任义英, 崔翠, 王倩, 唐章林, 徐新福, 林呐, 殷家明, 李加纳, 周清元. 油菜主花序角果密度及其相关性状的全基因组关联分析[J]. 中国农业科学, 2018, 51(6): 1020-1033 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.06.002
REN YiYing, CUI Cui, WANG Qian, TANG ZhangLin, XU XinFu, LIN Na, YIN JiaMing, LI JiaNa, ZHOU QingYuan. Genome-Wide Association Analysis of Silique Density on Racemes and Its Component Traits in Brassica napus L.[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2018, 51(6): 1020-1033 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.06.002

0 引言

【研究意义】油菜是世界上主要的油料作物,在中国是继水稻、小麦、玉米、大豆之后的第五大作物,也是中国食用植物油和动物饲料的重要来源^[1,2]。角果是主要的光合器官,具有“库”和“源”的双重作用^[3,4]。适宜的角果密度可以提高光能利用率,增加籽粒数量,从而提高油菜产量^[5,6]。主花序角果数和主花序长是主花序角果密度的组成型性状,分别反应了主花序角果的分布情况和植株的松散程度,对油菜产量有直接或间接的影响。因此,鉴定和定位控制主花序角果密度及其相关性状的QTL,对挖掘高产基因和培育高产品种具有重要的指导意义。【前人研究进展】角果密度、主花序角果数和主花序长的广义遗传率都较高,遗传比较稳定,受环境因素的影响较小^[7,8,9]。余凤群等^[10]发现角果密度和主花序长都受多基因控制,且控制角果密度的基因存在互补作用,控制主花序长性状的基因存在重叠作用。也有研究表明,主花序有效长、主花序角果数和角果密度受显性效应、显性与环境互作效应以及上位性效应的影响,其中主花序有效长和主花序角果数也受加性效应控制^[12,13,14]。随着QTL定位方法和分子标记技术的飞速发展,推动了甘蓝型油菜角果相关性状QTL的研究进展。CHEN等^[15]检测到15个与主花序角果密度有关的QTL,单个位点的表型贡献率在2.79%—7.59%,其中A06、C05、C06和C08上的4个QTL在2个群体之间共有;发现13个与主花序长度有关的QTL,单个位点的QTL贡献率在2.58%—9.22%,在2个群体中检测到7个重叠的QTL。高必军^[16]在第12连锁群上检测到1个与主花序角果密度相关的QTL,解释17.3%的表型变异;5个与主花序有效角果数相关的QTL,依次位于第6、12、13连锁群,单个位点可解释性状表型变异的11.25%—25%;15个控制主花序长的QTL,分别位于第1、2、6和17连锁群,每个QTL分别解释7.4%—26.6%的表型变异。阴涛^[17]检测到位于A02染色体上的2个与主花序角果密度相关的QTL,单个位点分别解释5.25%和8.07%的表型变异;在A02染色体上发现1个与主花序长相关的QTL,可解释6.25%的表型变异。目前,油菜角果密度及其相关性状的QTL研究还停留在初步定位阶段,后续研究报道较少。近年来,随着一些植物全基因组测序的完成,分子标记的开发和生物信息学的迅速发展,关联分析己成为植物数量性状基因研究的热点之一。关联分析又叫连锁不平衡作图（linkage disequilibrium mapping,LD mapping）,是一种以连锁不平衡为基础,根据特定的统计方法来鉴定某一自然群体内目标性状与分子标记（或候选基因）关系的定位方法,可以直接鉴定出控制目标性状的功能基因或基因内的功能多态性^[18]。关联分析以自然群体为研究对象,无需构建专门的分离群体,用时少,可以节约成本;可以检测群体内与目标性状相关一个基因座位上的多个等位基因,检测量大;自然群体积累的重组信息大,分辨率高,能够精细定位目标性状,精确到单基因水平^[19,20]。随着甘蓝型油菜全基因组序列的公布^[21]及芸薹属60 K SNP（single nucleotide polymorphism）芯片的开发,关联分析在甘蓝型油菜中的运用也取得了较大的成果,并鉴定出一些与重要农艺、品质性状相关联的位点^{[21,22,23,24,25]}。【本研究切入点】尽管已有油菜角果密度及其相关性状的QTL的研究报道,但多数为初步定位阶段,未能进一步定位和预测候选基因。【拟解决的关键问题】本研究采用不同遗传背景和地理来源的213份甘蓝型油菜构建自然群体,结合SNP芯片数据及重庆北碚2年的表型数据,拟对主花序角果密度、主花序有效长和主花序有效角果数进行全基因组关联分析,并进一步预测与性状相关的重要候选基因,为通过分子标记辅助选择等方式提高油菜产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

213份关联分析材料为具有不同遗传背景和广泛地理来源的常规品种、品系（电子附表1）,由重庆市油菜工程技术研究中心收集并提供。
Supplementary table 1
附表1
附表1供试材料来源及群体结构
Supplementary table 1List of rapeseed material sources and population structure in this study

