利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种及其评价

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张照华, 王志慧, 淮东欣, 谭家壮, 陈剑洪, 晏立英, 王晓军, 万丽云, 陈傲, 康彦平, 姜慧芳, 雷永, 廖伯寿. 利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种及其评价[J]. 中国农业科学, 2018, 51(9): 1641-1652 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.003
ZHANG ZhaoHua, WANG ZhiHui, HUAI DongXin, TAN JiaZhuang, CHEN JianHong, YAN LiYing, WANG XiaoJun, WAN LiYun, CHEN Ao, KANG YanPing, JIANG HuiFang, LEI Yong, LIAO BoShou. Fast Development of High Oleate Peanut Cultivars by Using Marker-Assisted Backcrossing and Their Evaluation[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2018, 51(9): 1641-1652 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.003

0 引言

【研究意义】花生（Arachis hypogaea L.）是中国重要的油料和经济作物。近几年,中国花生种植面积约4.67×10⁶ hm²,总产1.68×10⁷ t,约占世界花生产量的40%。国产花生原料的55%用于榨油,年产花生油2.6×10⁵ t,是国产植物油的第二大来源^[1,2]。因此,中国是世界上最大的花生生产、消费和出口国。花生种子中含8种主要脂肪酸,而油酸（45%—80%）、亚油酸（2%—35%）和棕榈酸（6%—12%）,这三种脂肪酸占比达到92%^[3]。油酸含量是评价植物油品质的重要指标。油酸可以降低对人体健康有害的低密度胆固醇（low-density lipoprotein,LDL）,同时不破坏对人体有利的高密度胆固醇（high-density lipoprotein,HDL）,而且高油酸花生（油酸含量约80%）产品还可延长货架寿命^[4,5,6]。但目前国内主推的花生品种绝大多数为普通油酸含量（55%以下）,高油酸花生品种较少,导致国内花生原料和加工产品的油酸含量低,品质不优^[7]。因此,如何快速实现中国花生主推品种的高油酸化,已成为花生品种改良亟需解决的问题。【前人研究进展】花生油酸到亚油酸的转化,主要由分别位于A09、B09染色体上的ahFAD2A、ahFAD2B两对同源非等位基因控制^[8]。目前,在花生中广泛应用的高油酸突变材料F435^[9],是由于ahFAD2A的ORF-448 bp G/A替换和ahFAD2B的ORF-441_442的“A”插入导致FAD2酶部分或全部失活,2个基因同时突变导致了花生高油酸性状的产生^[10,11]。目前,针对这两个突变基因的特定突变位点开发的基因型鉴定方法主要有：1）CAPS标记法;2）荧光定量PCR法;3）位点特异性PCR（Allele-specific,AS-PCR）法;4）竞争位点特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,KASP）等^{[12,13,14,15]}。上述方法均是鉴定ahFAD2A、ahFAD2B的间接方法,由于ahFAD2A、ahFAD2B基因序列的高度相似性,导致鉴定结果具有一定比例的假阳性,用于回交后代的检测准确性不高,并且由于鉴定方法需要用到内切酶和荧光物质、荧光PCR仪等设备,鉴定成本和操作技术复杂,因此需要建立更准确的回交后代基因型鉴定方法。杂交育种是转移和聚合优良性状的常用技术方法^[16],自从花生高油酸突变体F435被引入中国以来,国内利用该突变体或其衍生材料,培育出了多个高油酸花生新品种,但这些新品种普遍存在产量较低、抗性不高、耐寒性差等问题^[17]。回交育种是改良推广品种个别不良性状的最为快速有效的方法,目前国内推广的主要花生品种均经过生产上的广泛种植,在一定生态区具有良好的适应性,通过回交育种快速地将这些优良的推广品种转育成高油酸品种,将加快中国花生高油酸品种的推广和应用进程。【本研究切入点】中国高油酸花生遗传改良起步晚,且目前培育的品种多为利用杂交和系谱法育成,杂交后代选择和品系的适应性评估周期较长,导致高油酸品种培育进展缓慢,不能满足产业发展需求。为此,需要建立简便高效的高油酸育种基因型鉴定方法和技术体系。【拟解决的关键问题】针对目前花生高油酸改良存在的问题,本研究利用回交技术提高推广花生品种的油酸含量,根据回交分离的特点,实现回交后代基因型的简便高效鉴定,结合自交后代基因型的KASP分型技术,快速地获得高油酸株系。同时,综合利用植物学性状、农艺性状、抗病抗逆性鉴定和SSR标记检测,发掘与轮回亲本（推广品种）高度相似的高油酸回交后代,以加速高油酸品种的培育和推广进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 轮回亲本（推广品种） 1）中花16（ZH16,基因型AABB）,中国农业科学院油料作物研究所选育,2009年通过国家鉴定和湖北省审定,2013年通过江苏省鉴定,珍珠豆型中果早熟品种。含油量57.76%,油酸54.00%,亚油酸23.00%,为高产高油品种。2）中花21（ZH21,基因型AABB）,中国农业科学院油料作物研究所选育,2009年通过湖北省审定,2015年通过国家鉴定,珍珠豆型中果早熟品种。含油量53.09%,油酸41.20%,亚油酸36.00%,为高产抗青枯病品种。3）泉花551（QH551,基因型AABB）,福建省泉州市农科所选育,2015年通过国家鉴定和福建省审定,珍珠豆型小果花生品种。高抗青枯病,百果重210.9 g,含油量50.9%,油酸含量49.40%,亚油酸含量31.80%,为高产抗青枯病品种。4）徐花13（XH13,基因型AABB）,徐州农业科学研究所选育,2008年通过国家鉴定,中早熟大粒花生品种,百果重234.2 g,含油量56.43%,油酸45.70%,亚油酸33.30%,为高产高油品种。
1.1.2 非轮回亲本（高油酸基因供体）冀花13（JH13,基因型aabb）,河北省农林科学院粮油所选育,2010年通过国家鉴定,普通型中早熟小果,百果重191.2 g。油酸含量81.4%,亚油酸2.9%,属高油酸小果花生品种。其高油酸基因来源是自然突变材料F435（基因型aabb）。

