系统的CheA包含Hpt、HK CA:Che、CheW和RR 4个结构域且含多个Hpt (一般4个以上)，而ACF类趋化系统的CheA包含Hpt、HK CA:Che、CheW和RR 4个结构域。从图 2中还可以发现，Fla类趋化系统的CheA的域结构在不同属细菌中有些不同，目前技术分析下的大部分细菌仅包含Hpt、Hinase_dim、HK CA:Che和CheW 4个结构域，但是Bacillus细菌的CheA在Hpt和Hinase_dim之间还含1个P2结构域，Nocardioides的CheA含2个CheW，E. coli、Burkholderia和Bordetella的CheA在Hpt和Hinase_dim之间还含1个CheY-binding结构域。本文研究的几株新鞘氨醇杆菌趋化蛋白CheA均属于Fla类趋化系统CheA类型，说明新鞘氨醇杆菌的趋化系统属于Fla类。

图 2. 三类趋化系统中的CheA的域结构 Figure 2. Domain architecture of CheA in three kinds of chemotaxis system. A: novosphingobium; B:sphingomonas; C: sphingopyxis; D: pseudomonas; E: beijerinckia; F:vibrio; G:agrobacterium; H:zymomonas; I:bordetella; J:E. coli; K:burkholderia; L:bacillus; M:borrelia; N:nocardioides; O:pseudomonas; P:xanthomonas; Q:cellvibrio; R:acinetobacter; S: pseudomonas; T:burkholderia; U:bordetella; V:hahella.

图选项

2.4 新鞘氨醇杆菌对单环芳烃化合物和TCA循环产物的趋化性 对于新鞘氨醇杆菌 (N. pentaromativorans) US6-1和F2、印度洋新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium indicum) K13、冥河新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium stygium) DSM 12445、新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp.) C2AC等5株细菌，采用平板滴定法检测了它们对TCA循环中的7种中间产物和7种单环芳香酸的趋化性，3 h观察拍照，结果如图 3所示，可以发现5株新鞘氨醇杆菌对TCA循环中的7种中间产物和6种单环芳香酸 (除邻苯二酚外) 都具有趋化现象。从图 3中还可发现，同一菌株对不同底物的趋化性有差异，US6-1对琥珀酸、4-羟基苯甲酸和3, 4-二羟基苯甲酸趋化性较弱，对其他化合物都具有较强的趋化性；F2对草酰乙酸、4-羟基苯甲酸和3, 4-二羟基苯甲酸趋化性较弱；而DSM12445的趋化性普遍很弱，仅对水杨酸和邻苯二甲酸有较强的趋化性，且对邻苯二酚无趋化反应；K13和C2AC对琥珀酸、苯甲酸、4-羟基苯甲酸和3, 4-二羟基苯甲酸趋化性较弱，且C2AC对邻苯二酚无趋化反应。此外，不同细菌对同一化合物的趋化性也不同：一是强弱的差异，如仅F2对琥珀酸有较强的趋化性，其他细菌对琥珀酸的趋化性都很弱；再者是有无的差异，US6-1、F2和K13对邻苯二酚有明显的趋化性，但是DSM12445和C2AC对邻苯二酚无趋化反应。

图 3. 新鞘氨醇杆菌对单环芳烃化合物和TCA循环中间产物的趋化现象 Figure 3. Chemotaxis phenomenon to monolycyclic aromatic hydrocarbons compound and TCA cycle intermediate metabolites by Novosphingobium strains.

图选项

2.5 Novosphingobium细菌对多环芳烃化合物的趋化性 采用游动平板法检测以上5株新鞘氨醇杆菌对1-羟基-2-萘甲酸 (1-hydroxy-2-naphthoate)、萘 (naphthalene)、菲 (phenanthrene)、芘 (pyrene) 和苯并芘 (benz (a) pyrene) 等5种多环芳烃化合物的趋化性，定期观察拍照，结果如图 4，发现它们对多环芳烃化合物的趋化差异较大。除降解石油和柴油等烷烃类物质的Novosphingobium indicum K13和Novosphingobium sp. C2AC对被测的5种多环芳烃均无反应外，其他3株新鞘氨醇杆菌对被测物基本上都有反应，并且随着苯环数的增加，趋化反应也变慢。对萘和1-羟基-2-萘甲酸1 d后开始有反应，而对菲、芘和苯并芘均在4 d以后才开始有反应，其中未观察菌株F2对苯并芘的趋化现象，对芘的趋化反应也相对较弱；N. pentaromativorans US6-1对多环芳烃的趋化性最明显，暗示了细菌趋化性可能与其对PAHs的降解能力有关。

图 4. 新鞘氨醇杆菌对多环芳烃化合物的趋化现象 Figure 4. Chemotaxis phenomenon to pololycyclic aromatic hydrocarbons compound by Novosphingobium strains.