材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY1	甘油5号Ganyou5	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY2	科里纳Kelina	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY3	淮油6号Huaiyou6	中国重庆Chongqing, China	0.432	0.568
AY4	炎81-2 Yan81-2	中国重庆Chongqing, China	0.412	0.588
AY5	28887	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY6	黔油4号Qianyou4	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY7	黔油331 Qianyou331	中国重庆Chongqing, China	0.252	0.748
AY8	880101	中国重庆Chongqing, China	0.779	0.221
AY9	SWU40	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY10	SWU42	中国重庆Chongqing, China	0.596	0.404
AY11	SWU43	中国重庆Chongqing, China	0.775	0.225
AY12	SWU44	中国重庆Chongqing, China	1	0
AY13	SWU45	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY14	SWU46	中国重庆Chongqing, China	0.001	0.999
AY15	SWU52	中国重庆Chongqing, China	1	0
AY16	SWU53	中国重庆Chongqing, China	0.089	0.911
AY17	SWU65	中国重庆Chongqing, China	0.001	0.999
AY18	SWU83	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY19	川油18 Chuanyou18	中国四川Sichuan, China	0	1
AY20	CY12NY-7	中国四川Sichuan, China	0.809	0.191
AY21	CY12Q95406	中国四川Sichuan, China	0.803	0.197
AY22	CY12QSZ06	中国四川Sichuan, China	0	1
AY23	CY12QCWH-1	中国四川Sichuan, China	0.49	0.51
AY24	CY12PXW-6	中国四川Sichuan, China	0	1
AY25	CY12PXW-9	中国四川Sichuan, China	0.454	0.546
AY26	CY13PXW-17	中国四川Sichuan, China	0.348	0.652
AY27	CY17PXW-58	中国四川Sichuan, China	1	0
AY28	CY19PXW-65	中国四川Sichuan, China	1	0
AY29	CY20PXW-66	中国四川Sichuan, China	0.513	0.487
AY30	CY21PXW-84	中国四川Sichuan, China	0	1
AY31	CY12GJ-1	中国四川Sichuan, China	0	1
AY32	wx10213	中国湖南Hunan, China	0.001	0.999
AY33	10-1043	中国湖南Hunan, China	0	1
AY34	10-1061	中国湖南Hunan, China	0	1
AY35	10-804	中国湖南Hunan, China	0.46	0.54
AY36	1472	中国湖南Hunan, China	1	0
AY37	湘油13号 Xiangyou13	中国湖南Hunan, China	0	1
AY38	湘油15号Xiangyou15	中国湖南Hunan, China	0	1
AY 39	湘油11号Xiangyou11	中国湖南Hunan, China	0	1
材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY 40	740	中国湖南Hunan, China	0	1
AY41	631	中国湖南Hunan, China	0	1
AY42	613	中国湖南Hunan, China	0.45	0.55
AY43	783	中国湖南Hunan, China	0.926	0.074
AY44	782	中国湖南Hunan, China	0	1
AY45	YB3	中国湖南Hunan, China	0.475	0.525
AY46	1360	中国湖南Hunan, China	0.23	0.77
AY47	563	中国湖南Hunan, China	0	1
AY48	WX10329	中国湖南Hunan, China	0	1
AY49	Santana	中国湖南Hunan, China	0	1
AY50	1281	中国湖南Hunan, China	0	1
AY51	509	中国湖南Hunan, China	0.001	0.999
AY52	1368	中国湖南Hunan, China	0	1
AY53	1322	中国湖南Hunan, China	0.292	0.708
AY54	1252	中国湖南Hunan, China	0	1
AY55	1321	中国湖南Hunan, China	0	1
AY56	07022	中国湖北Hubei, China	1	0
AY57	07094	中国湖北Hubei, China	1	0
AY58	9F087	中国湖北Hubei, China	0.075	0.925
AY59	97096	中国湖北Hubei, China	1	0
AY60	97097	中国湖北Hubei, China	1	0
AY61	07189	中国湖北Hubei, China	0.559	0.441
AY62	07191	中国湖北Hubei, China	0.003	0.997
AY63	07037	中国湖北Hubei, China	1	0
AY64	RR009	中国湖北Hubei, China	0.999	0.001
AY65	97177	中国湖北Hubei, China	0.341	0.659
AY66	96021	中国湖北Hubei, China	1	0
AY67	96093	中国湖北Hubei, China	1	0
AY68	01111	中国湖北Hubei, China	1	0
AY69	01570	中国湖北Hubei, China	1	0
AY70	9Bao22	中国湖北Hubei, China	0.999	0.001
AY71	01188	中国湖北Hubei, China	0.507	0.493
AY72	02359	中国湖北Hubei, China	0	1
AY73	93205	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY74	中双4号Zhongshuang4	中国湖北Hubei, China	1	0
AY75	中双9号Zhongshuang9	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY76	中双11号Zhongshuang11	中国湖北Hubei, China	0	1
AY77	2011-6200	中国湖北Hubei, China	1	0
AY78	2011-7103	中国湖北Hubei, China	0	1
材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY79	2012-4531	中国湖北Hubei, China	1	0
AY80	2012-8327	中国湖北Hubei, China	1	0
AY81	2012-8380	中国湖北Hubei, China	0.427	0.573
AY82	2012-8998	中国湖北Hubei, China	1	0
AY83	2012-9323	中国湖北Hubei, China	1	0
AY84	2012-9354	中国湖北Hubei, China	1	0
AY85	2012-9478	中国湖北Hubei, China	1	0
AY86	R2	中国湖北Hubei, China	0.655	0.345
AY87	阳光198 Yangguang198	中国湖北Hubei, China	0.441	0.559
AY88	阳光2009 Yangguang2009	中国湖北Hubei, China	0	1
AY89	中双12号X Zhongshuang12 X	中国湖北Hubei, China	0.449	0.551
AY90	中双589号Zhongshuang589	中国湖北Hubei, China	1	0
AY91	中双821Q Zhongshuang821Q	中国湖北Hubei, China	0	1
AY92	Major	中国湖北Hubei, China	0.519	0.481
AY93	Aurora	中国湖北Hubei, China	0.452	0.548
AY94	华油13号Huayou13	中国湖北Hubei, China	0.324	0.676
AY95	华油14号Huayou14	中国湖北Hubei, China	0.125	0.875
AY96	11-9-700	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY97	11-9-703	中国湖北Hubei, China	0.228	0.772
AY98	11-9-704	中国湖北Hubei, China	0	1
AY99	11-9-705	中国湖北Hubei, China	0	1
AY100	11-9-707	中国湖北Hubei, China	0	1
AY101	11-O63-5育7 11-O63-5Yu7	中国湖北Hubei, China	0	1
AY102	11-O63-8育32 11-O63-8Yu32	中国湖北Hubei, China	0	1
AY103	10-崇29 10-Chong29	中国湖北Hubei, China	0	1
AY104	10-江棚2 10-Jiangpeng2	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY105	11-育7-103 11-Yu7-103	中国湖北Hubei, China	1	0
AY106	11-育7-117 11-Yu7-117	中国湖北Hubei, China	0	1
AY107	11-育7-125 11-Yu7-125	中国湖北Hubei, China	0	1
AY108	7-7766-74	中国湖北Hubei, China	0	1
AY109	P18	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY110	圣光77 Shengguan77	中国湖北Hubei, China	0	1
AY111	甲预17棚 Jiayu17	中国湖北Hubei, China	0.583	0.417