1.2 选育过程

杂交获得F₁代：以轮回亲本为母本,非轮回亲本为父本配置杂交组合,通过人工授粉获得F₁杂交种子,鉴定F₁杂交种子的基因型,获得F₁真杂种（基因型AaBb）。
回交获得BC₁F₁-BC₄F₁种子：以轮回亲本为母本,以获得的F₁真杂种为父本进行人工授粉,获得BC₁F₁种子,鉴定BC₁F₁种子基因型,保留基因型为AaBb的BC₁F₁种子作为下一代回交的父本。重复回交直至获得基因型为AaBb的BC₄F₁种子。
自交获得BC₄F₂-BC₄F₃种子：将BC₄F₁种子（基因型AaBb）种植,自交获得BC₄F₂种子,利用近红外初筛单粒种子的油酸含量,保留65%以上的种子进行基因型鉴定（KASP法）。为加快回交育种进程,分别在湖北武汉种植春季杂交（4月—8月）、广东湛江（11月—次年2月）进行每年两代人工杂交（图1）。

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图1高油酸花生回交育种流程
-->Fig. 1Backcross schedule for the breeding of high oleic acid peanut
-->

1.3 人工杂交方法

人工杂交父本一般比母本提前5天种植,以保证母本初花时有足够的父本花粉供应。母本初花后即可开始人工杂交,一般每天下午16：00—18:00对母本上花萼微裂花瓣黄色、第二天早上能正常开花的花蕾进行人工去雄,去雄后除去本节位上的多余花苞,然后用棉线绑在该节位上以示标记;次日清晨5：00—7：00父本花粉小心涂抹在去雄的母本花柱上,人工杂交一般持续15—20 d,人工杂交结束后一周用丝线标记杂交成功的果针。