图选项

3 讨论 近几十年来，科研工作者证实了环境中的大部分芳香族污染物可以被微生物降解，系统地研究了微生物降解芳香族化合物的基因、代谢途径和调控手段，然而微生物对芳香族污染物的修复能否最终实现，不仅仅依赖于其降解能力本身，还依赖于污染物的生物可利用性，因为芳香族有机污染物特别是多环芳烃类疏水性高，水溶性极低，因此在微生物降解该类污染物之前必须要有效地感应吸收它。研究发现一些污染物降解菌如Pseudomonas putida G7 (萘降解菌)、Pseudomonas putida RKJ1 (萘和水杨酸降解菌) 和Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4对萘均有趋化行为^[5-7]。趋化性是细菌适应外界化学环境变化而作出的行为反应，是一种寻找碳源和能源的优势。
本研究中的物种进化分析表明，具有PAHs降解功能的新鞘氨醇杆菌F2、PP1Y和US6-1亲缘关系非常近，基因组大小均在5 Mb以上。对三者的趋化基因进行分析，发现它们均存在1个趋化基因簇 (che簇)，猜测是1个趋化操纵子 (菌株US6-1已经在链特异转录组中预测到此操纵子)，能够起实际趋化性功能，且其上的趋化基因排列顺序一致。另外几个新鞘氨醇杆菌如AP12和Rr 2-17也至少存在1个che簇，只是趋化基因的排列方式不同于前三者。Samanta等的研究^[6]证实在萘降解菌P. putida RKJ1中，位于83 kb质粒上的25 kb的EcoR I片段编码了萘的降解基因和趋化基因，但是本研究中我们未发现新鞘氨醇杆菌的降解相关基因与趋化基因排列在一起，暗示新鞘氨醇杆菌的趋化性与降解功能的调节机制与P. putida RKJ1不一样，可能受远距离调控因子调节。
MCPs、CheA、CheW和CheY普遍存在于趋化性原核生物中，并代表了中心趋化系统的核心部分。Wuichet和Zhulin^[23]分析发现的245个编码趋化蛋白的基因组中，仅7个缺失编码MCPs、CheA或CheW的基因，其中4个缺失CheA的基因组没有预测到它们形成功能性的趋化系统，说明CheA是具备实际趋化性功能所必需的。本研究对新鞘氨醇杆菌的趋化蛋白的组成与典型的趋化细菌E. coli和Bacillus属细菌进行了比较，结果发现7株新鞘氨醇杆菌均含有MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY。新鞘氨醇杆菌的趋化性蛋白的组成与Bacillus细菌比较相似，均含CheD (除AP12外) 和CheC (US6-1、F2和PP1Y中未发现)，Bacillus细菌的趋化受体MCP必须先经CheD脱酰基才能有效地将信号传递给CheA^[28]，可能新鞘氨醇杆菌也有这一类似机制；CheC为CheY磷酸酶，在信号移除阶段起作用，存在于大部分趋化生物中。F2和PP1Y中含有鞭毛马达开关蛋白FliY，也是一种CheY磷酸酶，N端与CheC同源，均能使磷酸化的CheY水解，有着CheC的相似功能^[1]，猜测F2和PP1Y是用鞭毛马达开关蛋白FliY代替CheC功能的。而E. coli不含CheD，且用CheZ替代CheC的功能。CheZ蛋白也是CheY磷酸酶，在β-和γ-变形杆菌中广泛存在，它在序列上与CheC和FliY无同源性。因此从近缘角度新鞘氨醇杆菌的趋化机制相对更靠近Bacillus细菌。另外，Bacillus细菌还含有一种偶联和适应蛋白CheV，由CheW和反应调节接收区融合而成，兼具有CheW偶联MCP和CheA的功能，其反应调节区也能被磷酸化在适应阶段起作用^[1]。趋化系统CheV取代CheW的现象在L. monocytogenes中被证实是有实际功效的^[29]。菌株H. pylori中缺少CheR和CheB，用CheV代替，在适应阶段起调节作用^[30]。