AY112	甲预25棚 Jiayu25	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY113	甲预31棚 Jiayu31	中国湖北Hubei, China	0	1
AY114	华双5号 Huashuang5	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY115	华双4号Huashuang4	中国湖北Hubei, China	0	1
AY116	甲972 Jia972	中国湖北Hubei, China	0.002	0.998
AY117	华双128 Huashuang128	中国湖北Hubei, China	0	1
材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY118	甲915 Jia915	中国湖北Hubei, China	0.648	0.352
AY119	甲922 Jia922	中国湖北Hubei, China	0.436	0.564
AY120	甲917 Jia917	中国湖北Hubei, China	0.521	0.479
AY121	甲923 Jia923	中国湖北Hubei, China	0	1
AY122	甲931 Jia931	中国湖北Hubei, China	0	1
AY123	甲963棚 Jia963	中国湖北Hubei, China	0	1
AY124	沪油15 Huyou15	中国上海Shanghai, China	0	1
AY125	宁油14 Ningyou14	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY126	宁油12 Ningyou12	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY127	史力丰 Shilifeng	中国南京Nanjing, China	1	0
AY128	杨油6号 Yangyou6	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY129	杨油5号 Yangyou5	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY130	红油3号 Hongyou3	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY131	苏油1号 Suyou1	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY132	浙油18 Zheyou18	中国浙江Zhejiang, China	0.001	0.999
AY133	浙双72 Zheshuang72	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY134	浙双8号 Zheshuang8	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY135	浙油758 Zheyou758	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY136	沪油14 Huyou14	中国上海Shanghai, China	0.428	0.572
AY137	沪油10 Huyou10	中国上海Shanghai, China	0.01	0.99
AY138	浙油19 Zheyou19	中国浙江Zhejiang, China	0.167	0.833
AY139	AGREV021	德国Germany	0.416	0.584
AY140	Topas	瑞典Sweden	1	0
AY141	伟杰 Weijie	加拿大Canada	1	0
AY142	四达 Sida	加拿大Canada	1	0
AY143	D2	丹麦Denmark	0.766	0.234
AY144	D3	丹麦Denmark	0.757	0.243
AY145	11-504	中国青海Qinghai, China	0.026	0.974
AY146	11-540	中国青海Qinghai, China	0.451	0.549
AY147	P685	中国陕西Shaanxi, China	0.519	0.481
AY148	A109	中国陕西Shaanxi, China	0	1
AY149	B285	中国陕西Shaanxi, China	1	0
AY150	B414	中国新疆Xinjiang, China	0.112	0.888
AY151	A97	中国四川Sichuan, China	1	0
AY152	A148	瑞典Sweden	0	1
AY153	08-P35	中国湖北Hubei, China	0.831	0.169
AY154	09-P32	中国湖北Hubei, China	0.268	0.732
AY155	09-P36	中国湖北Hubei, China	0.115	0.885
AY156	10-P10	中国湖北Hubei, China	0	1
AY157	11-P30	中国湖北Hubei, China	0	1
材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY158	12-P25	中国湖北Hubei, China	0.52	0.48
AY159	03II13	中国甘肃Gansu, China	1	0
AY160	03I32B	中国甘肃Gansu, China	0.35	0.65
AY161	拢油2号Longyou2	中国甘肃Gansu, China	0.747	0.253
AY162	9801C	中国甘肃Gansu, China	0.776	0.224
AY163	876	中国甘肃Gansu, China	0.771	0.229
AY164	南川长角Nanchuanchangjiao	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY165	Gogatsuna	德国(Germany）	0.994	0.006
AY166	农林43 Nonglin43	中国重庆Chongqing, China	0.175	0.825
AY167	西藏油菜Xizhangyoucai	中国西藏Tibet, China	0	1
AY168	SWU54	中国重庆Chongqing, China	1	0
AY169	SWU62	中国重庆Chongqing, China	1	0
AY170	SWU68	中国重庆Chongqing, China	0.001	0.999
AY171	SWU69	中国重庆Chongqing, China	0.66	0.34
AY172	SWU85	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY173	SWU89	中国重庆Chongqing, China	0.937	0.063
AY174	SWU93	中国重庆Chongqing, China	0.001	0.999
AY175	SWU96	中国重庆Chongqing, China	0.018	0.982
AY176	SWU99	中国重庆Chongqing, China	1	0
AY177	SWU100	中国重庆Chongqing, China	0	1
AY178	中双7号Zhongshuang7	中国湖北Hubei, China	0.001	0.999
AY179	中双12号Zhongshuang12	中国湖北Hubei, China	0.399	0.601
AY180	镇油5号Zhengyou5	中国湖北Hubei, China	0.466	0.534
AY181	沪油15号Huyou15	中国上海Shanghai, China	0.139	0.861
AAY182	沪油16号Huyou16	中国上海Shanghai, China	0.916	0.084
AY183	浙油50 Zheyou50	中国浙江Zhejiang, China	0.971	0.029
AY184	阳光198 X Yangguang198X	中国湖北Hubei, China	0.64	0.36
AY185	华航901 Huahang901	中国湖北Hubei, China	0.497	0.503
AY186	浙油17 Zheyou17	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY187	Hector	中国湖北Hubei, China	0.569	0.431
AY188	绵96-203(09) Mian96-203（09）	中国青海 Qinghai, China	0	1
AY189	加拿大2号Jianada2	中国湖北Hubei, China	1	0
AY190	中双2号Zhongshuang2	中国湖北Hubei, China	1	0
AY191	中双9号Zhongshuang9	中国湖北Hubei, China	1	0
AY192	WH-26	中国湖北Hubei, China	0	1
AY193	WH-28	中国湖北Hubei, China	0.742	0.258
材料编号 Material ID	品种(品系) Varieties (lines)	材料来源 Material sources	群体结构 Population structure
			Q1	Q2
AY194	WH-57	中国湖北Hubei, China	0.558	0.442
AY195	Cubs root	中国湖北Hubei, China	0.453	0.547
AY196	华油10号Huayou10	中国湖北Hubei, China	0	1
AY197	Taisetsu	中国湖北Hubei, China	0.813	0.187
AY198	WESBROOK	中国湖北Hubei, China	1	0
AY199	Suigenshu	中国湖北Hubei, China	0.822	0.178
AY200	矮箕胜利Aiqishengli	中国上海Shanghai, China	0	1
AY201	漕泾胜利Caojinshengli	中国上海Shanghai, China	0.775	0.225
AY202	勺叶青shaoyeqing	中国上海Shanghai, China	0.461	0.539
AY203	沪激早Hujizao	中国上海Shanghai, China	0	1
AY204	漕油2号Caoyou2	中国上海Shanghai, China	0	1
AY205	大花球Dahuaqiu	中国江苏Jiangsu, China	0	1
AY206	沛油170 Peiyou170	中国江苏Jiangsu, China	0.34	0.66
AY207	当油早1号Dangyouzao1	中国安徽Anhui, China	0	1
AY208	广德761 Guangde761	中国安徽Anhui, China	0	1
AY209	滁610 Chu610	中国安徽Anhui, China	0.003	0.997
AY210	滁107 Chu107	中国安徽Anhui, China	0.503	0.497
AY211	滁油1号 Chuyou1	中国安徽Anhui, China	0.31	0.69
AY212	浙油601 Zheyou601	中国浙江Zhejiang, China	0	1
AY213	三高油菜Sangaoyoucai	中国浙江Zhejiang, China	0	1

