0 引言
【研究意义】昆虫体壁覆盖整个虫体,具有维持虫体形态、抑制体内水分蒸发和抵御外源物质入侵等作用[1],其主要由上表皮、原表皮和真皮细胞层组成,原表皮由内表皮和外表皮构成,其中上表皮和外表皮在蜕皮前形成,内表皮在蜕皮后形成[2]。昆虫表皮的主要成分为几丁质和表皮蛋白,两者约占昆虫表皮成分的60%以上,其成分的缺失或含量减少均会导致表皮功能异常甚至丧失,从而影响昆虫的正常生长发育[3]。蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）在调控昆虫蜕皮、变态和生殖中具有重要作用。目前,对表皮蛋白的研究主要集中于模式昆虫,而对于非模式的渐变态昆虫研究较少。飞蝗（Locusta migratoria）是一种典型的渐变态昆虫,同时也是一种重要的世界性农业害虫。因此,以飞蝗为对象研究渐变态昆虫表皮蛋白基因的分子特性、表达模式、生物学功能及受20E介导的表达调控方式,可以为表皮蛋白基因在20E介导的蜕皮过程中的作用及调控机制研究提供依据。【前人研究进展】随着昆虫基因组学的发展,越来越多的表皮蛋白被鉴定,其种类繁多,功能也不尽相同。目前已报道的昆虫表皮蛋白序列已有1 400条以上,主要分为5个家族,包括CPR家族、CPF/CPFL家族、Tweedle家族、CPAPs家族以及其他家族。其中,CPR家族是数量最多的表皮蛋白家族,根据其在表皮层的类型和位置的差异性,CPR家族可分成3个亚族,即RR-1、RR-2和RR-3,据报道含有RR-1基序的表皮蛋白主要存在于柔软表皮层,含有RR-2基序的表皮蛋白主要存在于坚硬表皮层[4],目前对含有RR-3基序的表皮蛋白研究报道不多,具体功能未知。CPAPs家族根据其含有的几丁质结合域可分为CPAP1和CPAP3两种类型,在昆虫生长发育中具有重要功能[5,6,7,8]。Tweedle家族是含有Tweedle基序的一类表皮蛋白,在昆虫体形和生长发育中具有重要作用[9]。CPF/CPFL是低复杂度表皮蛋白家族,该家族含有44个保守的氨基酸序列,在黄粉虫（Tenebrio molitor）和飞蝗中被首次鉴定[10]。随后,TOGAWA等[11]从冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中鉴定出4个CPF家族表皮蛋白基因,并发现这4个表皮蛋白基因只在蛹期或羽化前期表达,表明其可能与成虫体壁上表皮的形成有关。然而,仍有一些表皮蛋白不属于上面这些家族中的任一家族,被称为其他家族,如JENSEN等[12]从死人头蟑螂（Blaberus craniifer）中鉴定了4个蜕皮后表皮蛋白（BcNCP1、BcNCP2、BcNCP3和BcNCP4）,该类表皮蛋白含有2—3个重复基序,但不含几丁质结合域。该家族表皮蛋白在昆虫表皮中发挥怎样的作用仍不清楚。另外,昆虫表皮蛋白基因的表达受到多种因素的影响,如激素（20E和JH）、转录因子和内含子等,这些因素之间相互作用,使昆虫表皮蛋白基因的表达形成一个多级调控系统[13]。在昆虫蜕皮过程中20E与其受体（EcR）结合通过其响应因子调控表皮蛋白基因的表达[13],如在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和烟草天蛾（Manduca sexta）中研究发现βFTZ-F1能够促进表皮蛋白基因的表达[14,15]。在家蚕（Bombyx mori）中,翅原基表皮蛋白基因受到多个转录因子激活表达,并响应20E的诱导[16,17,18,19,20]。但20E对表皮蛋白基因的诱导调控研究大多集中在CPR家族基因,对其他家族基因的研究较少。在飞蝗中,笔者课题组前期基于转录组数据库获得了81个表皮蛋白基因,根据其保守基序分为CPR家族、CPAPs家族、Tweedle家族、CPF/CPFL家族以及其他家族[21]。随后,对CPR家族的内表皮蛋白基因LmAbd-5研究发现其主要在外胚层形成的组织中表达,可能参与内表皮的形成[22];王燕等[23]基于RNAi方法对CPAPs家族表皮蛋白研究,发现其在飞蝗生长发育过程中具有重要作用;SONG等干扰Tweedle家族表皮蛋白基因LmTwdl1后引起飞蝗蜕皮困难死亡[24],但对其他家族基因的研究尚未见报道。【本研究切入点】目前,关于飞蝗表皮蛋白的研究还比较少,主要集中于表皮蛋白的提取、鉴定和分类。对一些不含几丁质结合域的表皮蛋白的分子特性及其基因表达模式尚缺乏系统研究。另外,该类表皮蛋白基因是否响应20E诱导表达以及在20E介导的蜕皮过程中具有怎样的功能,有待深入研究。【拟解决的关键问题】以飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1为对象,研究其分子特性、组织分布和时期表达特性及其响应20E诱导表达情况,并通过RNA干扰结合H&E染色方法分析其生物学功能,为明确其在飞蝗蜕皮过程中的功能提供依据。1 材料与方法