1.4 DNA的提取

叶片DNA提取：分别取1片未展开的花生小叶,采用改良CTAB法提取^[18]DNA。
花生子叶DNA提取：切取种子远胚端的40 mg组织（最好从一片子叶上切取）,采用王传堂等^[19]方法提取DNA。

1.5 ahFAD2A、ahFAD2B基因型鉴定

根据回交育种不同世代的分离特点,采用不同的基因型鉴定方法。1）亲本基因型的鉴定：用Sanger测序法鉴定亲本材料的基因型。其中引物对Fad2A-F/ Fad2A-R用于单独扩增ahFAD2A;Fad2B-F/Fad2B-R用于单独扩增ahFAD2B,使用2个测序引物：Internal1和Internal2进行双向测序（表1）。PCR扩增体系（50 μL）为2×SYBR® Premix Ex Taq^TM（包含缓冲液,dNTPs） 25 μL、上下游引物（10 μmol·L^-1）2.5 μL和模版DNA 30 ng。PCR程序为95℃ 5 min;94℃ 30 s,61℃ 30 s,72℃ 60 s,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。得到的PCR产物原液（未纯化）,送擎科生物公司测序。2）F₁、BC₁F₁- BC₄F₁基因型的鉴定：杂交和回交后代种子采用廖伯寿^[20]描述的PCR产物测序法进行。PCR扩增引物：F0.7/R3。PCR扩增体系（50 μL）为2×SYBR® Premix Ex TaqTM（包含缓冲液,dNTPs）25 μL、上下游引物（10 μmol·L^-1）,2.5 μL和模版DNA 30 ng。PCR程序为95℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 60 s,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。得到的PCR产物原液（未纯化）,送擎科生物公司测序,以反向扩增引物R3为测序引物。3）自交后代BC₄F₂- BC₄F₄：采用位点竞争性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,KASP）方法进行。取自交后代幼嫩的叶片,送去中玉金标记公司,按照ZHAO^[21]描述的方法进行BC₄F₂等自交后代的基因型分型。随后用Sanger测序法验证KASP法鉴定获得的aabb单株基因型（具体方法同亲本基因型鉴定）。
Table 1
表1
表1花生ahFAD2A、ahFAD2B的PCR扩增引物名称、序列和扩增目标
Table 1Oligonucleotide primer names, sequences, and function for the cloning and amplification of ahFAD2A and ahFAD2B in peanut lines

引物名称 Primer name	序列 Primer sequence (5'-3')	扩增目标 Amplification target	扩增片段大小 Product size (bp)
F0.7	CACTAAGATTGAAGCTC	ahFAD2A /ahFAD2B	499/500 499/500
R3	CCCTGGTGGATTGTTCA	ahFAD2A /ahFAD2B	499/500 499/500
Fad2A_F	GATTATTGACTTGCTTTGTAGTAGTGC	ahFAD2A	1279
Fad2A _R	ACACAAACGTTTTCAACTCTGAC	ahFAD2A	1279
Fad2B_F	CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTGC	ahFAD2B	1278/11279
Fad2B_R	ACACAAACGTTTCCAACTCTGAC	ahFAD2B	1278/11279
Internal_1	AAGGGCCATCCTAGTGTGAG	Sequencing
Internal_2	CATGGTTGGTTTGACCCTTC	Sequencing

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1.6 油酸含量的测定（参照国家标准方法,GB/ T17377-2008测定）

脂肪酸提取方法：切取10—20 mg花生种子于10 mL玻璃管中,加入2 mL石油醚,超声波震荡30 min,再加入1 mL 0.4 mol·L^-1 NaOH-甲醇溶液,超声波震荡30 min,静置,取上清。
气相色谱仪Agilent 7890B测定油酸,色谱条件：DB-23色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;载气N₂25 mL·min^-1,空气 400 mL·min^-1,燃气H₂ 30 mL·min^-1。采用分流的方式进样,进样量1 μL,分流比60﹕1,进样口280℃,检测器280℃;程序升温：起始温度180℃,保持2 min,以10℃/min的速度升至190℃,保持1 min,再以5℃/min的速度升至200℃,保持1 min,再以20℃/min的速度升至220℃,保持6 min。