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1.2 田间试验和性状调查

将213份材料分别在2014年和2015年10月种植于重庆市油菜工程技术研究中心歇马实验基地,11月份田间移栽,按完全随机区组设计,每种材料种植3行,每行10株,行距40 cm,株距20 cm,重复2次。待油菜成熟时,选取10株长势相对一致的单株,测定各单株的主花序有效长（valid length on racemes,VLR）和主花序有效角果数（valid silique on racemes,VSR）,并计算主花序角果密度（silique density on racemes,SDR）。主花序角果密度为主花序有效角果数/主花序有效长,以“个/cm”为单位;主花序有效长为从主花序底端第一个有效角果（有效角果,即角果中有饱满的种子）着生部位到顶端最后一个有效角果着生部位长度,以“厘米（cm）”为单位;主花序有效角果数为主花序上着生的有效角果数,以“个”为单位。表型数据采用Excel 2016软件进行初步整理,取2个重复的平均值,计算每个性状的平均数、标准差和变异系数;采用DPS7.05软件进行统计分析和性状间的Spearman相关性分析。

1.3 基因型测定与分析

利用油菜60 K Illumina Infinium SNP芯片对213份材料进行基因型分析,该芯片包括覆盖甘蓝型油菜全基因组的52 157个SNP标记。采用 Genome Studio（Illumina公司）软件对213份油菜种质进行SNP基因型的检测,挑选出杂合率（heterozygosity,H）、缺失率（miss rate,M）小于20%,同时最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）大于10%^[26],且均匀分布于染色体上的23 767个高质量SNP标记用于后续全基因组关联分析。

1.4 群体结构与亲缘关系分析

利用Structure 2.3.4软件对该群体进行群体结构分析^[27],设置亚群数目K为1—10,5次模拟运算,模拟参数迭代（length of burn-in period）和蒙特卡罗迭代（markov chain monte carlo,MCMC）都设置为1×10⁵次循环,在混合模型和频率相关模型下运算。输出的后验概率值结果输入STRUCTURE HARVESTER （http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）,计算2个连续的后验概率值的变化速率（Δk）和每个材料分别来自1—10亚群的Q值,以Q值0.8为分界线,最终确定群体的数目和结构^[28]。
利用Tassel 5.1.0软件对自然群体进行亲缘关系（relative kinship）评估,计算亲缘关系K矩阵^[29]。亲缘关系代表两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间遗传相似度的相对值,因此当材料之间的亲缘关系值为负值时,直接将其定义为0 ^[20]。