试验于2016—2017年在山西大学应用生物学研究所完成。1.1 试验材料
供试昆虫：飞蝗虫卵购自河北沧州蝗虫养殖公司,将购买的飞蝗虫卵置于恒温人工气候培养箱内进行孵化,待其孵化成1龄若虫时移至养虫笼内置于人工气候培养箱中,种植新鲜小麦苗用于饲喂,待其长至3龄时开始辅以麦麸饲喂。人工气候培养箱内设置温度为（30±2）℃,相对湿度为（40±5）%,光周期为光照14 h﹕黑暗10 h。试验试剂：RNAisoTM Plus,Reverse transcriptase M-MLV（RNaseH）购自TaKaRa公司;SYBR® Green real-time PCR Master Mix购自TaKaRa公司;2×Tag PCR Master Mix购自天根公司;AxyPrepTM PCR Cleanup Kit试剂盒购于AXYGEN公司。
1.2 表皮蛋白基因获得及其分子特性分析
基于课题组飞蝗转录组数据库,获得表皮蛋白基因Unigene3699,结合飞蝗基因组数据库[25],获得其全长ORF序列,克隆验证后根据飞蝗基因组序列对其基因结构进行分析,引物见表1（由上海生工生物有限公司合成）。利用ExPASy网站translate tool对其ORF序列进行翻译、并预测蛋白分子量大小及等电点（pI）,利用ExPASy网站ProtParam tool分析其带负电荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）和带正电荷的碱性氨基酸（Arg+Lys）、蛋白脂肪系数、不稳定指数以及总水平亲水性系数（grand average of hydropathicity,GRAVY）,SignalP4.1 server分析其信号肽,利用SMART分析其结构域,通过WEBLOGO工具对其在各物种间的保守基序进行分析。Table 1
表1
表1本研究中所用引物
Table 1Primers used in this study
| 基因 Gene | 引物序列 Primer sequences (5′-3′) | 用途 Application | 产物长度 Length of product (bp) |
|---|---|---|---|
| LmNCP1 | F: AAAGAACACTGCTCAACATAT | cDNA克隆cDNA clone | 457 |
| R: TTTATTTGTAACAGAAACAGTT | |||
| LmNCP1 | F: CAACCCTCCGCCGCAGTA | RT-qPCR | 116 |
| R: CGTCGTGGTGGGCGTGTA | |||
| dsLmEcR | F: TAATACGACTCACTATAGGGGCAGCAACGCCGCACCCT | dsRNA双链合成 dsRNA double strand synthesis | 408 |
| R: TAATACGACTCACTATAGGGGCACTGGTACACGGCATTT | |||
| dsLmNCP1 | F: TAATACGACTCACTATAGGGGTTCTCTTCTCCGGCCGGCGTG | dsRNA双链合成 dsRNA double strand synthesis | 294 |
| R: TAATACGACTCACTATAGGGGTGTAACAGAAACAGTTAAAAT | |||
| dsGFP | F: TAATACGACTCACTATAGGGGTGGAGAGGGTGAAGG | dsRNA双链合成 dsRNA double strand synthesis | 712 |
| R: TAATACGACTCACTATAGGGGGGCAGATTGTGTGGAC | |||
| LmEcR | F: GACAAACTGCTACGGGAAGA | RT-qPCR | 172 |
| R: CTATCGTTTCTCCCATACCAG | |||
| β-actin | F: CGAAGCACAGTCAAAGAGAGGTA | RT-qPCR | 156 |
| R: GCTTCAGTCAAGAGAACAGGATG |
新窗口打开
1.3 系统进化树分析