1.7 植株、农艺性状和抗病抗逆性的鉴定

aabb基因型的BC₄F₂-BC₄F₄材料与其轮回亲本表型性状的考察参照姜慧芳等^[22]方法进行。

1.8 SSR分子标记的检测

采用SSR方法检测aabb基因型的BC₄F₂材料与其轮回亲本分子水平近似性。PCR反应体系（10 μL）为20 ng DNA模板、Taq PCR SuperMix（由北京全式金生物公司提供,包含缓冲液、dNTPs、Taq酶）5 μL、正反引物（10 μmol·L^-1）各1 μL。PCR扩增采用Touchdown程序为95℃ 3 min;95℃ 30 s,65℃ 30 s,（每循环1次降低1℃）,72℃ 1 min,共10个循环;93℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。PCR产物采用变性PAGE胶检测^[23]。
SSR标记带型统计和分析：与轮回母本一样的带型记为“1”,与父本一样的带型记为“2”,杂合记为“3”。回复率（recovering ratio of genetic background,RRGB）计算公式G(g)=[L+X(g)]/(2L)=1/2+(1/2)(X(g) /L),G(g)指在g代的遗传背景恢复率^[24];X(g)指在回交g代表现为轮回亲本带型的分子标记数量;L指所分析的分子标记数量,并用Powermarker V3.25做聚类分析。

2 结果

2.1 亲本基因型鉴定

配置杂交组合前,采用Sanger测序法对4个轮回亲本和高油酸供体材料（各10粒种子）分别扩增（图2）和鉴定ahFAD2A和ahFAD2B的基因型（图3）,结果表明,4个亲本材料均为纯合一致的AABB基因型,高油酸供体冀花13为aabb基因型。

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图2引物FAD2A_F/FAD2A_R、FAD2B_F/FAD2B_R扩增亲本ahFAD2A和ahFAD2B ORF片段电泳图
A：ahFAD2A扩增产物电泳图;B：ahFAD2B扩增产物电泳图
-->Fig. 2Electrophoretogram of PCR amplification products of ahFAD2A-ORF and ahFAD2B-ORF
A: Electrophoretogram of PCR amplification products of ahFAD2A-ORF; B: Electrophoretogram of PCR amplification products of ahFAD2B-ORF
-->

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图3亲本FAD2A/FAD2B基因片段测序峰图及基因型鉴定结果
A：AA基因型;B：BB基因型;C：aa基因型;D：bb基因型
-->Fig. 3The sequencing results of PCR products of the parental genotypes
A: AA genotype; B: BB genotype; C: aa genotype; D: bb genotype
-->

2.2 基因型鉴定

杂交种子收获后切取部分子叶提取DNA,并用PCR产物测序的方法进行了基因型鉴定（图4和图5）,以去除假杂种（AABB）。4个组合F₁总计收获F₁种子91粒,其中真杂种81粒（基因型AaBb）,真杂种比例89.0%,除组合BO-04（XH13×JH13）真杂种率较低外,其他组合真杂种率均在90%以上（表2）。

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图4F0.7/R3扩增F₁种子ahFAD2A和ahFAD2B-ORF片段电泳图
-->Fig. 4Electrophoretogram of PCR amplification products of ahFAD2A-ORF and ahFAD2B-ORF
-->

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图5基于测序峰图的F₁基因型鉴定
A：母本（假杂种）基因型AABB;B：F₁（真杂种）基因型AaBb
-->Fig. 5F₁ genotype identification by the sequencing results of PCR products
A: Female parent (false hybrids) genotype, AABB; B: F₁(true hybrids) genotype, AaBb
-->

Table 2
表2
表2杂交F₁种子的获得与基因型鉴定结果
Table 2F₁ hybridization seeds and their genotypes

杂交组合序号 Cross number	组合 Cross	单粒种子基因型 Single seed genotype			真杂种（AaBb）比例 True hybrid seeds (%)
杂交组合序号 Cross number	组合 Cross	AABB	AaBb	总计Total	真杂种（AaBb）比例 True hybrid seeds (%)
BO-01	ZH16×JH13	2	23	25	92.0
BO-02	ZH21×JH13	0	12	12	100.0
BO-03	QH551×JH13	1	24	25	96.0
BO-04	QH13×JH13	7	22	29	75.9
	总计 Total	10	81	91	89.0