1.5 连锁不平衡分析

利用Tassel 5.1.0分析连锁不平衡（LD）在甘蓝型油菜各染色体上的分布,绘制各染色体的LD衰减图^[31],LD类型参数设置为Full Matrix,以决定系数（coefficient of determination）r²=0.2为衰减阈值,计算显著关联SNP所在染色体的LD衰减距离,用于候选基因预测和功能注释分析。

1.6 最优模型的选择和全基因组关联分析

将基因型数据导入Tassel5.1.0后进行主成分分析（PCA矩阵）,再将Q和K矩阵导入Tassel5.1.0,以Q、K和PCA矩阵作协变量,采用基于一般线性模块（general linear model,GLM）的GLM、Q和PCA模型和混合线性模块（mixed linear model,MLM）的K、Q+K和PCA+K共6种模型进行关联分析。以ggplot2^[30]绘制Quantile-Quantile散点图（QQ plot）表示不同模型的检测效力,以实际P值与期望P值最接近的模型为每个性状GWAS分析的最佳模型。最后基于最优统计模型,对群体内主花序角果密度及其相关性状进行关联检测。用P值来衡量关联标记的显著性,显著关联SNP阈值设为1/23767=4.21×10^-5。利用qqman^[31]绘制Manhattan图显示关联分析检测到的与目标性状显著相关的标记位点。

1.7 候选基因分析

在关联分析结果的基础上,用与性状显著关联的SNP所在染色体上r²=0.2时的衰减距离为候选基因的LD区间。根据这个区间在油菜基因组中的位置,以已公布的甘蓝型油菜“Darmor-Bzh”的基因组注释信息（http://www.Genoscope.cns.fr/brassicanapus）分析区间内的基因,并与拟南芥的基因序列进行BLAST比对,以同源性最高的拟南芥基因注释候选基因功能,筛选可能控制目标性状的候选基因。

2 结果

2.1 表型统计分析

连续2年（2015年和2016年）分别对213份油菜种质的主花序角果密度、主花序有效长和主花序有效角果数的表型进行考察和统计分析（表1、图1）,结果表明,3个性状在2年内品种间差异均达到极显著水平,变异系数介于15.38%—26.42%,变幅较大。正态检验（表1）和频数分布图（图1）也表明,目标性状2年Shapiro-Wilk检验的W值均在0.991—0.996,且P>0.05,符合正态分布;两年3个性状都呈连续性分布,符合典型的数量性状特点,适合进行GWAS分析。3个性状的广义遗传率分别为68.06%、67.47%和69.05%,也表明其主要受遗传因素影响。
Table 1
表1
表1甘蓝型油菜主花序角果密度、主花序有效长和主花序有效角果数的统计分析
Table 1Statistical analysis of SDR, VLR and VSR in B. napus

性状 Trait	年份 Year	均值±标准差 Mean±SD	变幅 Range	变异系数 CV (%)	偏度 Skew	峰度 Kurt	Shapiro-Wilk		广义遗传率 H2(%)
							W	P
SDR	2015	1.44±0.23**	0.72—2.17	16.12	0.09	0.23	0.996	0.908	68.06
	2016	1.37±0.33**	0.59—2.25	24.39	0.06	-0.54	0.993	0.449
VLR	2015	49.25±7.58**	25.60—68.00	15.38	-0.23	0.18	0.993	0.396	67.47
	2016	52.32±10.46**	25.85—81.50	19.98	0.23	-0.13	0.992	0.331
VSR	2015	69.97±13.53**	31.60—99.93	19.34	-0.24	-0.23	0.993	0.430	69.05
	2016	70.86±18.72**	28.00—139.33	26.42	0.30	0.43	0.991	0.187

SDR：主花序角果密度;VLR：主花序有效长;VSR：主花序有效角果数。** P<0.01水平差异显著。下同SDR: Silique density on racemes; VLR: Valid length on racemes; VSR: Valid silique on racemes. ** indicates significance at the level of P<0.01. The same as below
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图1自然群体主花序角果密度、主花序有效长和主花序有效角果数的频次分布
-->Fig. 1Frequency distribution of SDR, VLR and VSR from the natural population
-->

2.2 油菜主花序角果密度及其相关性状的相关性分析

2015年,主花序角果密度与主花序有效长、主花序有效角果分别存在统计学意义上的极显著负相关和显著正相关,相关系数分别为-0.265和0.144;2016年,主花序角果密度与主花序有效长具有统计学意义上的有极显著负相关。两年主花序角果密度与主花序有效长呈极显著负相关,意味着主花序增长,但没有相应地增加有效角果数,因此,研究主花序角果密度对增加主花序有效角果数,提高油菜产量有重要意义。

2.3 群体结构与亲缘关系分析

选择8 923个在染色体上均匀分布且最小等位基因频率大于0.3的SNP标记,利用软件Structure2.3.4对每个可能的K值模拟运算,输出结果分析后验概率LnP(D)值得到方差以及变化速率,当K=2时,模型中显示△K有最大变化（图2-A）。213份甘蓝型油菜分为P1和P2 2个亚群,P1亚群包含50份材料（23.5%）,绝大多数源自于国内的湖北省、春性油菜和少量的半冬性材料及国外引进的材料;P2亚群包含163份材料（76.5%）,主要是中国的半冬性油菜品系（电子附表1）。基于数学模型对群体的类群划分,基本与油菜的地理栽培属性一致。亲缘关系分析显示群体中约89.74%的材料之间的亲缘关系值小于0.2（图2-B）,其中约有59.91%材料的亲缘关系值为0,约12.01%材料的亲缘关系值介于0—0.05。说明整个自然群体材料之间的亲缘关系较远,对关联分析结果影响较小。
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图2213份甘蓝型油菜的群体结构和亲缘关系分析
A：自然群体的∆k值;B：亲缘关系分布
-->Fig. 2Analysis of population structure and relative kinship in 213 B. napus
A: Estimation of ∆k value in natural population; B: Distribution of relative kinship values
-->