根据Unigene3699氨基酸序列,运用NCBI的BLAST工具搜索其同源序列并进行比对,下载来源于其他物种的同源序列,使用MEGA 6.0软件中邻接法（neighbor-joining,NJ）,将Unigene3699氨基酸序列与死人头蟑螂、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）、黑腹果蝇等物种的同源序列进行聚类分析,独立分析1 000次,数值代表bootstrap估算值。根据聚类结果将其命名为LmNCP1（nymph cuticle protein 1）。用于构建进化树的不同目物种的表皮蛋白（cuticle protein 1,CP1）和飞蝗LmNCP1序列的GenBank登录号见表2。Table 2
表2
表2本研究中用于构建系统进化树的物种和NCP1的GenBank登录号
Table 2Species and GenBank accession number for phylogenetic tree used in this study
| 目 Order | 物种 Species | 基因名称 Gene name | GenBank登录号 GenBank accession number |
|---|---|---|---|
| 直翅目Orthoptera | 飞蝗Locusta migratoria | LmNCP1 | MF326211 |
| 蜚蠊目Blattaria | 死人头蟑螂Blaberus craniifer | BcNCP1 | P80674.1 |
| 弹尾目Collembola | 跳虫Orchesella cincta | cuticle protein 1 | ODM99884.1 |
| 鳞翅目Lepidoptera | 柑橘凤蝶Papilio xuthus | cuticle protein 1 precursor | NP_001299735.1 |
| 金凤蝶Papilio machaon | cuticle protein 1-like | XP_014363978.1 | |
| 玉带凤蝶Papilio polytes | cuticle protein 1 precursor | NP_001298499.1 | |
| 小菜蛾Plutella xylostella | cuticle protein 1-like | XP_011566030.1 | |
| 家蚕Musca domestica | cuticular protein hypothetical 1 precursor | NP_001166776.1 | |
| 黑脉金斑蝶Danaus plexippus | cuticular protein hypothetical 1 | EHJ71016.1 | |
| 脐橙螟Amyelois transitella | cuticle protein 1-like | XP_013191426.1 | |
| 双翅目Diptera | 瓜实蝇Bactrocera cucurbitae | cuticle protein 1 | XP_011192963.1 |
| 厩螫蝇Stomoxys calcitrans | cuticle protein 1 | XP_013115369.1 | |
| 地中海实蝇Ceratitis capitata | cuticle protein 1 | XP_004537594.1 | |
| 巴氏果蝇Drosophila busckii | cuticle protein 1 | XP_017836098.1 | |
| 家蝇Musca domestica | cuticle protein 1 | XP_005188694.1 | |
| 亚利桑那州果蝇Drosophila arizonae | cuticle protein 1 | XP_017867225.1 | |
| 橄榄果蝇Bactrocera oleae | cuticle protein 1 | XP_014096230.1 | |
| 辣椒实蝇Bactrocera latifrons | cuticle protein 1 | XP_018805001.1 | |
| 橘小实蝇Bactrocera dorsalis | cuticle protein 1 | XP_011208754.1 | |
| 嗜榕果蝇Drosophila ficusphila | cuticle protein 1 | XP_017044375.1 | |
| 黑腹果蝇Drosophila melanogaster | CG8736 | NP_610394.2 | |
| 半翅目Hemiptera | 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum | cuticle protein 1 | XP_001949693.1 |
