,, 王文君, 付明, 徐国强, 周翔, 刘榜,华中农业大学动物科学技术学院,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,武汉 430070A multiplex PCR method based on nuclear and cytoplasmic inheritance to identify the horse and donkey-derived components of Asini Colla Corii and the hide
Yang Shen,, Wenjun Wang, Ming Fu, Guoqiang Xu, Xiang Zhou, Bang Liu,Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China通讯作者: 刘榜，教授，博士生导师，研究方向：动物分子生物学与育种。E-mail:liubang@mail.hzau.edu.cn
编委: 赵方庆
收稿日期:2020-04-20修回日期:2020-07-10网络出版日期:2020-10-20
| 基金资助: |
Received:2020-04-20Revised:2020-07-10Online:2020-10-20
| Fund supported: |
作者简介 About authors
谌阳,在读硕士研究生,专业方向：动物分子生物学与种源检测。E-mail:
摘要
阿胶(Asini Colla Corii)及其原料皮张源性成分的鉴定是对阿胶真实性的一种保障,阿胶生产企业和市场监管部门急需马、驴、骡皮张以及阿胶中源性成分鉴别的有效检测方法。本研究基于马、驴核基因组和线粒体基因组筛选物种特异性DNA序列作为检测靶标,设计马、驴特异性引物,建立了鉴别马、驴、骡皮张以及鉴定阿胶中马和驴源性成分的多重PCR方法。结果显示,本文所建立的方法可用于阿胶源性成分及皮张种源的鉴别,其特异性强,只在目标物种中扩增出目的条带,而非目标物种中没有任何扩增产物,而且灵敏度能达到0.2 ng,可为阿胶生产企业和市场监管部门提供技术支撑。
关键词：
Abstract
To identify the original components of Asini Colla Corii and its raw material hides provides a guarantee for authenticity of Asini Colla Corii. It is urgent for Asini Colla Corii production enterprises and market supervision departments to develop effective identification methods of Asini Colla Corii and hides derived from horses, donkeys, mules and hinnies. This study screened species-specific DNA sequences of nuclear and mitochondrial genomes as detection targets, designed horse and donkey specific primers and established multiple PCR identification methods for identifying the animal hides (including the horse, donkey, mule and hinny) and Asini Colla Corii containing horse-derived and donkey-derived components. Our method can identify the horse, donkey, mule and hinny hides and horse, donkey-derived components of Asini Colla Corii with high species specificity (no crossed amplification was observed ). The limit of detection was 0.2 ng DNA. The method developed in this study provides technical support for Asini Colla Corii production enterprises and market supervision departments.
Keywords：
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本文引用格式
谌阳, 王文君, 付明, 徐国强, 周翔, 刘榜. 基于核质遗传原理建立多重PCR检测方法鉴定阿胶中马、驴源性成分及皮张种源. 遗传[J], 2020, 42(10): 1028-1035 doi:10.16288/j.yczz.20-108
Yang Shen.
阿胶(Asini Colla Corii)是利用马科动物驴(Equus asinus L.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩而成,自宋代阿胶之名为驴皮独享,记载于宋以后沿用至今。阿胶是亚洲人常用的保健品,需求量逐年增加,但驴皮的数量远不能满足生产的需要。据报道2013年阿胶市场用量约为3500吨,约需驴皮280万张左右,而我国当年驴的出栏量仅237.8万头,无法满足阿胶生产的需求[1]。这种驴皮供不应求的现状,使得驴皮的价格上涨了30多倍[2]。一些不法分子在利益驱使下,用与驴皮相似的马皮和骡皮冒充驴皮销售,以致阿胶中掺入马和骡的成分[3,4],使阿胶功效发生改变,扰乱市场秩序,损害了商家信誉及消费者权益。在市场监管中,急需针对阿胶中马和驴源性成分鉴定及其原料马、驴、骡皮张鉴别的检测方法。