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2.3 回交后代种子的获得及基因型鉴定

回交后代的基因型鉴定采用PCR产物测序法进行。由于ahFAD2A和ahFAD2B的同源性很高,设计的F0.7/R3引物可同时扩增2个同源基因499 bp的DNA片段（包含突变位点）,用R3为引物进行PCR产物的反向测序,理论上测序峰图在ahFAD2的ORF-432应该出现ahFAD2A/ahFAD2B序列本身固有的C/A套峰。如果所有测序峰图均出现ORF-432的C/A套峰,表明PCR扩增和测序反应均同时扩增了ahFAD2A/ahFAD2B 2个基因。如果测序峰图在ORF-448位出现A/G的叠峰,则表明基因型Aa,否则判定为AA基因型;在同一测序峰图中ORF-442位如果有A碱基插入,会导致442位点后的峰图出现一个碱基的错位,判定基因型为Bb,否则判定为BB基因型。
在4个回交组合4个回交后代中总计检测了689粒种子（表3）,其中AaBb种子数170粒,约占24.7%（基本符合回交后代4种基因型1﹕1﹕1﹕1的分离比例）。总体来看,4种回交后代基因型中,AABB基因型个体偏多,推测可能原因为部分世代人工去雄不干净,误将母本（基因型AABB）自交的后代作为人工授粉的荚果进行标记所致,如泉花551的BC₃F₁世代,徐花13的BC₂F₁世代等。
Table 3
表3
表3回交BC₁F₁-BC₄F₁获得的种子数量与基因型鉴定结果
Table 3genotypes and numbers of BC₁F₁-BC₄F₁ seeds

组合 Cross	世代 Generation	鉴定的不同基因型种子数 Seed number of different genotype					AaBb基因型比例 AaBb genotype percentage (%)
组合 Cross	世代 Generation	AABB	AaBB	AABb	AaBb	总计Total	AaBb基因型比例 AaBb genotype percentage (%)
ZH16×JH13	BC₁F₁	7	7	10	11	35	31.4
	BC₂F₁	9	9	10	11	39	28.2
	BC₃F₁	12	9	10	8	39	20.5
	BC₄F₁	16	8	13	17	54	31.5
ZH21×JH13	BC₁F₁	20	16	13	22	71	31.0
	BC₂F₁	6	8	12	11	37	29.7
	BC₃F₁	17	5	6	10	38	26.3
	BC₄F₁	11	12	14	6	43	14.0
QH551×JH13	BC₁F₁	15	11	11	14	51	27.4
	BC₂F₁	10	9	11	10	40	25.0
	BC₃F₁	18	7	5	6	36	16.7
	BC₄F₁	13	7	5	12	37	32.4
XH13×JH13	BC₁F₁	8	9	13	6	36	16.7
	BC₂F₁	31	14	16	9	70	12.9
	BC₃F₁	10	3	11	11	45	24.4
	BC₄F₁	4	4	4	6	18	33.3
总计 Total	BC_nF₁	207	138	164	170	689	24.7

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2.4 自交后代基因型鉴定与油酸含量测定

2016年春在武汉种植从BC₄F₁植株上收获自交的BC₄F₂种子,经KASP分型鉴定（图6）,获得aabb基因型植株数分别为10、5、6和8个株系,总计29株（表4）。同时也得到了基因型为AaBb、aaBb和Aabb的BC₄F₃代种子,后代分离可得到aabb基因型材料。再自交1繁殖代,最终4个组合分别获得基因型为aabb的株系为16、39、38和8个。
Table 4
表4
表4BC₄F₂种子的KASP基因型分型结果
Table 4KASP results of BC₄F₂ seeds