| 麦双尾蚜Diuraphis noxia | cuticle protein 1 | XP_015377674.1 | |
| 茶翅蜡Halyomorpha halys | cuticle protein 1-like | XP_014276372.1 | |
| 温带臭虫Cimex lectularius | cuticle protein 1-like | XP_014258899.1 | |
| 牧草盲蝽Lygus hesperus | cuticle protein 1 | JAQ14881.1 | |
| 烟粉虱Bemisia tabaci | cuticle protein 1-like | XP_018903660.1 |
新窗口打开
1.4 mRNA表达特性
1.4.1 表达的组织特异性检测 为了探讨LmNCP1在不同组织的表达特性,选用5龄第2天飞蝗若虫,雌虫和雄虫各半,设置3个生物学重复,每个生物学重复4头试虫,解剖体壁、翅芽、前肠、胃盲囊、中肠、后肠、马氏管和脂肪体8个组织,立即冻存于液氮中。按照TaKaRa公司的试剂说明书,用RNAisoTM Plus提取上述组织的总RNA,将所提取RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量,然后使用Nanodrop 2000对所取总RNA进行定量,并以1 μg总RNA为模板,根据TaKaRa反转录试剂盒说明书,合成cDNA。利用RT-qPCR方法检测5龄第2天飞蝗不同组织部位的LmNCP1表达情况,反应体系和程序参考文献[22]。采用ABI Prism 7300 SDS 1.1软件对数据进行分析并记录。每个样本作2个技术重复,以β-actin作为内参（KX276642）[26,27],引物由上海生工生物有限公司合成（表1）。
1.4.2 不同发育天数的5龄若虫体壁中的表达量检测 为了探讨LmNCP1表达的时间动态,选取并解剖5龄第1—7天飞蝗若虫的第2—3腹节处体壁并冻存于液氮中,设4个生物学重复,每个生物学重复4头试虫。总RNA提取和cDNA模板合成方法同1.4.1。采用RT-qPCR方法检测LmNCP1在不同发育天数的5龄若虫体壁中的表达情况,引物见表1。
1.5 20E诱导表达分析
根据课题组20E处理的表皮转录组数据库[28],发现与对照组相比,LmNCP1在20E处理组中的表达量显著上升。为了进一步验证这一结果,对5龄第2天若虫进行体内注射20E,具体参考LI等[29]的方法。以注射10%乙醇的若虫为对照组,分别处理1、3、6和12 h后解剖飞蝗若虫第2—3腹节处体壁并冻存于液氮中,设3个重复,每个生物学重复4头试虫。总RNA提取和cDNA模板合成方法同1.4.1。采用RT-qPCR方法检测LmNCP1在20E处理组和对照组中的表达差异,具体方法同上。1.6 干扰20E核受体后LmNCP1的表达变化
为了进一步检测LmNCP1响应20E诱导表达情况,基于RNA干扰方法合成并向5龄第2天若虫注射10 μg 20E受体基因LmEcR（GenBank登录号：AAD19828.1）双链RNA（dsLmEcR）,以注射dsGFP（绿色荧光蛋白基因的双链RNA）为对照,dsLmEcR片段选取位置为LmEcRA和LmEcRB的公共区域,具体参考LIU等[30]的方法。48 h和72 h后取飞蝗若虫第2—3腹节处体壁并冻存于液氮中,设3个重复,每个生物学重复4头虫子。总RNA提取和cDNA模板合成方法同上。采用RT-qPCR方法检测LmEcR的沉默效率,同时检测LmNCP1在干扰LmEcR 48 h和72 h后的表达变化,具体方法同上,引物见表1。1.7 基于RNAi的LmNCP1功能分析
扩增LmNCP1基因片段（5′-3′：158—451 bp）,利用1.6中方法合成并向4龄第2天若虫注射10 μg该基因双链RNA（dsLmNCP1）,以注射dsGFP为对照,24 h后取对照组和处理组飞蝗体壁组织,利用1.6中方法检测LmNCP1的沉默效率,其余若虫正常饲养观察表型。若飞蝗正常蜕皮则于5龄第2天再次注射10 μg dsLmNCP1,正常饲养观察表型。1.8 H＆E染色
为了观察干扰LmNCP1后对飞蝗表皮形成的影响,分别解剖对照组和处理组5龄蜕皮后72 h飞蝗体壁组织。取其一部分腹部（第2、3腹节）表皮,用3%戊二醛固定,4℃过夜以制备石蜡切片,另一部分速冻后提取RNA再次检测LmNCP1沉默效率。固定的样品经石蜡包埋后进行切片（5 μm）,然后用苏木精和伊红（H＆E）染色,具体方法参照文献[24],封片后利用显微镜（Olympus BX51,Japan）观察表皮结构。1.9 数据分析
