0 引言
【研究意义】油菜素内酯（BR,Brassinosteroid）是国际上公认的六大植物激素之一,可调控株高、改良株型、促进根系生长、提高抗逆性、降低农药残留以及改良品质等功效。在中国大步迈入农业现代化进程中,更深入诠释BR调控农作物生长发育的机制和有效利用BR具有重要的理论意义和农业实践价值。【前人研究进展】在农业生产中,从种子萌发到收获的过程中都有应用BR的相关报道[1-3],即BR可以用以拌种、浸种或喷施。在中国,BR主要在经济作物（如棉花）上应用较多,可提高棉花的产量和棉纤维的质量[4]。在粮食作物上（如小麦、玉米和水稻）中BR影响作物生长发育和产量形成的机制研究不够深化,但研究表明BR可调控产量,在水稻中转入BR合成途径中编码C-22羟基化酶的基因,促进BR的合成,可增加水稻的分蘖数、每穗粒数和千粒重,从而提高水稻的产量[5]。而且BR可增强植物的抗逆性、降低农药残留[6-8],因此,BR是具有广阔应用前景的化控激素。光合作用是作物产量形成的基础及决定性因素,同时也是碳循环及其他物质循环的最重要环节[9]。高等植物固定CO2的途径有3条：C3途径（卡尔文循环）、C4途径和景天酸代谢途径。玉米中主要是C4途径。玉米固定CO2最初的稳定产物是四碳二羧酸化合物（苹果酸和天冬氨酸）,故称为四碳二羧酸途径（C4-dicarboxylic acid pathway）,简称C4途径（C4 pathway）,具有C4途径的植物称为C4植物。C4途径的生化过程是：空气中的CO2进入叶肉细胞后在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenol plyruvate carboxylase,PEPC）催化下,被磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol plyruvate,PEP）固定在草酰乙酸（oxaloacetic acid,OAA）的C4羧基上,因此PEPC是C4植物固定CO2的关键酶,PEPC是胞质酶,主要分布在叶肉细胞的细胞质中[10]。作物高产不仅需要高的叶片光合能力,还需要光合产物及时的运输分配[11]。淀粉和蔗糖是光合作用的主要产物,光合作用制造的三碳糖可以在叶绿体中合成淀粉,贮存起来;也可以运出叶绿体在细胞质中合成蔗糖,蔗糖是有机物运输的主要形式,为植物体的其他器官提供能源和原料[12]。与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）,与淀粉积累速率和灌浆速率呈显著相关性[13]。高温可降低SPS和SS合成活性,导致糖分含量降低品质变劣[14];刘鹏等[15]对玉米籽粒发育过程中蔗糖代谢和淀粉合成相关酶活性研究发现,蔗糖积累的原因主要是蔗糖合成能力增加而非降解量减少。【本研究切入点】油菜素内酯能显著提高植物的光合性能,但BR对玉米调控光合性能的机理尚未有系统研究,本项目针对调控C4途径同化CO2的调控因素,研究油菜素内酯调控C4途径的生理机制,以期在生产上高效利用BR,提高作物的光能利用率。【拟解决的关键问题】解析油菜素内酯对玉米叶片捕光能力、CO2的固定能力和光合产物的积累、代谢及运输的影响。1 材料与方法
1.1 试验材料
玉米品种是郑单958,由河南省农业科学院粮油作物研究所选育,具有高产、稳产、多抗特性,是农业部重点推广品种。1.2 试验设计
玉米的培养条件为28℃、12 h光照;20℃、12 h黑暗。试验所用油菜素内酯为人工合成的24-表油菜素内酯（24-Epicastasterone,24-eBL）。采用叶面喷施的方法,在玉米8叶期叶面喷施前期预实验选定的浓度为100 nmol·L-1的24-eBL,每株20 mL,全株均匀喷施。喷施BR后15 d,选取第8位叶片进行各项指标的观测和分析。1.3 测定项目及方法
1.3.1 光合速率的测定 采用的红外线CO2分析仪法[16]和LI-6400便携式光合测定仪（LI-COR,美国）分别测定第8位叶片的叶片净光合速率（Pn）。1.3.2 叶绿素含量的测定 叶绿素含量的测定采用的是分光光度计法[16]。
1.3.3 PEPC活性的测定 酶的提取和活性的测定采用的是分光光度计法[17-18]。取玉米叶片0.5 g,加入预冷的提取缓冲液（100 mmol·L-1 Tris-HCl,5%甘油,10 mmol·L-1 巯基乙醇,1 mmol·L-1 EDTA,1% PVP,pH 8.2）3 mL,冰浴研磨成匀浆,4℃ （15 000×g）离心20 min,用分光光度法测定上清液PEPC活性。
