0 引言
【研究意义】苹果（Malus domestica）作为一种世界性的水果,具有营养丰富,口感佳以及产量高等特点[1]。苹果的栽培和生长受到多种植物激素的调控。其中,细胞分裂素在调节植物生长发育过程中发挥重要作用[2-3]。CRFs（cytokinin response factors）属于细胞分裂素响应因子,它们在响应细胞分裂素信号,调节叶片发育以及抗逆过程中都发挥着关键作用[4-5]。因此,明确细胞分裂素响应因子的功能对于研究细胞分裂素信号途径和调节果树生长发育具有重要意义。【前人研究进展】细胞分裂素（cytokinin）是植物生长发育所必需的激素之一,在促进植物细胞分裂过程中发挥重要作用[6]。未完全纯化的细胞分裂物质最早由Miller在1961年从玉米中分离。随后,Letham在1963年从未成熟玉米种子中分离并纯化出天然的细胞分裂素-玉米素（ZR）。如今,30多种具有活性的天然细胞分裂素在不同植物中被陆续发现[7]。细胞分裂素在植物中存在着广泛的生物学效应,如诱导芽的分化[8],促进果实和种子发育[9],延缓植物衰老[10],调控非生物胁迫[11],影响花青苷积累[12-13]等。在苹果生产中应用外源植物细胞分裂素可以影响植株成花、坐果和果实发育[14]。此外,在果实膨大期对叶片喷施细胞分裂素可以提高叶片和果实的抗氧化活性,改善果品品质[15-16]。目前,对细胞分裂素的信号响应和转导机制已有了较清晰的认识。研究发现,组氨酸激酶AHKs作为膜受体,能够感受细胞分裂素信号;而组氨酸转移磷酸化蛋白AHPs,通过磷酸化反应,可以将信号传导至细胞核中,进而激活核内的信号响应因子[17-18]。CRFs被证实是一类重要的细胞分裂素响应因子[19-20]。通过对近百种植物的CRFs氨基酸序列进行比对分析,发现CRFs蛋白的N端都含有保守的CRF结构域,在C端都含有保守的AP2/ERF结构域[20]。作为典型的AP2/ERF转录因子,CRFs蛋白能够结合到下游靶基因的GCC（AGCCGCC）或者DRE（〔A/G〕CCGAC）序列,进而调节基因的表达[21]。研究发现拟南芥CRF家族基因参与多种胁迫过程。AtCRF4受冷胁迫诱导并且参与抵抗冷胁迫[22]。在拟南芥中超表达AtCRF5显著提高植株抗病性[23]。AtCRF6响应多种非生物胁迫,并且抑制叶片衰老[24]。AtCRF8受到低磷诱导[25]。此外,SHI等[26]对番茄CRF家族进行了分析,发现核定位的CRFs在番茄植物中组成型表达,并且受到多种激素和盐胁迫响应。杨昌[27]也对甘蓝型油菜CRF家族基因进行了初步分析,发现SlCRF8s在调节甘蓝型油菜体内磷稳态方面发挥关键作用。【本研究切入点】虽然目前关于细胞分裂素响应基因CRFs已有较多研究,但是主要集中在拟南芥、番茄等模式植物。在苹果等多年生木本植物中未见报道。【拟解决的关键问题】在苹果中克隆细胞分裂素响应因子基因MdCRF6,对比分析其与拟南芥AtCRF6的同源性。检测其对细胞分裂素和盐的响应以及作为转录因子对启动子DRE序列的绑定,进而明确其与拟南芥AtCRF6的功能保守性。通过转基因分析初步揭示MdCRF6在调节花青苷积累和盐胁迫过程中的重要作用。1 材料与方法
试验于2016—2017年在山东农业大学园艺科学与工程学院果树分子生物技术实验室进行。1.1 试验材料
试验所用到的植物材料有‘嘎啦’（‘Gala’）苹果幼苗、‘王林’（‘Orin’）苹果愈伤组织。对‘嘎啦’苹果幼苗分别用10 μmol∙L-1细胞分裂素（N6-benzyladenine,BA）或100 mmol∙L-1 NaCl溶液浇灌处理,间隔时间段取样,液氮速冻后保存备用。‘王林’苹果愈伤组织用来进行遗传转化。苹果愈伤组织放置在继代培养基（MS培养基+1.5 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA）室温（24℃）、暗处培养。并且每隔15 d更新继代一次。
1.2 基因克隆与同源性分析
根据在苹果基因组数据库中检索到的序列设计引物（表1）,以‘嘎啦’幼苗的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,32个循环;72℃后延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带,连接到克隆载体pMD18-T进行测序。Table 1