基因相对表达量采用2-△△Ct [31]法进行分析,采用student t-test方法进行差异表达分析,*表示在P<0.05水平差异显著,**表示在P<0.01水平差异显著,***表示在P<0.001水平差异显著。2 结果
2.1 LmNCP1特性分析
根据课题组飞蝗转录组数据库获得一个表皮蛋白基因Unigene3699,结合飞蝗基因组序列获得其cDNA序列并克隆、测序验证,结果显示该基因cDNA序列长457 bp,具有一个306 bp的开放阅读框（ORF）;基因结构分析显示该基因含有两个外显子（图1-A）,编码101个氨基酸,预测分子量为10.5 kD,等电点为7.5,其编码的蛋白N末端含有一个信号肽,不含几丁质结合域,但具有3个重复基序（图1-B）,而且该重复基序在不同物种的同源蛋白中具有高度保守性（图1-C）。该蛋白有3个带负电荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）,4个带正电荷的碱性氨基酸（Arg+Lys）,脂肪系数为69.80%,不稳定指数为66.89。亲/疏水性分析发现,总水平亲水性系数为0.226,属亲水性蛋白。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1LmNCP1结构与序列分析
-->Fig. 1Genome structure and sequence analysis of LmNCP1
A：LmNCP1基因结构Gene structure of LmNCP1;B：LmNCP1序列分析Sequence analysis of LmNCP1;C：LmNCP1保守基序分析 Analysis of conserved motifs by Weblogo。下划线为信号肽The underline: Signal peptide;方框为重复基序The box: Repeated motif
-->
2.2 LmNCP1系统进化树分析
将获得的飞蝗NCP1氨基酸序列与其他昆虫的CP1氨基酸序列进行聚类分析,聚类结果显示,飞蝗NCP1与蜚蠊目、鳞翅目、半翅目烟粉虱和弹尾目昆虫的CP1聚为一支,其中与蜚蠊目昆虫BcNCP1亲缘关系最近（图2）。因此,根据其同源性将该蛋白命名为LmNCP1。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2LmNCP1与其他昆虫表皮蛋白CP1系统聚类分析（邻接法）
-->Fig. 2Phylogenetic analysis of LmNCP1 and CP1 from different insect species (NJ method)
用于构建系统进化树的物种和NCP1的GenBank登录号见
-->
2.3 LmNCP1组织和时期表达特性分析
组织表达显示,LmNCP1在飞蝗体壁、翅芽、前肠和脂肪体中均有表达,胃盲囊、中肠、后肠和马氏管表达较低或不表达,其中在体壁中表达量最高,约为翅芽和前肠中表达量的8—10倍（图3-A）,表明LmNCP1可能参与体壁的形成。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3LmNCP1在5龄飞蝗不同组织和不同发育天数的表达
-->Fig. 3The relative expression of LmNCP1 in different tissues and different days of 5th instar nymphs
A：LmNCP1在5龄飞蝗不同组织中的表达 The relative expression of LmNCP1 in different tissues of 5th instar nymphs。IN：体壁 Integument;WP：翅芽 Wing pads;FG：前肠 Foregut;GC：胃盲囊 Gastric caeca;MG：中肠 Midgut;HG：后肠 Hindgut;MT：马氏管 Malpighian tubules;FB：脂肪体 Fat body。B：LmNCP1在5龄飞蝗不同发育天数的表达 The relative expression of LmNCP1 in different days of 5th instar nymphs。N5D1—N5D7：5龄第1—7天 1st-7th day of 5th instar nymphs。C：LmNCP1在4龄到5龄蜕皮过程中的表达 The relative expression of LmNCP1 during molting from 4th instar to 5th instar nymphs。BE：蜕皮前Before ecdysis;E：蜕皮中Ecdysis;AE：蜕皮后After ecdysis
