李闰婷^,1,2, 陈龙欣², 张丽萌^1,2, 何海迎¹, 王泳¹, 杨若晨¹, 段春辉¹, 刘月琴¹, 王玉琴³, 张英杰^,11河北农业大学动物科技学院,河北保定 071001
²郑州师范学院分子生物学实验室,郑州 450044
³河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023

Transient Expression and the Effect on Proliferation and Apoptosis of Granule Cell Stimulating Factor in Ovarian Fibroblasts

LI RunTing^,1,2, CHEN LongXin², ZHANG LiMeng^1,2, HE HaiYing¹, WANG Yong¹, YANG RuoChen¹, DUAN ChunHui¹, LIU YueQin¹, WANG YuQin³, ZHANG YingJie^,11College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei
²Molecular Biology Laboratory, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450044
³College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan

通讯作者: 张英杰,E-mail：zhangyingjie66@126.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2020-05-11接受日期:2020-10-29网络出版日期:2021-06-01

基金资助:

国家现代农业（肉羊）产业技术体系建设专项.CARS-38 国家现代农业（肉羊）产业技术体系建设专项.CARS-39 国家重点研发计划项目.2018YFD0502100

Received:2020-05-11Accepted:2020-10-29Online:2021-06-01
作者简介 About authors
李闰婷,E-mail：rtli1672@126.com。












摘要
【目的】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×10⁵个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL^-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（P<0.01）;羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）,试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL^-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(15.99±0.38)%变为(15.39±0.60)%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,比例由(22.88±1.00)%增大到(26.76±0.82)%。表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多。48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)%减少为(45.69±0.26)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由(16.42±1.29)%变为(21.80±1.86)%,差异不显著（P>0.05）。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。
关键词： GCSF;羊;转染;生物学活性;细胞周期;细胞凋亡

Abstract
【Objective】 The purpose of this paper is to study the transient expression of granule cell stimulating factor (GCSF) in ovarian fibroblast cells, and the influence of GCSF on proliferation, cell cycle, and apoptosis, to provide theoretical basis for molecular genetic breeding of sheep pluripotent stem cells induced by GCSF in the future. 【Method】 The sheep GCSF eukaryotic expression plasmid pRTL1-GCSF and the control vector plasmid pRTL1 were transfected into 1×10⁵ cells·mL^-1 sheep fibroblasts respectively. After 48 h of culture, the total RNA was extracted by Trizol method and reverse transcribed into cDNA. The transient expression level of sheep GCSF in fibroblasts was detected by real-time quantitative PCR. GCSF dependent cell line NFS-60 was used for the biological activity of GCSF secreted and expressed in the supernatant of sheep fibroblasts 48 hours after transfection, which was determined by cell viability detection reagent alamarBlue. The HEK 293F suspension culture was used to express the secreted GCSF protein. The GCSF protein expressed in the cell culture medium was purified by Ni-NTA resin and detected by SDS-PAGE. After adding the 30 ng·mL^-1 purified GCSF protein, the proliferation of sheep fibroblasts was detected by alamarBlue at 24 h and 48 h, and the cell cycle and apoptosis of sheep fibroblasts were detected by flow cytometry. 【Result】 The expression level of GCSF in sheep fibroblasts was significantly increased after transfection for 48 h. In sheep fibroblasts, the expression level of GCSF transfected with pRTL1-GCSF plasmid was 50 615.92 ± 4 738.83 of that of pRTL1 empty control group. The fluorescence intensity of NFS-60 in the experimental group and positive control group was significantly higher than that in the negative control group and blank control group (P<0.01), but there was no significant difference between the experimental group and the positive control group (P>0.05). The results showed that sheep GCSF could significantly stimulate the proliferation of NFS-60 cells, indicating that the GCSF expressed in sheep fibroblasts had biological activity. After eukaryotic expression of secretory GCSF protein in HEK 293F cell line, the sheep GCSF protein was purified. After 30 ng·mL^-1 sheep GCSF was added to sheep fibroblasts, the cell viability of GCSF test group was not significantly different from that of culture medium dilution control group for 24 h and 48 h, but the distribution of cell cycle was significantly changed. At 24 h, compared with the control group, the proportion of G1 phase cells increased from (55.29±1.68)% to (69.37±0.24)%, the difference was very significant (P<0.01); the proportion of S phase cells changed from (15.99±0.38)% to (15.39±0.60)%, the difference was not significant (P>0.05); G2/M phase cells increased significantly (P<0.05), and the proportion increased from (22.88±1.00)% to (26.76±0.82)%. The results showed that 24 hours after the addition of sheep GCSF, the number of cells in division and interphase increased significantly. At 48 h, compared with the control group, the proportion of G1 phase cells decreased from (65.96±0.37)% to (45.69±0.26)%, the difference was very significant (P<0.01); the proportion of S phase cells increased from (13.45±1.33)% to (37.87±2.43)%, the difference was very significant (P<0.01); the proportion of G2/M phase cells changed from (16.42±1.29)% to (21.80±1.86)%, the difference was not significant (P>0.05). The results showed that the number of cells in interphase was significantly decreased and the number of cells in DNA replication state increased significantly at 48 h after adding GCSF. Compared with the control group, the apoptosis rates of the control group (Ctr) and the experimental group (GCSF) were (7.51±0.38)% and (9.16±0.46)% respectively at 24 h culture. At 48 h, the apoptosis rates of the control group and the experimental group were (5.73±0.29)% and (5.39±0.27)%, respectively. At 72 h, the apoptosis rates of control group (Ctr) and experimental group (GCSF) were (8.88±0.45)% and (5.41±0.27)%, respectively. There was a significant difference between 24 h and 72 h (P<0.01), but there was no significant difference at 48 h (P>0.05). The results showed that GCSF promoted the apoptosis within 24 hours, and the apoptosis was inhibited with the prolongation of time. 【Conclusion】 In conclusion, sheep fibroblasts can express GCSF instantaneously and have biological activity. GCSF did not affect the proliferation of sheep fibroblasts, but could regulate its cell cycle and affect cell apoptosis. The results laid a foundation for breeding sheep with high immunity and disease resistance by GCSF mediated by sheep fibroblasts.
Keywords：GCSF;sheep;transformation;bio-activity;cell cycles;apoptosis