Table 2
表2
表2主花序角果密度及其相关性状表型间的相关性
Table 2Correlation of phenotype among SDR and its component traits in two years

性状Trait	VLR	VSR	SDR
VLR	1	0.045	-0.265**
VSR	0.133	1	0.144*
SDR	-0.290**	0.021	1

*在P<0.05水平上显著相关。对角线上的是2015年的表型相关性,对角线下的是2016年的表型相关性* indicates significance at the level of P<0.05. The values above the diagonal are phenotypic correlation coefficients in 2015. The values below the diagonal are phenotypic correlation coefficients in 2016
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2.4 连锁不平衡在A、C基因组中的衰减

对A基因组的10条染色体（A01—A10）和C基因组的9条染色体（C01—C09）分别绘制带平滑线的LD衰减散点图（图3）。由图3可以看出A和C基因组的r²随着遗传距离的增加而下降,衰减距离也各不同。在r²的阈值为0.2标准下（表3）,A基因组的平均衰减距离为450 kb,其中A08染色体的衰减速度最慢,衰减距离最大,约为1 350 kb;A02和A04染色体衰减速度最快,衰减距离约为200 kb。C基因组的平均衰减距离为950 kb,其中C02的衰减距离最大,约为1 400 kb;C07染色体的衰减距离最小,约为500 kb。A基因组的衰减距离整体比C基因组的衰减距离小得多。这可能与中国半冬性甘蓝型油菜A基因组在育种中发生大规模重组,打破连锁不平衡有关。
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图3连锁不平衡在A、C基因组不同染色体的衰减
-->Fig. 3The linkage disequilibrium decline in different chromosomes for A and C genome
-->

Table 3
表3
表3连锁不平衡在A、C基因组中的衰减距离
Table 3The Linkage disequilibrium attenuation decline in A and C genome

染色体 Chr.	A基因组LD衰减距离 A genome LD attenuation distance (kb)		染色体 Chr.	C基因组LD衰减距离 C genome LD attenuation distance (kb)
A01	220		C01	1200
A02	200		C02	1400
A03	220		C03	700
A04	200		C04	750
A05	280		C05	650
A06	250		C06	950
A07	220		C07	500
A08	1350		C08	850
A09	530		C09	1350
A10	400
A基因组 A genome	450		C基因组 C genome	950

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此外,A和C基因组中有些染色体在进入衰减距离后仍存在不同程度和数量的波峰（图3）。A基因组中的A06染色体在1 800 kb左右有明显的峰,A01、A04、A05、A08和A10染色体在1 400—1 900 kb范围内均出现了明显且数量不同的峰。C基因组C07染色体在1 800和3 300 kb左右出现了明显的峰,除C04、C05和C09染色体外的其他染色体也在不同的遗传距离上出现了不同程度和数量的波峰。表明A和C基因组中同一条染色体上即使是距离较远的2个标记之间,也可能存在一定的连锁不平衡。

2.5 油菜主花序角果密度相关性状的6种模型比较

从图4可以看出,可能由于群体较小以及目标基因座与群体结构高度相关,除了2016年的主花序角果密度外,其他性状的K、K+Q和K+PCA模型都表现出一定的假阴性。在2015年的主花序角果密度（图4-A）和2016年的主花序有效长（图4-D）检测到Q模型有效地控制了假阳性和假阴性结果的出现;2015年的主花序有效长（图4-C）以PCA为最佳模型;2015和2016年的主花序有效角果数（图4-E和图4-F）,MLM模型下的K、K+Q和K+PCA模型虽然表现为假阴性,但它们的P值较Q和GLM模型更接近期望值,因此,选用K+Q作为主花序有效角果数的最优模型;2016年的主花序角果密度（图4-B）MLM模型下的K+Q和K+PCA模型均能较好地控制假阳性,但K+Q模型检测到P值更接近期望值。
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图46种统计模型对主花序角果密度及其相关性状进行关联分析的QQ图
A：2015年主花序角果密度;B：2016年主花序角果密度;C：2015年主花序有效长;D：2016年主花序有效长;E：2015年主花序有效角果数;F：2016年主花序有效角果数
-->Fig. 4Quantile-quantile plots of estimated -Iog10(p) from association analysis using six models in SDR and its component traits
A: SDR in 2015; B: SDR in 2016; C: VLR in 2015; D: VLR in 2016; E: VSR in 2015; F: VSR in 2016
-->

2.6 全基因组关联分析

GWAS分析2年数据共检测到17个SNP位点与主花序角果密度及其相关性状关联（表4和图5）。与主花序角果密度关联的SNP标记位点有7个,其中2015年环境中,仅在A03染色体上检测出Bn-A03-p15240794与主花序角果密度关联（图5-A）,P值为1.03×10^-5,可解释11.76%的表型变异;在2016年环境中,检测到6个与主花序角果密度性状相关的SNP位点（图5-B）,分布于染色体A01、A03、A04、A10和C01上,可解释11.34%—15.96%的表型变异。与主花序有效长关联的SNP标记位点共有9个,其中2015年环境中,在C03和C09染色体上各检测出1个显著关联的SNP位点（图5-C）,可分别解释10.67%和9.67%的表型变异;在2016年环境中,检测到7个与主花序有效长相关的SNP位点（图5-D）,除C05染色体上检测到1个位点,其他6个关联位点都在C09染色体的6.5—6.8 M区域被检测到,平均相距约50 kb,表型贡献率在10%—13.10%;仅在2016年环境中,检测到1个在A01染色体上与主花序有效角果数相关的SNP位点（图5-F）。
Table 4
表4
表4两年主花序角果密度及其相关性状的显著关联标记
Table 4Significance association markers of SDR and its component traits in two years