21世纪初期,由于核酸的特异性和稳定性,以核酸为靶标的PCR方法逐渐开始被应用到皮张和阿胶的鉴定中,但多以线粒体DNA为靶标,如基于线粒体细胞色素b基因(Cytb)建立PCR-RFLP方法、半巢式-多重PCR方法进行皮张鉴别和阿胶中源性成分的检测[5,6,7];基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI)的PCR和实时荧光PCR鉴定阿胶中的源性成分[8,9]。目前针对阿胶和皮张鉴别的靶标主要是线粒体DNA,但由于线粒体DNA母系遗传的特点,使其在马、驴和骡种源鉴定方面具有局限性,无法鉴别驴和驴骡、马和马骡。仅有一篇结合线粒体DNA和核基因组靶标,建立实时荧光PCR方法并成功鉴别马、驴、马骡和驴骡皮张的报道[10],但其不涉及阿胶成品的检测。因此,对于阿胶和皮张种源成分的鉴别需要开发新的检测方法。
基于遗传学中核质遗传基本原理：骡的核遗传物质一半来自于马,另一半来自于驴;而细胞质遗传物质——线粒体DNA全部来自于母本,马骡和驴骡的线粒体DNA分别来自于马和驴。据此,本研究利用马、驴、马骡和驴骡在核基因组和线粒体DNA上的差异来筛选特异性靶标,建立马、驴核基因和线粒体基因的多重PCR检测方法,进行马、驴、马骡、驴骡皮张和阿胶中马、驴源性成分的鉴别。
1 材料方法
1.1 样品采集与制备
皮张样品：市场采集马皮(6张)、驴皮(6张)和骡皮(马骡皮2张、驴骡皮1张)。阿胶样品：市场购买驴皮阿胶1份;委托阿胶生产企业按其工艺流程制作了2种骡皮和驴皮混合阿胶、3种未标明原料皮张成分的阿胶样品(含马和驴源性成分)。
1.2 DNA提取
皮张样品DNA提取：马皮、驴皮、马骡皮和驴骡皮按照苯-酚氯仿抽提法提取DNA[11]。阿胶样品DNA提取：取200 mg阿胶样品置于2 mL EP管中,加入1 mL裂解液;阿胶溶解后,加入15 μL 蛋白酶K,56℃消化2 h;在消化好的样品中加入等体积的Tris饱和酚,缓慢颠倒10 min,然后4℃、12,000 r/min离心10 min;移上清液于2 mL EP管中,加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),颠倒混匀10 min,4℃、12,000 r/min离心10 min;移上清液于2 mL EP管中,加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),颠倒混匀10 min,4℃、12,000 r/min离心10 min;移上清液于新的2 mL EP管中,然后利用OMEGA DNA纯化试剂盒进行纯化。
阴性对照DNA样品：大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、仓鼠(Cricetulus griseus)、豚鼠(Cavia porcellus)、普通牛(Bos taurus)、水牛(Bubalus)、绵羊(Ovis orientalis aries)、山羊(Capra)、猪(Sus scrofa)、兔(Oryctolagus cuniculus)、狐(Vulpes)、狗(Canis domesticus)和貉(Nyctereutes)等物种DNA来自实验室前期储备。
1.3 马、驴物种特异核基因与线粒体基因检测靶标筛选与引物设计
首先,在NCBI数据库下载马、驴核基因组和线粒体DNA序列,通过本地BLAST将马、驴基因组序列与其他哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、猪)全基因组序列进行比对,最终筛选出马核基因OBSCN和驴核基因LOC106835644以及马、驴线粒体基因ND2序列;然后应用Bioedit对筛选出的马、驴的DNA序列进行同源性多重比对,并利用NCBI-Primer网站进行引物设计(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast),确保引物的物种内保守性和物种间特异性,并使所设计的引物具有相同的退火温度。引物信息见表1。1.4 马、驴物种特异性PCR扩增体系建立
1.4.1 马、驴物种特异性PCR扩增马、驴核基因和线粒体基因的PCR检测体系均以目标物种马、驴、马骡、驴骡的DNA为检测样品模板,以非目标物种大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、普通牛、水牛、绵羊、山羊、猪、兔、狐、狗、貉的基因组DNA为阴性对照模板。PCR扩增体系：上下游引物各0.2 μmol/L,0.025 U/μL rTaq,0.2 mmol/L dNTP,1× buffer(TaKaRa公司),模板50 ng,用无菌超纯H2O补足到20 μL。扩增程序：95℃预变性3 min;95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,扩增35个循环;72℃终延伸30 s,4℃保存。
1.4.2 马、驴特异性PCR扩增体系灵敏度检测
提取马皮和驴皮基因组DNA,用Nanodrop定量到10 ng/μL,然后10倍梯度稀释(101、100、10-1、10-2、10-3)。取马的稀释模板2 μL用于马核基因和线粒体基因特异性PCR扩增灵敏度检测,同样取2 μL驴的稀释模板检测驴的核基因和线粒体基因特异性PCR扩增灵敏度,即每个浓度梯度对应的DNA量为20 ng、2 ng、0.2 ng、0.02 ng和0.002 ng,按照模板中的DNA量计算灵敏度。除DNA模板外其他试剂用量和扩增程序同1.4.1。
1.4.3 马、驴特异性PCR扩增体系保守性检测
分别以不同个体马皮、驴皮DNA样品为模板检测核基因和线粒体基因特异性PCR扩增的保守性,扩增体系和程序同1.4.1。
1.5 马、驴、骡皮张和阿胶加工品的检测