1.3.4 叶片超微结构观察 按照常规的电镜超薄切片制作及观察方法[19]制备超薄切片,透射电子显微镜下观察叶绿体超微结构及韧皮部疏导组织细胞。
1.3.5 蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性测定 蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定采用的是刘鹏等[15]的方法。蔗糖合成酶（SS）活性参照赵智中等[20]的方法。
2 结果
2.1 油菜素内酯处理对叶片净光合速率的影响
光合速率是判断光合作用强弱的一个指标,油菜素内酯处理后玉米叶片的净光合速率为37.56 μmol CO2·m-2·s-1,对照叶片净光合速率为28.32 μmol CO2·m-2·s-1,油菜素内酯处理可提高叶片净光合速率32.6%,差异极显著（图1）。这说明BR处理可增强玉米叶片的光合作用。2.2 油菜素内酯处理对玉米叶片叶绿素含量的影响
为深入阐明BR提高光合速率的生理机制,本试验比较了BR处理对叶片叶绿素含量的影响。因为叶绿素具有接受和转换能量的作用,在一定范围内,叶绿素含量越多,光合作用越强。图2显示,BR处理15 d后叶片叶绿素含量是0.27 mg·g-1 FW,对照叶片叶绿素含量为0.21 mg·g-1 FW,高出对照28.57%,达显著性差异。这说明BR能提高玉米光合色素含量,提高玉米叶片的聚光能力,提高光能利用率。
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-->Fig. 1Effect of BR on net photosynthetic rate in maize leaves
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-->Fig. 2Effect of BR on chlorophyll content in maize leaves
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2.3 油菜素内酯处理对玉米叶片光合作用中CO2固定的关键酶PEPC活性的影响
植物光合作用所需要的碳源,主要是空气中的CO2,对CO2的固定能力是影响光合速率非常重要的因素,PEPC是玉米碳同化过程的关键酶,PEPC活性的高低直接决定了玉米叶片CO2固定能力的强弱。本研究分析了BR处理8叶期玉米15 d后玉米叶片中PEPC的活性。结果表明,BR处理后玉米叶片PEPC的活性为57.36 μmol CO2·h-1·mg-1,而对照叶片PEPC的活性为49.03 μmol CO2·h-1·mg-1,BR处理后PEPC的活性提高了14.52%（图3）。因此,BR可提高玉米叶片固定CO2的能力。
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-->Fig. 3Effect of BR on activity of PEPC in maize leaves
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2.4 油菜素内酯处理对玉米叶片叶绿体和韧皮部疏导组织细胞超微结构的影响
叶片光合作用产生的同化产物主要是通过韧皮部进行运输,因此韧皮部组织细胞中内含物的多少在一定程度上可反应光合产物的运输情况。叶片光合作用产生的有机物在叶绿体中形成淀粉,因此叶绿体中淀粉粒的多少也是反应光合效率的一个指标。本研究利用透射电子显微镜比较分析了BR处理对玉米叶片疏导组织细胞超微结构及叶绿体中淀粉粒积累的影响。结果表明,对照叶片叶肉细胞的叶绿体呈梭形紧贴于细胞壁的内侧（图4-A）,叶绿体基质和基粒片层整齐有序,类囊体紧密排列而整齐（图4-C）;BR处理后叶绿体横轴方向增大,叶绿体基质丰富,淀粉粒积累增加（图4-B,D）。BR处理后韧皮部输导组织的细胞内含物增加（图4-A,B）,说明BR处理可能促进了韧皮部细胞的代谢和有机物的运输。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4BR处理对玉米叶片超微结构的影响