性状 Trait	年份 Year	模型 Model	标记 Marker	等位基因 Allele	染色体 Chr.	位置 Position (bp)	阈值 P	贡献率 R2(%)
	2015	Q	Bn-A03-p15240794	T/C	A03	14297288	1.03×10-5	11.76
SDR	2016	K+Q	Bn-A01-p10934377	A/C	A01	9038900	4.11×10-5	11.34
			Bn-A03-p19753364	T/C	A03	18718339	7.07×10-7	14.37
			Bn-A03-p20429794	A/G	A03	19300424	7.58×10-7	15.92
			Bn-A04-p7068079	A/G	A04	8339009	7.18×10-7	14.35
			Bn-A10-p9979372	A/G	A10	11410972	1.17×10-7	14.26
			Bn-scaff_15712_3-p482620	A/G	C01	37807280	7.29×10-7	15.96
	2015	PCA	Bn-scaff_18482_1-p438118	A/C	C03	19927499	3.52×10-5	9.67
VLR			Bn-scaff_18100_1-p1143728	T/C	C09	14571586	2.03×10-5	10.67
	2016	Q	Bn-scaff_18338_1-p984141	T/A	C05	13773225	1.11×10-5	10.25
			Bn-scaff_17487_1-p383153	A/G	C09	6554230	5.87×10-5	10.02
			Bn-scaff_17487_1-p464536	A/C	C09	6674713	2.65×10-5	10.72
			Bn-scaff_17487_1-p475655	A/G	C09	6682906	9.41×10-6	11.63
			Bn-scaff_17487_1-p488896	T/C	C09	6750877	1.71×10-6	13.10
			Bn-scaff_17487_1-p512535	T/G	C09	6772002	5.98×10-5	10
			Bn-scaff_17487_1-p545307	T/G	C09	6812179	2.33×10-5	10.84
VSR	2016	K+Q	Bn-Scaffold000582-p3247	T/C	A01	14533700	3.81×10-5	11.56

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图52年主花序角果密度及其相关性状的Manhattan图
A：2015年主花序角果密度;B：2016年主花序角果密度;C：2015年主花序有效长;D：2016年主花序有效长;E：2015年主花序有效角果数;F：2016年主花序有效角果数2.7 候选基因预测
-->Fig. 5Manhattan plot of SDR and its component trait in two year
A: SDR in 2015; B: SDR in 2016; C: VLR in 2015; D: VLR in 2016; E: VSR in 2015; F: VSR in 2016
-->

基于甘蓝型油菜参考基因组序列,对LD区间的候选基因进行分析,筛选出了22个与主花序角果密度及其相关性状有关的候选基因（表5）。通过扫描与主花序角果密度显著关联SNP标记的LD区域,共筛选到12个重要候选基因;在与主花序有效长关联SNP标记的LD区域内扫描到8个可能候选基因;在主花序有效角果数相关LD区间筛选出2个候选基因。其中,BnaA01g16940D、BnaC01g38800D和BnaA04g09170D等主要通过调控赤霉素和生长素等内源激素的合成和信号转导来控制主花序角果密度及其相关性状,BnaA01g16970D、BnaA03g29180D、BnaA03g29810D、BnaC01g39680D和BnaC03g32770D通过对分生组织或花分生组织的调控来改变性状表型,BnaC09g18690D和BnaC09g09210D等主要通过控制细胞分裂生长等过程改变性状形态;而BnaA01g22310D在拟南芥中的同源基因AT1G60420编码NRX1,具有典型的硫氧还蛋白（TRX）活性位点（WCG/PPC）,在植物体内以二聚体的形式被发现,nrx1突变体表现花粉生育力减弱,导致最终角果数目显著减少^[32,33]。总之,这些基因主要与赤霉素和生长素等内源激素的合成和信号转导、分生组织或花分生组织以及细胞分裂生长等过程有关,它们可能通过上述功能影响油菜花序或角果的发育,导致主花序角果密度及其相关性状的表型变异。
Table 5
表5
表5主花序角果密度及其相关性状的候选基因
Table 5A summary of candidate genes associated with SDR and its component traits