从蛋白组分上也可以看出E. coli的每种Che蛋白均只有1个，它的趋化系统最简单。菌株Rr 2-17和DSM 19370趋化蛋白数量多且关键的趋化蛋白每种基本上都在2个以上，暗示其趋化系统更复杂，图 2也表明了菌株Rr 2-17有3个趋化基因簇，说明Novosphingobium sp. Rr 2-17有多个趋化通路。之前也有报道过一些生物具有多个复杂的趋化系统，如Porter等^[31]发现R. sphaeroides含有3个趋化通路系统，其中2个趋化操纵子cheOp2和cheOp3分别由polar chemotaxis cluster和cytoplasmic chemotaxis cluster组成，cheOp2和cheOp3上编码的大部分趋化蛋白是该菌表现正常趋化性所必需的；另外Myxococcusxanthus、Caulobactercrescentus、Pseudomonasaeruginosa、Rhodobacter sphaeroides和Sinorhizobium meliloti也均含2个或2个以上的趋化通路系统^[32]。
Wuichet和Zhulin^[23]分析了245个趋化系统并将趋化系统分为3类：调节鞭毛运动性的 (Fla)，涉及Tfp-based运动性的 (Tfp) 和可选择性的 (非运动性) 细胞功能 (ACF)。本论文就这些趋化系统的关键核心蛋白CheA激酶的域结构进行了分析，发现Fla、Tfp和ACF 3类趋化系统中的CheA的域结构有明显差异，这3类趋化系统中的CheA的域结构均有自己的特点，我们研究的新鞘氨醇杆菌的趋化蛋白CheA均属于Fla类趋化系统CheA类型，表明新鞘氨醇杆菌的趋化系统属Fla类型。
新鞘氨醇杆菌属是新近发现的一类广泛存在于海洋环境中的革兰氏阴性菌，该属细菌能够降解多种芳香族化合物，例如甲苯、胺基苯、硝基苯、氯苯、2-5环的PAHs等^[23-24]。新鞘氨醇杆菌属 (Novosphingobium) 和鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas) 菌株都归属于Sphingomonadaceae，许多降解异生污染物的细菌均为这2个菌属的菌株^[25-27]。本文研究了5株新鞘氨醇杆菌对芳香族化合物和TCA循环中间代谢物的趋化性，发现它们均具有趋化性，只是趋化强弱因菌株而异，推测对降解底物的趋化性可能也是新鞘氨醇杆菌这类芳烃降解菌的共同特性。其中PAHs高效降解菌N. pentaromativorans US6-1对所有待测化合物都具有趋化反应，且相比于其他菌株，它的趋化性是最强的。降解石油和柴油等烷烃类物质的Novosphingobium indicum K13和Novosphingobium sp. C2AC对1-羟基-2-萘甲酸、萘、菲、芘和苯并芘等芳香烃类化合物均无反应，由此推测新鞘氨醇杆菌的趋化性可能属于代谢依赖型。
4 结论 对所选的几株新鞘氨醇杆菌的趋化基因进行分析发现，它们均至少含1个che簇，能够形成完整的趋化通路，其中具有PAHs降解功能的菌株F2、PP1Y和US6-1的che簇中趋化基因排列顺序一致，与亲缘关系稍远的菌株AP12和Rr 2-17的趋化基因排列不同，验证了它们之间的亲缘关系。菌株Rr 2-17有3个趋化基因簇，它的趋化系统较复杂。几株新鞘氨醇杆菌均含有MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY，趋化蛋白组成上与Bacillus细菌较相似，与E. coli差别较大，趋化系统属Fla类型。鉴于趋化系统的关键核心蛋白CheA的HATPase_c和CheW 2个结构域高度保守，cheA可以作为趋化性细菌的候选生物标记物，用于检测环境中的趋化细菌。几株新鞘氨醇杆菌具有趋化性的共同特性，且菌株US6-1的趋化性可能属于代谢依赖型，具有PAHs降解功能的新鞘氨醇杆菌的趋化性与降解性之间的关联有待进一步深入研究。

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