马、驴核基因二重PCR扩增体系包括Horse-NF、Horse-NR、Donkey-NF和Donkey-NR引物各0.2 μmol/L,0.025 U/μL rTaq,0.2 mmol/L dNTP,1×buffer,模板50 ng,H2O补足到20 μL。扩增程序与PCR特异性检测相同(见1.4.1)。马、驴线粒体基因二重PCR扩增体系包括Horse-MF、Horse-MR、Donkey-MF和Donkey-MR引物各0.2 μmol/L,rTaq、dNTP、1×buffer等试剂用量和扩增程序同1.4.1。
马、驴、骡皮张检测,先利用马、驴核基因二重PCR检测体系对马、驴和骡皮进行鉴别,对鉴别出的骡再采用马、驴线粒体基因二重PCR检测体系区别马骡和驴骡。
阿胶样品的检测,利用上述马、驴核基因二重PCR鉴别阿胶中的源性成分,其中检测的阿胶样品DNA为100 ng,扩增体系与马、驴核基因二重PCR相同,扩增程序同1.4.1。
Table 1
表1
表1扩增马、驴目的基因引物信息
Table 1
| 目的基因 | 引物名称 | 序列(5?→3?) | 目的片段大小(bp) |
|---|---|---|---|
| OBSCN | Horse-NF | CAGGTGAGCCGAGCTGCGCT | 166 |
| Horse-NR | TGGCGCACGCAGTTCGTCCC | ||
| LOC106835644 | Donkey-NF | CTGTCCTGATGGAAGAGAACTTGG | 144 |
| Donkey-NR | GGTGGTGCTGCAAATTCCACTTTA | ||
| ND2 | Horse-MF | AAATCCCCTTATCTTCACAACT | 179 |
| Horse-MR | GAAAATATTTGGTGGAGGCTTC | ||
| ND2 | Donkey-MF | CATCCTACTAACTATAGCCGTG | 130 |
| Donkey-MR | CACTAAGATGGCTGCTATTC |
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2 结果与分析
2.1 马、驴物种特异性PCR扩增体系建立
本研究建立的马和驴核基因、马和驴线粒体基因共4个特异性PCR扩增体系均能特异性地分别在马、驴、马骡、驴骡目标物种中进行扩增,马、驴核基因特异性PCR扩增片段分别为166 bp和144 bp,马、驴线粒体基因特异性PCR扩增片段分别是179 bp和130 bp。空白和阴性对照中无任何扩增产物,说明4个PCR扩增体系都具有特异性(图1)。图1
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图1马、驴物种特异性PCR扩增结果
A：马核基因特异性PCR扩增结果;B：驴核基因特异性PCR扩增结果;C：马线粒体基因特异性PCR扩增结果;D：驴线粒体基因特异性PCR扩增结果。M：DNA Marker;1：空白对照;2：马;3：驴;4：马骡;5：驴骡;6~18：阴性对照(分别是普通牛、水牛、绵羊、山羊、猪、兔、狐、狗、貉、大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠)。
Fig. 1Results of horse and donkey species-specific PCR amplification
将马和驴的DNA分别稀释为10 ng/μL、1 ng/μL、10-1 ng/μL、10-2 ng/μL、10-3 ng/μL共5个浓度梯度,进行马和驴4对引物特异性PCR的灵敏度检测。马、驴核基因特异性PCR扩增体系能扩增出目的条带的最低模板浓度分别为0.1 ng/μL和0.01 ng/μL;马、驴线粒体基因特异性PCR扩增体系能扩增出目的条带的最低模板浓度均为0.01 ng/μL (图2)。由此可知,马和驴核基因PCR检测灵敏度分别是0.2 ng和0.02 ng,线粒体基因PCR检测灵敏度均为0.02 ng。
采用马和驴各6个个体的DNA样品进行马和驴特异性扩增体系的种内保守性检测,马和驴核基因特异性PCR分别扩增出166 bp和144 bp的目的条带,马和驴线粒体基因特异性PCR分别扩增出179 bp和130 bp的目的条带,而且4个特异性PCR扩增体系在各自6个样品中扩增片段大小一致(图3)。以上结果表明马和驴特异性扩增体系在物种内具有保守性。
图2
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图2马和驴特异性PCR扩增体系灵敏度检测
A：马核基因特异性扩增体系灵敏度检测;B：驴核基因特异性扩增体系灵敏度检测;C：马线粒体基因特异性扩增体系灵敏度检测;D：驴线粒体基因特异性扩增体系灵敏度检测。M：DNA Marker;Control：空白对照。
Fig. 2Sensitivity detection of horse and donkey specific amplification
2.2 马、驴源性成分二重PCR扩增体系
上述结果表明本研究所建立的马和驴的 4个特异性PCR扩增体系均可以进行种源成分鉴定。为了实现在一个扩增体系中快速、简便地进行马、驴、骡种源成分的鉴别,在此基础上进一步建立马、驴核基因和线粒体基因二重PCR检测体系。两组二重PCR检测体系能够特异性在马、驴、马骡、驴骡目标物种中进行扩增,而空白和阴性对照中无任何扩增产物(图4)。其中利用马、驴核基因二重PCR进行检测时,在马和驴中仅有1条扩增条带,分别为166 bp和144 bp;在马骡和驴骡中都有166 bp和144 bp两条扩增条带(图4A),从扩增结果可以区分出马、驴和骡,但不能区分马骡和驴骡。再利用马、驴线粒体基因二重PCR进行检测,在马骡中有和马相同的179 bp扩增条带;在驴骡中有和驴相同的130 bp扩增条带(图4B)。综上所述,可以通过核基因二重PCR鉴别出马、驴和骡;再利用线粒体基因二重PCR进一步将骡中的马骡和驴骡进行区分。图3
