0 引言
【研究意义】甜樱桃（Prunus avium L.）为蔷薇科李属樱桃亚属植物。大量研究表明甜樱桃富含丰富的营养物质,其中果实中的褪黑素具有提高人体睡眠质量、抗衰老、抗肿瘤等多项生理功能[1]。根据中国园艺学会樱桃分会统计数据显示,2016年,中国甜樱桃种植面积和产量分别为1.8×105 hm2和7×105 t,均居世界第一位,且在中国低纬度地区种植面积不断扩大,如四川、云南、贵州、重庆等省市[2-3]。硒是人体必须的微量元素,在提高人体免疫力、抗癌等方面有着重要的作用[4],缺硒易导致人的山克病和大骨节病,甚至会降低免疫力并引发各种恶性肿瘤[5]。中国是一个缺硒大国,但中国南方等地区硒含量相对较高[6-7],具有发展富硒甜樱桃的地理优势。然而硒不是植物的必须元素,却是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的组成部分。因此,探究外源硒对甜樱桃硒和内源褪黑素含量以及谷胱甘肽氧化还原循环的影响,为富硒樱桃、高褪黑素樱桃的生产提供一定的理论依据。【前人研究进展】水溶性硒是植物吸收的主要形式,主要包括低分子有机硒、硒酸盐和亚硒酸盐。硒酸盐通过硫酸盐转运蛋白进入根系,很快运输到地上部,被还原成亚硒酸盐,进而转化为有机硒的化合物[8-9]。而亚硒酸盐通过磷酸盐转运蛋白和硅转运蛋白进入根系[10-11],在根系中很快转化为有机态,如硒代甲硫氨酸、硒甲基半胱氨酸等,以有机态硒形式运输到地上部[12]。由于采取不同方式进入植物体内,导致植物对不同形态硒的吸收、转运和富集能力有所差异。在还原型谷胱甘肽（GSH）氧化还原循环中,GPX的活性中心是硒代半胱氨酸,它能催化GSH变为氧化型谷胱甘肽（GSSG）,而谷胱甘肽还原酶（GR）能将GSSG还原成GSH。研究表明硒处理能够提高GPX活性和GSH的含量[13-14],进而提高GSH氧化还原循环效率。褪黑素是植物内源物质,既能直接清除活性氧又能间接提高抗氧化酶系统来提高植物的抗逆性。【本研究切入点】适量的外源硒和褪黑素均能提高植物抗氧化酶活性,而GSH氧化还原循环是重要的抗氧化酶系统,因此,硒、褪黑素和GSH氧化还原系统三者之间必有一定的联系。目前,硒转运到地上部对叶片褪黑素的合成代谢和GSH氧化还原循环效率鲜有报道;且外源硒对甜樱桃内源褪黑素含量及谷胱甘肽氧化还原循环的影响缺乏系统研究。【拟解决的关键问题】采用不同价态和浓度的硒处理甜樱桃叶片,通过分析甜樱桃叶片硒和褪黑素含量、GSH氧化还原循环中的GSH和GSSG含量、GSH+GSSG总和、GSH/GSSG比值以及GPX和GR酶活性的动态变化,探究外源硒对褪黑素的含量和GSH氧化循环效率的影响。1 材料与方法
1.1 材料与处理
田间试验处理：于2015年7月在四川广元市昭化区进行,试验材料为田间两年生‘红蜜’和‘布鲁克斯’。为了使土壤Se6+和Se4+达到2.0 mg·L-1,褪黑素含量达到300 μmol·L-1,根据两年生甜樱桃根系分布情况（以根茎为圆心,半径为25 cm,根深为30 cm的圆柱体）计算土壤体积,在傍晚时将分析纯硒酸钠、亚硒酸钠以及褪黑素根据每棵树的施用量溶解在水里进行浇灌处理,每个处理6棵重复,对照组（CK）：清水处理。处理组分别为：（1）：Se4+（2.0 mg·L-1）;（2）：Se6+（2.0 mg·L-1）;（3）：Se4+（2.0 mg·L-1）+褪黑素（300 μmol·L-1）;（4）：Se6+（2.0 mg·L-1）+褪黑素（300 μmol·L-1）。处理30 d后,从6个重复中选取4棵植株进行叶片采集,测量硒和褪黑素含量。硒的不同浓度处理：于2016年7月进行,以重庆綦江两年生‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片为试验材料,试验方法是将带叶片枝条带回实验室,选取成熟一致的叶片迅速将叶柄浸没在0、0.5、1.0、2.0和4.0 mg·L-1的Se6+（来源于硒酸钠）溶液中,每个浓度设置4个重复,每个重复包括2个带叶片枝条。为了防止产生气栓,用剪刀在溶液中剪掉一段叶柄。处理24 h后进行采样,测量叶片硒和褪黑素的含量以及GSH氧化还原循环相关物质和酶。