表1
表1本研究中所用引物
Table 1Primer sequences used in this study
| 引物名称 Primer name | 序列 sequence (5′ to 3′) |
|---|---|
| MdCRF6-F | GGATCCATGAATCGTCCTGCTGTTAAG |
| MdCRF6-R | GTCGACTAGCGCAACCAGAGGATCGGA |
| MdCRF6(qRT)-F | ATTCCGGCGACGGGTCGCACAACC |
| MdCRF6(qRT)-R | GACAAACAGGTCACCCAAGTTTCC |
| MdDFR(qRT)-F | GTTGAGGGAGATAGGGTTTGAG |
| MdDFR(qRT)-R | GGTAAATGTAAAACAATAGAGAGG |
| MdUFGT(qRT)-F | GGAAGTGGTTTTGTCGCCTG |
| MdUFGT(qRT)-R | CATTATTATTGAGCAACGAACAGC |
| MdF3H(qRT)-F | GCCGATCACCTACACCGAG |
| MdF3H(qRT)-R | GTACAAGAAGTGGGAAGGC |
| MdCHI(qRT)-F | GCTACAAATGCGGTGATAG |
| MdCHI(qRT)-R | CGCCTCCACTACAACCTCC |
| MdCHS(qRT)-F | GGCAAGTGCTGTCGGATT |
| MdCHS(qRT)-R | CCCAAAGAAATAACCACAAG |
| MdSOS1(qRT)-F | CCAGAGAAAACAAAAG |
| MdSOS1(qRT)-R MdSOS2(qRT)-F MdSOS2(qRT)-R MdSOS3(qRT)-F MdSOS3(qRT)-RT | CGCATTCACTTGTCTCCAT AGGGACGGCCACCTTC CTGCCGATTTCTCAGT GGTGTGAATGTGAAGATGAT CACAACTGACTCGACG |
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从拟南芥数据库（http://www.arabidopsis.org/）中检索并下载拟南芥细胞分裂素响应基因（AtCRF1—AtCRF12）的核酸和蛋白序列。通过MEGA 5.0软件构建系统进化树。使用DNAMAN软件进行序列比对。使用SMART软件预测MdCRF6的蛋白结构。
1.3 RNA的提取与实时荧光定量PCR分析
使用天根生化科技有限公司的Plus植物总RNA提取试剂盒（DP437）提取苹果幼苗及愈伤组织的RNA。以提取的RNA为模板,按照Clontech SMARTTM Library试剂盒说明书进行反转录,合成cDNA第一链。以MdACTIN (GenBank accession number：CN938024) 为内参基因,使用Ultra SYBR Mixture试剂盒（康为世纪）进行实时荧光定量PCR分析。荧光定量PCR使用的仪器为BIO-RAD IQ5,所有PCR都设3个循环。PCR反应体系：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL,cDNA 1.0 μL,加去离子水至20 μL。PCR反应程序：94℃预变性10 min,94℃变性15 s,56℃退火15 s,65℃延伸15 s,40个循环,每次循环第2步进行荧光采集。最后采用2-△△CT法进行定量数据分析。所用的定量引物见表1。
1.4 原核表达及电泳迁移率试验（EMSA）
构建原核表达载体pGEX-MdCRF6,将连接产物转化大肠杆菌BL21中。加入0.5 mmol·L-1 IPTG 6 h后收集菌体,超声波破碎后进行SDS-PAGE检测。诱导获得的活性蛋白GST和GST-MdCRF6用来进行后续试验。生物素标记的结合探针-GCAAGATTTAACCGA CCCAAACCGAT-和突变探针-GCAAGATTTACCGG AGCCAAACCGAT-由生工生物工程有限公司（上海）合成。使用Lightshift Chemiliminescent EMSA 试剂盒（Thermo,USA）进行电泳迁移率试验。EMSA反应体系：1×binding buffer（2.5%甘油,50 mmol∙L-1 KCl,5 mmol∙L-1 MgCl3,10 mmol∙L-1 EDTA）2 μL,GST蛋白或GST-MdCRF6融合蛋白10 μL,探针1 μL,室温孵育25 min。未标记的探针作为竞争探针。具体方法参照AN等[28]。