组合 Cross	AABB	AaBB	aaBB	AABb	AaBb	aaBb	AAbb	Aabb	aabb	Unclear	总计Total
ZH16×JH13	1	3	0	2	6	5	10	6	10	35	78
ZH21×JH13	2	4	7	5	9	16	3	4	5	29	84
QH551×JH13	3	7	4	8	13	16	8	10	6	57	132
XH13×JH13	0	3	4	6	9	1	2	3	8	27	52
总计Total	6	17	15	21	37	38	23	23	29	148	357

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图6KASP基因分型结果
A：ahFAD2A基因分型结果：红点表示基因型为aa,蓝点表示基因型为AA,绿点表示基因型为Aa,粉点表示样品信号未检出,黑点表示未加模板的阴性对照（NTC）;B：ahFAD2B基因分型结果：红点表示基因型为bb,蓝点表示此处基因型为BB,绿色表示基因型为Bb
-->Fig. 6KASP results of ahFAD2A and ahFAD2B
A: ahFAD2A genotyping results: aa genotype in red, AA genotype in blue, Aa genotype in green, failure in pink, and NTC (non-temple control) in black; B: ahFAD2B genotyping results, bb genotype in red, BB genotype in blue, Bb genotype in green
-->

利用Sanger测序法对KASP分型获得的基因型为aabb的种子进行了确证性检验,并利用气相色谱法进行了脂肪酸含量的测定,结果表明,KASP法获得的29粒种子种有29粒的基因型为aabb,符合率100%,其油酸含量均在75%以上。

2.5 改良的高油酸材料近似性评价

2.5.1 表型评价对获得的BC₄F₄高油酸近等基因系和其轮回亲本进行表型评价,每个株系选取10个单株进行植株性状考种,含油量用FOSS近红外测定株系混合样（3次重复）,青枯病抗性按照每个株系设置3次重复进行自然病圃鉴定,计算平均存活率并换算为抗病级别。百果重、百仁重取株系的混合样进行考种,脂肪酸含量用气相色谱法进行测定。利用上述数据评价获得的高油酸材料与其轮回亲本的近似度,筛选最为接近的株系作为改良的高油酸品系（表5）。
Table 5
表5
表5决选高油酸近等基因系与其轮回亲本重要农艺性状、抗病性、品质指标的比较
Table 5Comparison of agronomic trait, disease resistance and quality character between NIL Lines and their recurrent parents

亲本及近等基因系 Parents&NIL lines	主茎高 Height of main stem (cm)	分枝数 Total ranching numbers (个)	百果重100-pod weight (g)	百仁重100-seed weight (g)	种子长宽比 Seed length-width ratio	含油量 Oil content (%)	油酸含量 Oleic acid (%)	青枯病抗性 Bacterial wilt resistance
ZH16, RP1	46.50±4.56	11.50±2.38	225.31	96.31	1.53	55.67±0.35	52.74	高感 High susceptive
ZH16-HO（ZJ019）	37.50±3.53	11.00±0.64	215.74	95.86	1.53	54.26±0.58	82.54	高感 High susceptive
ZH21, RP2	45.00±5.61	11.25±1.50	215.74	95.90	1.55	52.50±0.13	38.40	高抗 High resistant
ZH21-HO（ZJ109）	47.00±3.41	12.00±1.50	242.12	92.18	1.57	51.14±0.48	79.85	高抗 High resistant
QH551, RP3	43.20±3.88	8.50±0.89	237.90	91.63	1.50	48.47±0.14	51.42	高抗 High resistant
QH551-HO（ZJ160）	45.71±3.59	9.89±1.21	252.94	91.24	1.41	49.99±0.79	79.22	高抗 High resistant
XH13, RP4	38.86±4.82	9.50±3.25	282.55	120.43	1.64	57.69±0.29	45.58	高感 High susceptive
XH13-HO（ZJ805）	36.00±5.41	9.00±2.45	340.44	133.84	1.69	53.10±0.52	78.94	高感 High susceptive
JH13,HO donor	46.00±4.24	7.20±1.14	188.52	84.71	1.53	53.95±0.21	80.08	高感 High susceptive