-->
对不同发育天数的5龄若虫体壁组织的RT-qPCR检测结果显示,LmNCP1主要在上一个龄期蜕皮后高表达（N5D1-N5D2）,随后表达量逐渐降低（N5D3-N5D6）,到下一个龄期蜕皮前表达有所上升（N5D7）,其中在蜕皮后第1天（N5D1）的表达量最高,约为N5D6表达量的55倍（图3-B）,这一表达模式与内表皮形成时间一致,推测其可能在飞蝗蜕皮过程中参与内表皮形成。蜕皮前后时期表达分析发现,LmNCP1在蜕皮前表达量极低,蜕皮后表达量逐渐升高（图3-C）。
2.4 20E诱导表达
为了检测LmNCP1是否响应20E诱导表达,选取5龄第2天飞蝗若虫进行体内20E诱导,RT-qPCR检测在20E诱导1、3、6和12 h后LmNCP1的表达变化。结果如图4所示,与对照组相比,LmNCP1在20E诱导1 h和3 h后表达量显著上调,约为对照组表达量的1.3倍和0.9倍,表明其响应20E诱导表达。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图420E诱导后不同时间LmNCP1的相对表达量
-->Fig. 4The relative expression of LmNCP1 after induction with 20E for different times
-->
2.5 干扰20E受体基因LmEcR后LmNCP1的表达变化
为了进一步检测LmNCP1响应20E信号通路的调控,利用RNAi方法向5龄第2天若虫注射20E受体基因LmEcR的双链RNA,48 h和72 h后检测LmNCP1表达变化情况。结果显示,注射dsLmEcR 48 h和72 h后LmEcR的表达被显著抑制,其沉默效率为86%和82%（图5-A）,同时LmNCP1的表达量均显著下调,分别降低了71%和87%（图5-B）,表明LmNCP1受LmEcR介导的20E信号通路调控。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5干扰LmEcR后对LmNCP1表达的影响
-->Fig. 5The relative expression of LmNCP1 after injection of dsLmEcR
A：LmEcR沉默效率检测 The relative expression of LmEcR determined by RT-qPCR after injected with dsLmEcR;B：干扰LmEcR后LmNCP1表达检测 The relative expression of LmNCP1 determined by RT-qPCR after injected with dsLmEcR
-->
2.6 基于RNAi的LmNCP1生物学功能分析
为了进一步研究LmNCP1对表皮形成的影响,首先向4龄第2天若虫注射10 μg dsLmNCP1,以注射dsGFP为对照。结果发现,与对照组相比,注射dsLmNCP1的飞蝗LmNCP1的表达能够被显著抑制,但飞蝗均能够正常蜕皮进入5龄。随后于正常蜕皮的5龄第2天飞蝗再次注射10 μg dsLmNCP1,尽管与对照组相比,处理组LmNCP1的表达量下降了98%（图6-A）,但飞蝗仍能够正常蜕皮变为成虫。为了观察该基因的缺失是否对飞蝗表皮结构产生影响,分别解剖对照组和处理组5龄蜕皮后72 h的成虫体壁组织,制作石蜡切片进行H&E染色。结果显示对照组原表皮结构正常,具有明显的外表皮和内表皮（图6-B和6-B’）,但处理组原表皮层只含有外表皮,几乎没有内表皮形成（图6-C和6-C’）,厚度测量统计分析显示处理组原表皮层相对于对照组显著变薄,表皮层厚度减少了33%（图6-D）,表明LmNCP1参与了飞蝗蜕皮过程中内表皮的形成。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6干扰LmNCP1对飞蝗表皮结构的影响
-->Fig. 6Effect on the formation of cuticle by hematoxylin and eosin (H&E) staining after injection of dsLmNCP1