1.5 超表达载体构建及苹果愈伤组织转化和鉴定
利用引物中引入的BamH I和Pst I酶切位点,将MdCRF6从pMD18-T载体切除回收。并对pCAMBIA1300进行同样酶切,将两者在16℃连接,转化大肠杆菌,鉴定阳性单菌落。成功构建MdCRF6-pCAMBIA-1300超表达载体。将MdCRF6-pCAMBIA-1300转化农杆菌LBA4404。取10 d左右生长状态良好的苹果愈伤组织与转化的农杆菌室温孵育20 min。将愈伤组织纱网过滤并吸干表面的菌液,置于继代培养基上培养1—2 d。随后,将苹果愈伤组织转移至筛选培养基（继代培养基+100 mg·L-1潮霉素+500 mg·L-1头孢霉素）。PCR检测得到的阳性转基因愈伤组织,在筛选培养基上继代三代以上,进行后续试验。
1.6 苹果愈伤组织着色试验
选择生长状态一致的野生型（WT）和转基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）苹果愈伤组织进行着色试验。将愈伤组织放置到强光（光子通量密度约为100 μmol·s-1·m-2）、低温（13℃）培养箱内进行培养,观察愈伤着色情况。使用乙醇-HCl法提取苹果愈伤组织的花青苷。使用花青苷提取液（95%无水乙醇+1.5 mol∙L-1 HCl）提取苹果愈伤组织内的花青苷。提取过程在暗处进行。使用分光光度计检测吸光度并计算花青苷含量。计算公式：OD=（A530-A620）-0.1×(A650-A620)。
1.7 苹果愈伤组织盐胁迫试验
选择生长状态一致的野生型（WT）和转基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）苹果愈伤组织进行盐胁迫试验。将大小一致的愈伤放置到含有不同NaCl浓度的继代培养基上。常温、暗处培养15 d,观察并称量愈伤组织的质量。1.8 统计学分析
使用R（3.0.2）软件进行统计学分析。所有结果都是基于3个平行试验的平均值。2 结果
2.1 苹果MdCRF6的克隆及同源性分析
以‘嘎啦’幼苗的cDNA为模板,MdCRF6-F/R为引物进行PCR扩增,获得一条大约1 000 bp的条带（图1）。对克隆得到的片段测序分析,结果表明,该基因片段的开放阅读框（ORF）长度为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白质,命名为MdCRF6 （MDP0000783818）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1苹果MdCRF6的RT-PCR扩增产物电泳
-->Fig. 1Electrophoresis of RT-PCR products for MdCRF6 cloning
-->
将苹果MdCRF6氨基酸序列与拟南芥中12个细胞分裂素响应因子基因（AtCRF1—AtARF12）的氨基酸序列进行比对并构建进化树（图2）。进化树分析结果表明,苹果MdCRF6与拟南芥AtCRF6亲缘关系最近,同源性最高。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2苹果MdCRF6与拟南芥CRFs的进化树分析
At：拟南芥 Arabidopsis thaliana;Md：苹果 Malus domestica
-->Fig. 2Phylogenetic tree analysis of MdCRF6 with CRFs from Arabidopsis
-->
对苹果MdCRF6的氨基酸序列进行分析（图3）。结果显示,MdCRF6仅包含一个外显子,无内含子。MdCRF6蛋白在N端包含一个保守的CRF结构域,在C端包含一个保守的AP2/ERF结构域。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3苹果MdCRF6蛋白功能域分析
-->Fig. 3Functional domains analysis of MdCRF6
-->
2.2 苹果MdCRF6的表达分析