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经表型性状的综合评价,ZH16-HO（ZJ019）与ZH16最为相似,在分枝数、百果重、百仁重、种子长宽比、青枯病抗性上无显著差异,主茎高、含油量略有降低,油酸提高到82.54%。ZH21-HO（ZJ109）与ZH21最相似,在主茎高、分枝数、种子长宽比、青枯病抗性上无显著差异,百果重变大,百仁重、含油量略有降低,油酸提高到79.85%。QH551-HO（ZJ160）与QH551最为相似,在主茎高、分枝数、百仁重、种子长宽比、含油量、青枯病抗性上无显著差异,仅百果重略有增大,油酸提高到79.22%。XH13-HO（ZJ805）与XH13最为相似,主茎高、分枝数、种子长宽比、青枯病抗性上无显著差异,百果重、百仁重高于亲本,含油量略有下降,油酸提高到78.94%。
2.5.2 SSR标记对后代遗传背景的分析挑选了均匀分布于花生染色体的1 263个SSR标记^[25,26],在组合中花16×冀花13中,筛多态性,最终得到67个多态性标记,并用于BC₄F₂基因型为aabb的10个株系遗传背景的评估。
从表6可以看出,中花16×冀花13组合BC₄F₂代高油酸单株的遗传背景的回复率都达到83.5%以上,其中ZJ019的回复率最高94.8%,说明高油酸后代的遗传背景和轮回亲本中花16已经高度一致。
Table 6
表6
表6中花16×冀花13组合高油酸单株遗传背景回复率
Table 6RRGB of high oleic acid plants from ZH16×JH13 cross

株号 Plant numbers	ZJ002	ZJ007	ZJ008	ZJ017	ZJ019	ZJ024	ZJ034	ZJ054	ZJ066	ZJ077
回复率 Recovering ratio of genetic background (%)	88.8	88.0	88.1	83.5	94.8	90.4	91.4	91.0	94.7	93.9

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用软件PowerMarker V3.25作聚类分析得到依据遗传距离的聚类图（图7）。ZJ019与ZH16遗传背景最接近;ZJ066和ZJ077次之;而ZJ017相差最大。最终,结合表型性状的考察,选择ZJ019为中花16的最优高油酸近等基因系材料。

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图7中花16及其高油酸候选近等基因系聚类
-->Fig. 7Dendrogram of cluster analysis of high oleate NIL lines and their current parent ZH16
-->