-->Fig. 4Effect of BR on cell ultra-structure of maize leaf
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2.5 油菜素内酯处理对玉米叶片蔗糖代谢关键酶活性的影响
蔗糖是光合作用产物的主要运输形式,蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的关键酶,其活性可反映同化物向籽粒运输能力和强度。本研究测量了BR处理后与对照叶片中SS和SPS的活性,结果表明对照叶片的SS和SPS的活性分别是609.43和598.05 μg·min-1·g-1FW,而BR处理15 d后,玉米叶片中SS和SPS的活性分别是781.65和778.67 μg·min-1·g-1FW（图5）,BR处理后SS和SPS的活性分别提高了28.26%和30.20%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5BR处理对玉米叶片SS和SPS酶活性的影响
-->Fig. 5Effect of BR on activity of SS and SPS in maize leaves
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3 讨论
水稻初花期喷施BR可显著提高水稻叶片叶绿素和淀粉含量、增强光合速率[1]。WU等[5]研究发现BR能促进水稻光合同化物从源向库的转运。在小麦花期喷施BR可提高小麦ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性[21]。淀粉需通过焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶催化的连续反应生成。上述研究结果说明BR可促进籽粒中淀粉的合成及和积累。籽粒中淀粉的合成需要原料,叶片中产生的光合产物的主要运输形式是蔗糖,蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶主要负责降解卸载到籽粒中的蔗糖,从而为淀粉合成提供原料,同时光合产物从叶片中输出的快慢也直接影响光合速率[11]。本研究结果表明BR处理可显著提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性,说明BR可促进卸载到籽粒中蔗糖的降解,为淀粉的合成提供更多的原料。结合水稻和小麦中的研究结果,可以阐明BR促进光合产物从源向库转运的生理机制为BR通过提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性,快速降解从叶片运输到籽粒中蔗糖,保障合成淀粉的原料需求;BR处理提高了ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性,加快淀粉的合成,加快消耗从叶片运来的蔗糖,促进光合产物从源向库转运,防止蔗糖积累对光合效率的抑制作用。光合速率的提高需要更多的光能和光合作用原料CO2的供给。叶绿素在光合作用中参与光能的吸收、传递和转换作用,叶绿素含量提高可以提高光合效率。已有研究表明BR处理可诱导编码叶绿素生物合成和光合酶活性的特定基因的表达[22-24]。本研究发现,与对照相比,BR处理会促进玉米叶片的叶绿素含量上升,这说明BR确实促进了叶绿素生物合成途径,促进了叶绿素的合成。玉米是C4植物,C4途径的CO2固定最初是由PEPC催化来完成的。PEPC起着“CO2泵”的作用,把外界的CO2“压”进维管束鞘用于有机物的同化[25-26]。本研究发现,BR处理可提高玉米叶片PEPC的活性,因而可以增加玉米叶片捕捉CO2的能力,增加光合作用的原料,形成更多的光合产物。
4 结论
油菜素内酯（BR）通过提高玉米叶片叶绿素含量,提高玉米叶片增强叶片的光能吸收和转化能力,从而提高光能利用率;通过提高PEPC的活性,提高玉米叶片捕捉固定CO2的能力,为光合作用提供更多的原料;通过提高蔗糖合成酶和磷酸蔗糖合成酶活性,快速降解光合产物的主要的运输形式蔗糖,为淀粉的合成和积累提供充足的原料,最终提高玉米叶片的光合速率和效率。（责任编辑 杨鑫浩）
The authors have declared that no competing interests exist.