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图3马和驴特异性扩增体系种内保守性检测结果
A：马核基因特异性扩增体系保守性检测;B：驴核基因特异性扩增体系保守性检测;C：马线粒体基因特异性扩增体系保守性检测;D：驴线粒体基因特异性扩增体系保守性检测。M：DNA Marker;Control：空白对照;N：阴性对照;1~6：DNA检测样本。
Fig. 3Intraspecific conservation results of horse and donkey specific amplification
2.3 马、驴和骡皮张鉴别
利用马、驴核基因二重PCR检测方法对马、驴、骡皮进行鉴别,马皮样品的扩增产物均是1条166 bp条带,驴皮样品的扩增产物均为1条144 bp条带,骡皮样品则均有166 bp和144 bp两条扩增条带(图5A),从而可区别马、驴、骡皮。图4
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图4马、驴二重PCR扩增体系特异性检测结果
A：马、驴核基因二重PCR特异性检测结果;B：马、驴线粒体基因二重PCR特异性检测结果。M：DNA Marker;1：空白对照;2：马;3：驴;4：马骡;5：驴骡;6~18：阴性对照(分别是普通牛、水牛、绵羊、山羊、猪、兔、狐、狗、貉、大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠)。
Fig. 4Specific detection results of horse and donkey duplex PCR amplification
随后采用马、驴线粒体基因二重PCR检测方法区别上述鉴别出的骡皮,马骡皮扩增产物是1条179 bp的条带,与马皮的扩增产物一致;驴骡皮扩增产物是1条130 bp的条带,与驴皮的扩增产物一致(图5B),基于此成功鉴别出马骡皮和驴骡皮。综上所述,结合马、驴核基因和马、驴线粒体基因二重PCR检测方法能准确鉴别马、驴、马骡和驴骡皮张。
图5
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图5马皮、驴皮、马骡皮和驴骡皮鉴别结果
A：马皮、驴皮和骡皮鉴别结果。M：DNA Marker;Control：空白对照;1~3：马皮;4~6：驴皮;7~9：骡皮。B：马骡皮和驴骡皮鉴别结果。M：DNA Marker;Control：空白对照;1：马阳性对照;2：驴阳性对照;3、4：马骡皮;5：驴骡皮。
Fig. 5Identification results of hides derived from horse, donkey, mule and hinny
2.4 阿胶中马、驴源性成分鉴定
利用马、驴核基因二重PCR检测方法对阿胶样品进行检测,驴皮阿胶样品仅扩增出1条144 bp条带,仅含有驴源性成分;而2种骡皮和驴皮混合的阿胶样品和3种未标明原料皮张成分的阿胶样品都扩增出166 bp和144 bp两条带,则既含有马源性成分又含有驴源性成分(图6),说明委托加工的5种阿胶样品中均含有马源性成分。检测结果与实际情况相符。由此可见在进行阿胶中种源成分检测时,只要在驴皮中掺入马和骡,利用马、驴核基因二重PCR检测方法都能检测出阿胶中的马和驴源性成分。图6
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图6阿胶中马、驴源性成分鉴定结果
M：DNA Marker;Control：空白对照;1：马阳性对照;2：驴阳性对照;3：驴皮阿胶样品;4、5：委托加工骡皮和驴皮混合的阿胶样品;6~8：委托加工未标明原料皮张成分的阿胶样品。
Fig. 6Identification results of horse and donkey derived components in Asini Colla Corii
3 讨论
多种动物源性成分混合使得实际样品的检测更为复杂,在1个 PCR 试管中检测不同 DNA 靶标往往会由于引物对之间会形成相互干扰和竞争而导致扩增效率降低[12],因此DNA靶标的选择至关重要。所筛选的DNA靶标在目标物种中应具有高度特异性,物种间有足够多的变异区域,特别是亲缘关系较近的物种应能进行区分;靶标序列在同一物种内部要高度保守,特别是引物序列区域不能有变异,如有变异将会使同一物种扩增结果不同而产生假阳性或假阴性结果。为此,本研究筛选出马核基因OBSCN、驴核基因LOC106835644、马和驴线粒体基因ND2作为靶标,但由于4条序列在马和驴中同源性较高,因此将引物设计在马和驴靶标基因序列有变异的区域,至少要求所设计的引物3'端有2个及以上碱基差异,从而有效保证所建立的PCR检测体系在马和驴中的扩增结果不同,确保其检测方法的特异性。另外普氏野马(Equus przewalskii)是现在仅存的野马,所筛选的马特异性靶标在普氏野马和家马中同源性较高,进而保证了特异性PCR检测体系的保守性,既能检测出家马也能检测出普氏野马。在进行皮张检测时,利用本研究所建立的核基因检测方法可以准确区分马、驴、骡,解决马、驴、骡皮张鉴定的难题。利用线粒体DNA靶标进行检测,仅能区分马和驴种源,无法将细胞质遗传物质来源相同的马骡和马区分,同样也不能区分驴和驴骡,这样仅从线粒体靶标进行检测将会造成驴骡和驴的混淆,那么也就会造成阿胶企业在生产中检测技术的问题而导致驴骡冒充驴的掺假。本研究中所建立的两个二重PCR扩增体系根据需要进行选择应用,如果仅仅为了区分马、驴、骡,通过核基因二重PCR即可达到检测目的,如果想进一步鉴定马骡和驴骡,可再结合线粒体基因二重PCR进行鉴别。