硒的不同时间处理：于2016年7月进行,试验材料为从两年生‘布鲁克斯’甜樱桃取下的离体叶片,试验方法是将带叶片枝条带回实验室,选取成熟一致的叶片迅速将叶柄浸没在2.0 mg·L-1的Se6+（来源于硒酸钠）溶液里。为了防止产生气栓,用剪刀在溶液中剪掉一段叶柄。在第0、1、2、3、4天进行采样,每个时间点设置4个重复,每个重复包括2个带叶片枝条。测量叶片的硒和褪黑素的含量以及GSH氧化还原循环相关物质和酶。
1.2 测量项目与方法
1.2.1 硒含量的测量 硒元素的测量采用原子荧光光度法,将烘干样品委托青岛科标检测研究院有限公司进行测量。1.2.2 褪黑素含量的测量 根据国家标准GB/T5009. 170—2003测量叶片褪黑素的含量。将样品委托青岛科标检测研究院有限公司进行测量。
1.2.3 GSH氧化还原循环相关物质和酶的测量 还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽还原酶（GR）委托青岛科标检测研究院有限公司进行测量。具体方法均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法测定（ELISA）,用酶标仪（Rayto RT-6100）和各种物质和酶的ELISA检测试剂盒进行测量。进而计算出GSH+GSSG 和 GSH/GSSG的比值。
1.3 数据处理
每个处理4个重复,利用Origin8.5软件作图和数据分析,其中差异显著性分析采用LSD法。2 结果
2.1 根施不同价态硒对‘红蜜’和‘布鲁克斯’甜樱桃叶片褪黑素含量的影响
清水对照处理中,‘红蜜’叶片褪黑素含量最高为1.3 mg·kg-1,Se4+和Se6+处理褪黑素含量分别显著降低了53.7%和50.7%。Se6++褪黑素处理比Se6+处理叶片的褪黑素含量高22.5%,Se4++褪黑素处理比Se4+处理叶片的褪黑素含量高22.4%,但差异均达不到显著水平（图1-A）。根施Se4+和Se6+分别比对照显著降低了‘布鲁克斯’褪黑素含量,而Se6++褪黑素处理比Se6+处理叶片的褪黑素含量高168.4%,Se4++褪黑素处理比Se4+处理叶片的褪黑素含量高239.6 %,均达到显著水平（图1-B）。此外,Se6+处理下‘红蜜’和‘布鲁克斯’叶片褪黑素含量高于Se4+处理,但未达到显著水平。从叶片硒含量上看,‘红蜜’叶片硒含量在对照处理下未检出,Se4+处理下‘红蜜’硒含量低,仅为0.03 mg·kg-1,且与对照差异不显著。Se6+处理下‘红蜜’硒含量为4.2 mg·kg-1。Se4++褪黑素和Se6++褪黑素处理下‘红蜜’硒含量分别上升至0.2和4.3 mg·kg-1（图1-C）。‘布鲁克斯’甜樱桃叶片在对照处理下硒含量未检测出,而Se4+和Se6+处理下叶片硒含量显著上升。Se4++褪黑素和Se6++褪黑素处理下‘布鲁克斯’硒含量也分别上升（图1-D）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1Se4+和Se6+处理对‘红蜜’和‘布鲁克斯’甜樱桃叶片褪黑素、硒含量的影响(（1）：Se4+（2.0 mg·L-1）;（2）：Se6+（2.0 mg ·L-1）;（3）：Se4+（2.0 mg·L-1）+褪黑素（300 μmol·L-1）;（4）：Se6+ （2.0 mg·L-1）+褪黑素（300 μmol·L-1） 不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同)
-->Fig. 1The effects of Se4+ and Se6+ treatment on leaf melatonin and Se contents of ‘Hongmi’ and ‘Brooks’((1): Se4+ (2.0 mg·L-1); (2): Se6+ (2.0 mg·L-1); (3): Se4+ (2.0 mg·L-1) + melatonin (300 μmol·L-1); (4): Se6+ (2.0 mg·L-1) + melatonin (300 μmol·L-1). Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05). The same as below)