对‘嘎啦’苹果幼苗分别用10 μmol∙L-1 细胞分裂素（N6-benzyladenine,BA）或100 mmol∙L-1 NaCl溶液浇灌处理,间隔时间段取样（整株）。实时荧光定量PCR分析MdCRF6对细胞分裂素和NaCl的响应。结果表明,在细胞分裂（10 μmol∙L-1 BA）和NaCl（100 mmol∙L-1）处理下,MdCRF6表达量明显上调（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4MdCRF6在细胞分裂素和盐胁迫响应中的表达分析
-->Fig. 4Analysis of MdCRF6 expression in the apple in response to BA and NaCl
-->
2.3 MdCRF6蛋白绑定DRE序列
通过体外诱导的方式获得GST-MdCRF6的融合蛋白。生物素标记拟南芥ARR6启动子区域含有DRE（ACCGAC）序列的核苷酸序列。EMSA试验结果显示,GST-MdCRF6融合蛋白能够结合到DRE序列。增加未标记的竞争探针,结合条带变弱。将DRE（ACC GAC）序列突变为-CCGGAG-,结合条带消失（图5）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5MdCRF6绑定DRE序列
-->Fig. 5MdCRF6 binds to DRE motif
-->
2.4 载体构建与转基因苹果愈伤组织鉴定
构建MdCRF6超表达载体MdCRF6-pCAMBIA1300（图6）,转化农杆菌LBA4404,通过农杆菌介导的遗传转化侵染苹果愈伤组织。实时荧光定量PCR检测转基因株系MdCRF6表达量（图7）。获得L1和L2两个转基因株系。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6MdCRF6-pCAMBIA-1300结构示意图
-->Fig. 6Schematic diagram of the MdCRF6-pCAMBIA-1300 construct
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7定量PCR分析MdCRF6在转基因苹果愈伤组织L1和L2中的表达水平
-->Fig. 7qRT-PCR analysis of the expression level of MdCRF6 in L1 and L2 transgenic apple calli
-->
2.5 超表达MdCRF6抑制花青苷积累
对获得的MdCRF6转基因苹果愈伤组织进行强光、低温处理,10 d后,野生型苹果愈伤组织（WT）积累较多花青苷,而转基因苹果愈伤组织（MdCRF6- L1和MdCRF6-L2）积累的花青苷含量很少（图8-a、b）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图8MdCRF6在苹果愈伤组织中超表达对花青苷积累的影响
a：野生型（WT）和转基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）苹果愈伤组织花青苷积累分析 Phenotypes of wild-type (WT) and transgenic (MdCRF6-L1 and MdCRF6-L2) apple calli on the anthocyanins accumulation;b：检测花青苷含量 Detection of the anthocyanins contents;c：定量PCR检测花青苷合成基因的表达 qRT-PCR analysis of the expression level of anthocyanins biosynthetic genes
-->Fig. 8Effects of MdCRF6 gene over-expression on anthocyanins accumulation in apple calli
-->
实时荧光定量PCR检测花青苷合成基因的表达。结果显示,超表达MdCRF6明显抑制花青苷合成基因的表达（图8-c）。
2.6 超表达MdCRF6降低苹果愈伤的抗盐性