性状 Trait	标记 Marker	染色体 Chr.	LD区间 LD interval (bp)	候选基因 Candidate gene	拟南芥基因 Arabidopsis gene	基因 Gene	参考文献 Reference
SDR	Bn-A01-p10934377	A01	8818900-9258900	BnaA01g16940D	AT4G28160	羟脯氨酸糖蛋白Hydroxyproline-rich glycoprotein	[33-34]
				BnaA01g16970D	AT4G28190	ULT1	[35-36]
	Bn-A03-p19753364	A03	18498339-18938339	BnaA03g37770D	AT2G04550	IBR5	[37]
	Bn-A03-p20429794	A03	19080424-19520424	BnaA03g38550D	AT3G20130	GPS1	[38-39]
	Bn-A03-p15240794	A03	14077288-14517288	BnaA03g29180D	AT3G05840	AtSK12	[40-41]
				BnaA03g29810D	AT3G07050	NSN1	[42-43]
	Bn-A04-p7068079	A04	8139009-8539009	BnaA04g09170D	AT5G39340	AHP3	[44]
	Bn-A10-p9979372	A10	11010972-11810972	BnaA10g14760D	AT5G20730	NPH4	[45-46]
				BnaA10g14910D	AT5G20570	RBX1	[47]
	Bn-scaff_15712_3-p482620	C01	36607280-39007280	BnaC01g38800D	AT1G74670	GASA6	[48]
				BnaC01g39480D	AT3G08510	ATPLC2	[49-50]
				BnaC01g39680D	AT3G07780	OBE1	[51]
VLR	Bn-scaff_18482_1-p438118	C03	19227499-20627499	BnaC03g32570D	AT3G01240	Unknown
				BnaC03g32770D	AT3G02130	RPK2	[52]
	Bn-scaff_18338_1-p984141	C05	13123225-14423225	BnaC05g19890D	AT1G26960	AtHB23	[53]
	Bn-scaff_18100_1-p1143728	C09	13221586-15921586	BnaC09g17760D	AT5G43940	HOT5	[54]
				BnaC09g18690D	AT5G45550	Mob1	[55-56]
	Bn-scaff_17487_1-p488896	C09	5204230-8162179
	Bn-scaff_17487_1-p475655	C09		BnaC09g09210D	AT2G17040	NAC036	[57]
	Bn-scaff_17487_1-p545307	C09		BnaC09g10040D	AT2G19760	PRF1	[58]
	Bn-scaff_17487_1-p464536	C09		BnaC09g10110D	AT2G20610	SUR1	[59]
	Bn-scaff_17487_1-p383153	C09
	Bn-scaff_17487_1-p512535	C09
VSR	Bn-Scaffold000582-p3247	A01	14313700-14753700	BnaA01g22110D	AT1G60010	Unknown
				BnaA01g22310D	AT1G60420	NRX1	[33]

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3 讨论

角果密度是油菜理想株型的重要因素之一,其构成性状（主花序长度和主花序有效角果数）是影响单株产量的重要因素,主要受多基因控制,遗传率高^{[5,6,7,8,9,10]}。本研究利用60 K SNP芯片对213份油菜的主花序角果密度及其相关性状进行GWAS分析,两年的主花序角果密度及其相关性状的标记并没有发现重复,且标记数目也相差较大,这可能是两年环境差异较大引起的。本研究对主花序角果密度关联分析发现,两年都在A03染色体上检测出显著关联的SNP,且标记之间相距4.4 Mb,说明在A03染色体上有控制主花序角果密度的主效基因;CHEN等^[15]也在A03染色体上检测到与主花序角果密度关联的QTL。本研究两年在C09染色体上检测到与主花序有效长显著关联位点成簇分布,与段秀建^[60]在C09上发现的位点相距约4.4 Mb,这表明在C09染色体上有控制主花序有效长的主效QTL。孙美玉^[61]在两年三环境中重复检测到A01染色体上与主花序有效角果数相关的QTL,与该性状连锁的3个标记（GSSR134、BrSF162-9和BrSF49-32）距离较近,仅相距1 Mb左右,与本研究发现的Bn-Scaffold000582-p3247位点也是相距约1 Mb,认为在A01染色体的该区段内存在控制主花序有效角果数的主效QTL。
通过关联分析,扫描与性状显著关联SNP位点的LD区域,借助拟南芥基因组数据库,筛选到了22个与性状相关的候选基因,其中包含多个位于关联SNP位点处或在位点附近的基因。这些基因部分与赤霉素和生长素等内源激素的合成和信号转导、分生组织或花分生组织以及细胞分裂生长等过程有关。如BnaA01g16940D与拟南芥AT4G28160同源,在花序中表达,编码的富含脯氨酸糖蛋白家族蛋白是细胞壁的组成成分,参与对赤霉素刺激的反应,诱导茎伸长和花发育,通过调控最终角果数目和花序长影响角果密度^[33,34];C01染色体的BnaC01g39480D与拟南芥的AT3G08510（ATPLC2）同源,编码磷酸肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解成肌醇1,4,5-三磷酸和二酰基甘油,参与生长素的生物合成和信号转导,是雌配子发生和胚胎发育所必需的,杂合子plc2-2突变体有角果数较少和胚胎在球状期前停滞与细胞分裂异常的表型^[49,50];BnaA01g16970D与拟南芥ULT1同源,编码B-box 结构域富含Cys（半胱氨酸）蛋白,是分生组织细胞积累在花序和花分生组织的负调节器;ult1突变体使花序分生组织扩大,产生额外的花和花器官,并在花分生组织中表达降低^[35,36];A03染色体的BnaA03g29810D,在拟南芥中的同源基因AT3G07050编码类核干细胞因子1（nucleostemin- like 1,NSN1）,于花序分生组织和花原基中高水平表达,是维持花序分生组织和花器官发育所必需的;NSN1杂合和纯合植株通过形成花冠花而终止花序发育,过表达导致顶端优势丧失和缺陷花的形成^[42,43]。虽然,基因与环境互作导致环境特异关联SNP很难通过分子标记辅助选择促进其他地区油菜增产,但通过基因工程手段对部分高产基因进行操作很可能实现其他地区油菜产量的提升,对中国油菜生产和发展具有重要意义。

4 结论

共检测到17个SNP与主花序角果密度及其相关性状关联,其中与主花序角果密度关联的标记有7个,与主花序有效长关联的标记有9个,与主花序有效角果数相关联的标记仅有1个,这些SNP均为环境特异位点,表明其受基因与环境互作影响。LD区间内调节内源性激素的合成和转导、植物细胞组织发生、花分生组织发育、角果数目和多器官发育基因BnaA01g16940D、BnaA03g29810D、BnaC01g39480D、BnaA01g16970D和BnaC09g09210D等22个候选基因,可能通过上述功能影响油菜花序或角果的发育,导致主花序角果密度及其相关性状的差异。
The authors have declared that no competing interests exist.

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