A：LmNCP1沉默效率检测The relative expression of LmNCP1 determined by RT-qPCR after injected with dsLmNCP1。B、B’：注射dsGFP后,表皮显微结构（B）以及选择放大区域（B’）After injection of dsGFP, microstructure (B) and magnification (B’) of cuticle。C、C’：注射dsLmNCP1后,表皮显微结构（C）以及选择放大区域（C’）After injection of dsLmNCP1, microstructure (C) and magnification (C’) of cuticle;红色为细胞质及细胞外基质,深蓝色为细胞核 Cytoplasm and extracellular matrix are stained red with eosin, nuclei are stained dark blue with hematoxylin (Scale bars, 20 μm);Pro：原表皮 Procuticle;Exo：外表皮Exocuticle;Endo：内表皮 Endocuticle。D：对照组与处理组原表皮层厚度（n=8）Relative thickness of procuticle between dsGFP and dsLmNCP1
-->
3 讨论
本文根据课题组转录组数据库获得一个表皮蛋白基因LmNCP1,结合飞蝗基因组序列获得其全长ORF序列,并通过基因结构和序列分析发现,该基因只有2个外显子,编码的蛋白不具有几丁质结合域,但具有3个重复基序（C-P-x-P-x-C）,而且这3个重复基序在物种间高度保守。前人研究也有类似发现,如JENSEN等[12]从蟑螂若虫体壁中提取并鉴定出4个蜕皮后表皮蛋白,其中BcNCP1含有3个重复基序,根据其序列特征推测其可能特异性地与金属离子结合或与其他蛋白质相互作用。然而基于笔者课题组飞蝗转录组数据库仅发现一个该类型的表皮蛋白LmNCP1。系统进化树分析发现,LmNCP1与蜚蠊目蟑螂BcNCP1之间的亲缘性最近。5龄飞蝗组织特异性表达分析发现,LmNCP1在飞蝗体壁中高表达,表明其可能与体壁的形成有关;时期表达分析发现,LmNCP1在5龄早期（上一个龄期蜕皮后）高表达（N5D1-N5D2）,之后表达量逐渐降低（N5D3-N5D6）,到下一个龄期蜕皮前表达有所上升（N5D7）。蜕皮前后时期表达分析发现,LmNCP1在蜕皮前表达量极低,蜕皮后表达量逐渐升高。昆虫的内表皮在蜕皮后逐渐形成,约在蜕皮后72 h完全形成[2],LmNCP1这种表达模式与昆虫内表皮形成时间一致,推测其可能参与内表皮结构的形成。目前,RNAi技术是研究基因生物学功能的有效工具,而且飞蝗对RNAi具有高度敏感性。因此,基于RNAi方法沉默该基因后,与对照组相比,飞蝗能够正常蜕皮进入下一龄期,然而H&E染色发现干扰LmNCP1的虫体内表皮形成减少,与对照组相比原表皮层极显著变薄（减少33%）,表明其在飞蝗蜕皮过程中参与了内表皮结构的形成。随着昆虫基因组学和转录组学的发展,越来越多的表皮蛋白基因被鉴定,然而关于表皮蛋白基因的功能研究,尤其是内表皮蛋白基因的功能研究报道较少。XIONG等从家蚕体形突变体中鉴定出一个表皮蛋白基因BmorCPH24,研究发现其参与家蚕内表皮的形成[32],然而其作用机制有待深入研究。
研究表明,20E在昆虫蜕皮过程中具有重要作用,而表皮蛋白是结构蛋白,已有研究表明表皮蛋白基因的表达在昆虫表皮形成中受20E诱导调控[13]。根据笔者课题组前期20E处理的表皮转录组数据库[28],发现与对照组相比,LmNCP1在20E处理组中的表达量显著上升,暗示其可能响应20E诱导调控。为进一步研究其是否受20E信号调控,首先选取5龄第2天若虫注射20E进行不同时间诱导,结果发现LmNCP1在20E诱导后1 h和3 h均能够上调表达;随后,通过RNAi方法沉默20E受体基因LmEcR后发现,与对照组相比,LmNCP1表达显著下调,表明LmNCP1响应LmEcR介导的20E信号通路调控。然而,LmNCP1时期表达模式与20E滴度变化并不一致[30]。有研究发现,一些表皮蛋白基因,其转录水平的上调需要20E调控,但这些表皮蛋白的基因转录只有在20E信号降低时才会启动[33,34]。因此,笔者推测LmNCP1可能响应低浓度的20E诱导,但其受20E信号通路调控的具体机制以及在表皮形成中的作用机制还有待进一步研究。
4 结论
飞蝗LmNCP1具有3个物种间高度保守的重复基序,其编码基因主要在飞蝗体壁中高表达,暗示其参与体壁的形成。LmNCP1表达具有时期特异性,其表达模式与内表皮形成时期一致。基于RNAi的生物学功能分析显示该基因在飞蝗4龄和5龄若虫期均能被有效沉默,虽无致死表型,但影响内表皮的形成。体内20E诱导及其受体基因RNAi结果表明,LmNCP1受LmEcR介导的20E信号通路调控。The authors have declared that no competing interests exist.