对获得的MdCRF6转基因苹果愈伤组织进行不同盐浓度盐处理,15 d 后,相比于野生型对照,转基因苹果愈伤组织表现出对盐胁迫更敏感的表型。盐处理后,MdCRF6转基因苹果愈伤组织的鲜重明显低于野生型（图9-a、b）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图9MdCRF6在苹果愈伤组织中超表达对盐胁迫的影响
a：野生型（WT）和转基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）苹果愈伤组织盐胁迫情况分析 Phenotypes of wild-type (WT) and transgenic (MdCRF6-L1 and MdCRF6-L2) apple calli on the salt stress tolerance;b：检测愈伤鲜重 Detection of the fresh weight;c：定量PCR检测盐胁迫响应相关基因的表达 qRT-PCR analysis of the expression level of salt stress related genes
-->Fig. 9Effects of MdCRF6 gene over-expression on salt stress tolerance in apple calli
-->
实时荧光定量PCR检测盐胁迫响应相关基因的表达。结果显示,超表达MdCRF6明显抑制MdSOS1,MdSOS2和MdSOS3基因的表达（图9-c）。
3 讨论
细胞分裂素在植物生长发育过程中发挥重要作用。在果树生产中,研究细胞分裂素对花青苷积累和抗盐性调控的机理对于改善果实品质和提高苹果产量意义重大。前期研究表明,一定浓度的细胞分裂素可以促进花青苷的积累[12-13]。此外,在叶片喷施细胞分裂素可以显著提高植株的抗盐能力[7]。到目前为止,虽然对细胞分裂素调控的生长发育过程研究较多,但是其内在的调控机制仍然不清楚。细胞分裂素响应因子CRFs作为细胞分裂素信号传导途径中的关键调控因子,在调节植物衰老、响应非生物胁迫以及抗病性等方面具有重要作用。其中,拟南芥AtCRF6作为转录抑制因子在响应细胞分裂素和外界胁迫,抑制叶片衰老过程中发挥关键作用[24]。最近研究表明,拟南芥AtCRF6在氧化胁迫条件下扮演负调控者的角色,它能够通过直接结合ARR6的启动子,抑制细胞分裂素相关基因的表达[22]。此外,番茄SlARF6被初步鉴定在响应盐胁迫和多种植物激素过程中发挥重要作用[26]。据此,通过同源序列比对和RT-PCR技术得到苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6,苹果MdCRF6与拟南芥AtCRF6同源性最高,并且包含保守的CRF结构域和AP2/ERF结构域,在拟南芥AtCRF6[20]和番茄SlCRF6[26]的研究过程中也发现了相类似的结构域。基因表达分析发现,MdCRF6响应细胞分裂素和盐胁迫,由此推测MdCRF6或许在盐胁迫响应过程中具有重要作用。作为典型的转录因子,本研究结果也验证MdCRF6能够结合到DRE序列。以上结果表明,苹果MdCRF6和拟南芥AtCRF6在结构和功能上都具有相似性。这是在苹果中首次克隆得到细胞分裂素响应因子。
为了进一步鉴定苹果MdCRF6的生物学功能,获得了MdCRF6转基因苹果愈伤组织。前人研究表明,细胞分裂素在调节花青苷积累方面发挥重要作用[29]。本研究结果表明在苹果愈伤组织中超表达MdCRF6显著抑制花青苷的积累。推测MdCRF6响应细胞分裂素信号,作为转录抑制因子负调控花青苷合成基因的表达,进而抑制花青苷积累。同时,发现MdCRF6能够负调节植物的抗盐性,但具体的作用机制还有待深入研究。后期将进一步通过基因编辑（CRISPR/ Cas9）等技术,进一步验证该基因的生物学功能,为深入研究细胞分裂素信号途径和调节果树生长发育提供理论基础。
4 结论
通过基因克隆获得苹果MdCRF6,该基因编码348个氨基酸。氨基酸序列分析表明苹果MdCRF6包含保守的CRF结构域和AP2/ERF结构域。定量表达分析结果显示MdCRF6受细胞分裂素和盐胁迫诱导。EMSA结果证实MdCRF6原核表达蛋白能够结合DRE作用元件。MdCRF6转基因苹果愈伤组织表现出抑制花青苷积累和对盐胁迫敏感的表型,表明MdCRF6在调节花青苷积累和响应植物盐胁迫过程中可能发挥着重要的调控作用。The authors have declared that no competing interests exist.