阿胶是深加工产品,掺假阿胶多是马皮和骡皮原料的添加,可能有以下几种情况：(1)驴皮中掺入马皮;(2)驴皮中同时掺入马皮和骡皮,问题就比较复杂,因为骡是由马和驴杂交而成,核基因组中的遗传物质一半来自驴一半来自马,而线粒体呈现母性遗传,马骡的线粒体DNA来自马,驴骡的线粒体DNA来自驴。针对这两种掺假情况,均可以利用本研究所建立的核基因二重PCR方法进行检测,无论是掺入马还是骡,均可检测出掺入的马源性成分。若采用线粒体DNA为靶标进行检测,用马和马骡掺入时,通过线粒体DNA检测可以检出马源性成分;若用驴骡掺入,因其线粒体DNA来自驴,这种情况下就只能检出驴的源性成分,会产生漏检的后果。在进行阿胶中源性成分检测时,因阿胶生产涉及到的不是单个皮张,当马、驴和骡3个物种皮张混合在一起生产阿胶时,无论如何都无法将骡皮与马、驴混合皮张区分开,只能鉴定出是否有马和驴源性成分。这不是检测方法的问题,而是这几个物种之间的特殊遗传关系本身所致。
在利用核酸检测技术进行阿胶源性成分检测中常遇到的一个困难是：经过高温熬制、高压等加工工艺制备,DNA会受到严重破坏;为此,在利用阿胶样品提取DNA时如何提高DNA的产量和纯度是首先应该克服的困难,本研究通过利用经典的苯酚氯仿抽提法进行提取,再利用小片段基因组DNA纯化试剂盒进行纯化,有效提高了DNA的纯度。由于阿胶样品中的DNA降解严重,在进行源性成分检测设计时,PCR扩增片段不能太长,否则扩增效率会降低;扩增片段也不能太短,如果太短会影响检测的特异性。本研究所设计的检测体系的扩增产物在150 bp左右,可有效保障阿胶中的源性成分检测的特异性和灵敏度,进而保证了检测结果的准确性。
综上所述,结合马驴核基因组和线粒体DNA中物种特异性序列建立的二重PCR检测方法,具有操作简单、特异性强、结果判断直接且准确等优点,能快速、有效区分马、驴、马骡和驴骡以及鉴定阿胶中马、驴源性成分,实现阿胶产品从原料到成品的监控,为阿胶生产企业和监管部门提供技术支撑。
参考文献 原文顺序
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被引期刊影响因子
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[本文引用: 1]
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[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
DOI:10.1007/s11418-013-0790-zURLPMID:23807625 [本文引用: 1]
Asini Corii Collas (ACC; donkey glue) is a crude drug used to promote hematopoiesis and arrest bleeding. Because adulteration of the drug with substances from other animals such as horses, cattle, and pigs has been found, we examined PCR methods based on the sequence of the cytochrome b gene for source species identification. Two strategies for extracting DNA from ACC were compared, and the ion-exchange resin procedure was revealed to be more suitable than the silica-based one. Using DNA extracted from ACC by the ion-exchange resin procedure, PCR methods for species-specific detection of donkey, horse, cattle, and pig substances were established. When these species-specific PCR methods were applied to ACC, amplicons were obtained only by the donkey-specific PCR. Cattle-specific PCR detected as little as 0.1% admixture of cattle glue in the ACC. These results suggest that the species-specific PCR methods established in this study would be useful for simple and easy detection of adulteration of ACC.
DOI:10.4103/pr.pr_33_17URLPMID:29263623 [本文引用: 1]
Background: Asini Corii Colla (ACC) (namely donkey hide gelatin, E'jiao in Chinese) was one of the most valuable tonic traditional Chinese medicines which is an infallible remedy to promote hematopoiesis. It should be produced by fresh or dried donkey hide according to Chinese Pharmacopeia (2015 edition) with a long-time decoction, while as donkey and horse (or mule) all belong to equids so their hides or their hide gelatins are share much in common, that cause the difficult in distinguishing raw materials donkey hide from horse/mule hide for