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2.2 不同时间处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片褪黑素和硒含量的影响
‘布鲁克斯’离体叶片在清水处理（CK）和2.0 mg Se6+·L-1处理0、1、2、3、4 d,CK处理叶片褪黑素含量随着处理时间的延长迅速从2.3 mg·kg-1增加到11.4 mg·kg-1。而Se6+处理下褪黑素在第1天时出现一个峰值为4.54 mg·kg-1,且显著高于对照,而在第2天褪黑素含量下降到最低（1.53 mg·kg-1）后又呈现出缓慢上升的趋势,并在第4天达到3.04 mg·kg-1。甜樱桃叶片在Se6+处理1 d后褪黑素含量显著低于对照处理（图2-A）。‘布鲁克斯’离体叶片硒含量随着时间处理呈现出先快速上升后缓慢下降的趋势。即甜樱桃叶片在处理第2天时硒含量达到最高值为10.6 mg·kg-1,之后缓慢下降,第4天时下降到9.1 mg·kg-1（图2-B）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同时间处理离体‘布鲁克斯’甜樱桃叶片褪黑素和硒含量的动态变化
-->Fig. 2The dynamic change of ‘melatonin and Se contents in Brooks’ vitro leaves under different time treatments
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2.3 不同浓度Se6+处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片褪黑素和硒含量的影响
从图3-A中可以看出,甜樱桃离体叶片褪黑素含量随着Se6+浓度的增加呈现出上升的趋势。在0.0—1.0 mg·L-1,褪黑素含量从2.33上升到2.83 mg·kg-1,当硒浓度在1.0—4.0 mg·L-1时,离体叶片褪黑素含量迅速增加并在4.0 mg·L-1时含量达到8.67 mg·kg-1。甜樱桃离体叶片硒含量也随着Se6+浓度的增加而增加（图3-B）,硒浓度在0.0—2.0 mg·L-1浓度下,离体叶片硒含量从0.20 mg·kg-1增加到4.68 mg·kg-1,当硒浓度在2.0—4.0 mg·L-1时,离体叶片硒含量急速增加,在4.0 mg·L-1硒处理时叶片硒含量最高。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3不同Se6+浓度处理‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片褪黑素和硒含量的动态变化
-->Fig. 3The dynamic change of melatonin and Se contents in ‘Brooks’ vitro leaves under different Se6+ concentrations treatment
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2.4 不同时间处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片谷胱甘肽氧化还原循环的影响