3 讨论

高油酸育种是花生遗传改良的重要方向,通过杂交和系谱育种,可培育出高油酸花生新品种,但目前国内应用的高油酸材料主要来源于美国,多为普通型匍匐小果材料,产量潜力不高,不符合中国花生生产和种植方式,用其作为杂交亲本培育高油酸品种,后代分离周期长,并且培育的品种需经过多点试验和生产试验以评估其产量潜力、抗病抗逆性和适应性^[27]。以现有推广品种作为轮回亲本,采用回交育种结合标记辅助选择技术,可在3年内快速实现推广品种的高油酸化改良,并且改良的高油酸品种在主要性状、抗病抗逆性上与原有推广品种相近,可直接在原有推广区域种植,大大加快了高油酸品种的推广进程,降低了推广风险。转育的高油酸品种还可作为优良亲本材料用于下一步的高油酸品种改良。
基于花生ahFad2A、ahFad2B突变位点进行基因型鉴定已开发出多种方法,如CAPS法、荧光定量法、AS-PCR法、KASP等,但不同的方法各有优缺点。如已开发的荧光定量法、AS-PCR法、KASP法,因ahFad2A、ahFad2B序列的高度相似性,均有一定的假阳性率。而CAPS标记法需要用到限制性内切酶,成本较高且操作相对复杂。为此,本研究巧妙地利用了ahFad2A、ahFad2B序列的高度相似性,筛选出一对PCR扩增效率高的引物F0.7/R3,用于同时扩增ahFad2A和ahFad2B,通过对PCR产物进行测序并读取测序峰图,可精准地区分和鉴定回交后代中的4种基因型（AABB、AaBB、AABb和AaBb）^[20]。但是由于ahFad2A和ahFad2B序列的相互干扰,也导致该方法也有一定的局限性,不能准确区分Aa/aa和Bb/bb基因型,不能用于自交后代的基因型鉴定,该方法与KASP标记法配合可完整高效地用于花生高油酸回交育种流程。
无论获得F₁还是不同回交世代的人工授粉过程,本研究一直将轮回亲本作为母本,这样做的益处有3个：其一,保证获得的高油酸品系与其轮回亲本相比,其细胞质控制的遗传物质没有变化。其二,由于采用人工授粉不可避免地会有花粉去不干净导致的假杂种产生,以轮回亲本（AABB）为母本,仅仅会产生一种基因型的假杂种（AABB）,母本植株上收获的基因型AaBb的后代均为人工授粉成功的真杂种。而如果将回交后代（AaBb）作为母本,一旦由于去雄不彻底而产生假杂种,假杂种（即母本自交）的基因型会非常复杂,其中AaBb基因型的假杂种可能会被误选,并作为下一代回交亲本,严重影响回交育种效果。其三,将AaBb基因型的人工杂交后代作为回交父本,不仅可在进行回交时提供花粉,父本植株上自交的种子如F₂、BC₁F₂-BC₄F₂也采用系谱法进行选择,从而可最大限度地利用不同的回交后代开展高油酸育种工作。
从理论上讲,回交4代的材料与其轮回亲本相比,细胞质遗传完全相同,细胞核遗传物质有96%以上的一致性,但由于连锁累赘导致后代回复率远没理论上高^[28],尤其是一些数量性状在回交后代中没能得到完全保留,如中花16和徐花13的高含油量性状在其回交后代获得的近等基因系中均未能检测到超亲的材料。然而,对于作为质量性状的青枯病抗性,在中花21和泉花551的回交后代中得到很好的保留,本研究还发现同一回交组合不同株系之间、株系与轮回亲本之间相比,在植株性状、重要农艺性状、重要抗性、品质指标上仍有部分差异,SSR分析也证实了这一结论。与表型法相比,SSR标记法是评判回交育种效率相对有效的方法,但由于SSR标记毕竟只是整个基因组的一部分,用SSR评估的回交恢复率仍然有很多不足之处。
由于提高油酸可同时提升花生的营养品质和货架寿命,高油酸已成为当前国际公认的花生品种改良重要目标。然而,种子油酸含量的大幅提高是否会给花生产量、抗性和其他品质指标带来一些不利的影响目前尚未研究清楚,仅有的研究表明高油酸花生受低温影响发芽率显著下降^[29],不同研究者也发现高油酸与普通油酸花生相比,其黄曲霉产毒抗性、棕榈酸含量存在显著差异^[30,31,32]。本项目通过回交育种获得的高油酸材料与其轮回亲本可作为遗传背景最为接近的近等基因系材料,是评价高油酸对其他重要性状影响的可靠材料。

4 结论

利用连续回交,南繁加代和分子标记辅助选择等技术可在3年内快速实现现有推广品种的高油酸化改良。对植株、农艺性状和抗病性考察并结合SSR标记检测,回交获得的高油酸后代与轮回亲本高度相似,筛选出4个最优回交后代株系ZJ019、ZJ109、ZJ160和ZJ805,作为4个优良轮回亲本中花16、中花21、泉花551和徐花13各自对应的改良高油酸酸品种,其油酸含量分别为82.54%、79.85%、79.22%、78.94%,表明利用这一技术体系实现了推广花生品种的高油酸化改良。
致谢：该研究得到“玛氏-中国花生高油酸育种计划”项目的资助,获得玛氏北京公司温若愚博士, 玛氏北美公司Victor Nwosu博士,河南省农业科学院张新友、黄冰艳研究员和美国农业部农业研究服务处作物保护和管理研究所Guo Baozhu教授在研究中所提供的帮助,在此表示感谢。
The authors have declared that no competing interests exist.