manufacturer, and the challenge in the quality evaluation of ACC for regulatory authority to identify the adulterated with horse hide. Objective: To establish an effective quality evaluation methods for ACC focused on the qualitative-based identification of the raw material's authenticity, mainly to identify the species origin of the gelatins. Materials and Methods: DNA extracted from (1) Raw materials (hides of donkey, horse, mule, bovine and pig); (2) Five hide-glues (bovine, pig, donkey, horse and mule hide-glue); (3) 11 batches of ACC commercial products made by different manufactures from local drug stores. Polymerase chain reaction (PCR) method with newly designed horse-specific primers I and primer pair II. Results: Use the primer pair I, a 234 bp target product could be amplified sensitively from the DNA sample of horse/mule adulterated commercial ACC products, though the DNA in commercial products is severely degraded. A 219 bp product could be amplified specifically from the DNA sample of horse/mule hide, while the results were all negative for the DNA templates of donkey hide, its gelatin and ACC products without adulteration. Conclusion: The developed PCR method based on primer I and II provide an effective approach to identify the species origin of highly processed product ACC (primer pair I) as well as to distinguish the raw material donkey hide (primer pair II), which might enlighten a new strategy to the Quality Evaluation of ACC. SUMMARY: Though the quality of commercial Asini Corii Colla (ACC) products varies greatly and produce with nondonkey hide was one the most common adulteration, the effective method to constrain such adulteration remains to be establishedThe gelatins made by donkey, horse, bovine, pig, mule shares much in common with each other, not only in contents of amino acids but also the profiles of protein in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, gel filtration chromatography and two-dimensional electrophoresisThe adulteration in ACC by using horse/mule hide, which is most difficult to detect, could be identified by Polymerase chain reaction methods with newly designed horse/mule-specific primer. Abbreviations Used: ACC: Asini Corii Colla; TCMs: Traditional Chinese Medicines; SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; IEF: Isoelectric focusing; GFC: Gel filtration chromatography; 2-DE: Two-dimensional electrophoresis; PCR: Polymerase chain reaction.
URLPMID:30928895 [本文引用: 1]
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[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
[本文引用: 1]