对照处理中甜樱桃叶片的GSH下降,在第2天达到最低值（2.15 μmol·g-1）后又缓慢上升,而Se6+处理甜樱桃GSH在第1天降到最低值（2.14 μmol·g-1）后又缓慢上升并高于对照处理。对照处理GSSG含量在第2天达到最低值（0.16 μmol·g-1）后又迅速上升,Se6+处理下GSSG含量下降并在第2天达到最低值后又上升且低于对照。从谷胱甘肽总量上看,对照和Se6+处理GSH+GSSG总量均呈现出先下降后又缓慢上升趋势。对照在第2天降到最低,而Se6+处理在第1天达到最低值后缓慢上升并超过对照。无论对照还是Se6+处理GSH/GSSG比值均随着时间延长而呈现出下降的趋势,且Se6+处理下的GSH/GSSG比值高于对照处理。在GSH氧化还原循环系统中的酶活性变化趋势中,对照GPX活性在第1天上升后又缓慢下降,到第4天又上升,而Se6+处理下GPX酶活性在第1天下降到最低值后又上升并超过对照。无论对照还是Se6+处理GR活性随着时间处理表现出先上升后下降的趋势。在第2天对照GR活性显著高于硒处理,而第3天Se6+处理GR活性又显著高于对照（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4不同时间Se6+处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片谷胱甘肽氧化还原循环的影响(*表示处理间差异显著（P<0.05） * show significant differences between treatments (P<0.05))
-->Fig. 4The effects of different time Se6+ treatments on glutathione redox cycle in sweet cherry ‘Brooks’ vitro leaves
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2.5 不同Se6+浓度处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片谷胱甘肽氧化还原循环的影响
随着硒浓度的增加甜樱桃离体叶片GSH含量从2.9 μmol·g-1下降到2.3 μmol·g-1,但处理间差异均未达到显著水平。GSSG含量也随着硒浓度的增加而呈现出下降的趋势,且在2.0和4.0 mg·L-1时,Se6+处理显著低于清水对照处理。GSH+GSSG总和变化趋势与GSH和GSSG的变化趋势一致,且2.0和4.0 mg·L-1 Se6+处理下的谷胱甘肽的总量显著低于对照。GSH/GSSG的比值随着硒浓度的增加而降低,2.0和4.0 mg·L-1 Se6+处理下的比值显著低于对照。GSH氧化循环系统中的GPX主要是将GSH氧化成GSSG,其活性随着硒浓度的增加呈现出下降的趋势,在2.0和4.0 mg·L-1Se6+处理下GPX活性显著低于其他浓度处理,且两者之间差异不显著。GR在GSH氧化循环系统中将GSSG还原成GSH,其活性受硒的浓度影响不大,浓度处理间差异不显著（图5）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5不同浓度Se6+处理对‘布鲁克斯’甜樱桃离体叶片谷胱甘肽氧化还原循环的影响
-->Fig. 5The effects of different Se6+ concentrations treatments on glutathione redox cycle in sweet cherry ‘Brooks’ vitro leaves
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3 讨论
3.1 外源硒调控甜樱桃叶片褪黑素的含量
褪黑素与生长素有相似的结构和功能,其能够在组织体内自由移动,可直接清除自由基,且对光照敏感,因此褪黑素被定义成植物生长调节剂和生物刺激剂[15-16]。甜樱桃属于褪黑素含量较高的水果,鲜果果实褪黑素含量高达350 mg/100 g,制造的果酒褪黑素含量高达0.7 mg·mL-1[16-17]。不同品种甜樱桃果实褪黑素含量也有差别[18],而本研究中甜樱桃‘红蜜’和‘布鲁克斯’叶片褪黑素含量差异不显著。本研究中测量部位均为甜樱桃叶片,因此测量部位不同也会影响甜樱桃褪黑素的含量,此外,园艺作物中褪黑素的含量除了受品种影响外,外界生长环境、栽培方式等因素均会影响褪黑素的含量[19]。外源施入褪黑素能够提高黄瓜抗高温胁迫能力[20],缓解干旱胁迫对番茄幼苗光合能的抑制[21],抗黄瓜重茬[22]等。其中,在模拟黄瓜重茬试验中,对照施用对羟基本甲酸显著降低了植物体内的褪黑素含量,而施用外源褪黑素能够提高抗性,证明褪黑素在提高植物抗性方面有所损耗。王蕊等[23]结合国内外研究得出相比于植物褪黑素的合成,其代谢过程要复杂得多,在严重的胁迫条件下与自由基互作可能是褪黑素降解的主要途径。在本研究中,田间施硒处理甜樱桃叶片褪黑素含量显著低于对照,而硒+褪黑素处理能弥补硒处理导致叶片褪黑素下降。此外,本研究中的Se6+时间处理中后期也是显著降低了褪黑素的含量。由此可知,甜樱桃在特定的硒处理下降低了褪黑素含量。硒不是植物的必须元素,大量研究表明硒是植物有益元素,适量硒能够提高植物抗逆性、农作物产量和品质[24-25],而高浓度硒却抑制生长、降低作物产量甚至产生硒中毒。不同植物对四价硒和六价硒的吸收、转运机制存在差异。田间试验和离体试验表明四价硒和六价硒处理均能够提高甜樱桃硒含量,且六价硒的效果显著高于四价硒处理,这与小白菜[26]、烟草[27]等研究结果一致。ANGRADI和TZILKOWSKI[28]指出亚硒酸盐处理黑樱桃半致死率叶片硒含量为10 mg·kg-1。本研究在田间试验中,两种甜樱桃在对照和施硒的树势基本一致（数据未提供）,叶片未发生中毒现象。当在离体时间试验处理的第2天甜樱桃叶片硒含量达到10.6 mg·kg-1后不再上升反而下降,并随着时间的延长叶片出现坏死斑等中毒现象越来越严重,此时褪黑素的含量也随之迅速下降。而在不同浓度六价硒处理第1天,甜樱桃叶片的硒含量和褪黑素随着硒浓度的增加而迅速增加,且未发生萎蔫、坏斑等中毒现象。LI等[29]研究也指出外源硒通过诱导褪黑素的合成来提高番茄抵抗胁迫的能力。由此可知,适当的硒处理能够提高褪黑素的含量。
3.2 硒影响GSH氧化还原循环效率
硒是植物体中一些抗氧化酶（GPX）和硒-P蛋白的重要组成部分,适量的硒能够诱导GPX的活性,增加GSH含量,进而提高GSH氧化循环效率和植物抗逆水平[13,30-31]。当植物处于高硒水平环境时,硒就成了一种胁迫因子,可能会诱导植物产生大量的活性氧,进一步刺激产生更多的抗氧化物质来抵御胁迫行为[32]。在本研究中Se6+处理离体甜樱桃叶片第1天GPX、GR活性,GSH、GSSG含量均低于对照,且随着硒浓度的增加而加剧。这也许是离体甜樱桃瞬间进入不同浓度硒处理下不能快速适应环境导致GSH氧化还原循环效率低于对照。WU等[14]研究表明较多的外源硒能够增加植物的GSH含量和GR活性。GR的催化反应有利于维持细胞中GSH的含量,保持较高的GSH/GSSG比率,该比值更能体现植物的抗氧化能力水平[33]。GSH+GSSG反映出谷胱甘肽的总量,GSH可以直接与活性氧反应,也可以通过GSH氧化循环或者抗坏血酸-GSH循环来清除活性氧[34]。当甜樱桃离体叶片适应不同浓度硒处理后,GSH氧化循环系统中的酶活性和物质含量以及GSH/GSSG比值均高于对照。表明甜樱桃离体叶片处理前期降低了GSH氧化还原循环效率,当离体叶片甜樱桃适应环境后,随着时间的延长,GSH氧化循环效率逐渐高于对照。这也表明外源硒提高GSH氧化循环效率具有一定的延迟性。4 结论
田间根施不同价态硒均能够提高甜樱桃叶片硒含量,且六价硒处理显著高于四价硒。在离体叶片处理下,甜樱桃叶片硒含量随六价硒浓度的增加而增加,而随着硒处理时间的延长,叶片硒含量呈现出先上升后缓慢下降的趋势。田间根施四价和六价硒均降低了甜樱桃褪黑素的含量。在离体叶片硒处理第1天提高了褪黑素的含量,随时间延长,硒处理降低了褪黑素含量。在GSH氧化循环中,不同浓度硒处理导致离体甜樱桃叶片GSH氧化还原循环效率下降,但随着处理时间的延长,GSH氧化还原效率上升并超过对照。因此,外源硒能够调控甜樱桃叶片褪黑素的含量,而外源硒对谷胱甘肽氧化还原循环效率提高具有一定的延迟性。The authors have declared that no competing interests exist.