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本文引用格式
李闰婷, 陈龙欣, 张丽萌, 何海迎, 王泳, 杨若晨, 段春辉, 刘月琴, 王玉琴, 张英杰. 粒细胞集落刺激因子在羊成纤维细胞中的表达及对细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国农业科学, 2021, 54(11): 2434-2444 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.015
LI RunTing, CHEN LongXin, ZHANG LiMeng, HE HaiYing, WANG Yong, YANG RuoChen, DUAN ChunHui, LIU YueQin, WANG YuQin, ZHANG YingJie. Transient Expression and the Effect on Proliferation and Apoptosis of Granule Cell Stimulating Factor in Ovarian Fibroblasts[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(11): 2434-2444 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.015


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0 引言

【研究意义】粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）是集落刺激因子糖蛋白生长因子中的家族成员,主要功能是支持造血祖细胞的增殖^[1,2,3],因此广泛用于提高动物机体免疫力及疾病治疗。近年来,诱导干细胞技术发展迅速,羊成纤维细胞诱导干细胞的研究也有相关报道^[4,5,6,7,8]。成纤维细胞不但具有较强的分裂和增殖能力,而且其还兼具适应性强、易培养、性状稳定并难以发生细胞转化等优势^[9],体外传代培养绵羊成纤维细胞能够提供大量并稳定的供体细胞,便于转基因操作并得到了广泛的应用^[10,11]。探究羊GCSF在成纤维细胞中的瞬时转染表达及体外添加羊GCSF对成纤维细胞的影响,对深入研究以羊GCSF为分子遗传育种靶点,培育具有高免疫力、高抗病性的羊有着重要的理论指导意义。【前人研究进展】GCSF可刺激多能干细胞的增殖和分化,延长粒细胞的存活时间,但是该蛋白的半衰期较短^[12,13,14],一般只有不到一天的半衰期。有研究表明,通过体外注射GCSF能够提高牛和狗的免疫力、组织器官移植的成功率、辅助生殖率及治疗乳房炎等的报道^{[15,16,17,18,19]}。研究发现磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/AKT）以及肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）/AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）信号通路相关因子共同参与成纤维细胞增和殖骨骼肌生长发育等生理进程^[20,21],报道显示GCSF在PI3K/AKT通路中起到重要的调节作用^[22,23]。此外,本研究团队之前也发现将羊GCSF蛋白添加到体外培养的羊颗粒细胞中后,可以改变细胞周期,促进颗粒细胞的增殖,抑制细胞凋亡^[24]。【本研究切入点】GCSF表达量的差异可能与某些动物的抗病能力密切相关^{[15,16,17,18,19,20]},但在羊上的研究较少,对其在羊成纤维细胞中的瞬时转染表达及影响未见报道。【拟解决的关键问题】转染GCSF真核表达质粒到羊成纤维细胞中,利用qRT-PCR方法检测GCSF的表达水平,测试羊GCSF的生物学活性,并真核表达纯化了羊GCSF蛋白;为了验证其功能,将GCSF加入到体外培养的羊成纤维细胞中,通过细胞活力试验、细胞周期试验和凋亡试验研究GCSF对羊成纤维细胞增殖和凋亡的影响,为今后利用羊GCSF为靶点构建基因编辑稳定细胞系并诱导全能干细胞,培育相应的基因编辑动物,进行分子遗传育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

绵羊胚胎成纤维细胞系由中国科学院遗传与发育生物学研究所马润林教授提供。HEK 293F细胞和NFS-60细胞系由中国科学院生物物理研究所王峰教授提供。真核分泌表达质粒pRTL1-GCSF由郑州师范学院分子生物学实验室提供。RPMI1640培养基、双抗、胰酶、293fectin^TM转染试剂、FreeStyle^TM 293表达培养基和胎牛血清（FBS）为Gibco产品。PageRuler^TM Prestained Protein Ladder、Lipofectin 2000和碘化丙啶（propidium iodide,PI）为Lifetech产品。hMCSF购自义翘神州生物科技有限公司。HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG (H+L)和DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司。DNA胶回收试剂盒为QIAgen产品。Ni-NTA凝胶购自南京金斯瑞生物科技有限公司。ECL化学发光试剂盒购自晶彩公司。Annexin-V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成,引物序列见表1。

Table 1
表1
表1引物序列
Table 1The sequences of primers

引物名称 Primer names	序列 Sequences
GCSF-pR	GAA GGC CGA CGT GAA GGT
GCSF-pF	TCA CGA ATT CGA CCC CCC TTG GCC CTG C
GAPDH-pF	CAA GTT CCA CGG CAC AGT CA
GAPDH-pR	CTC AGC ACC AGC ATC ACC C

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试验于2019 年3月至2020年1月在河北省保定市河北农业大学动物科技学院和河南省郑州市郑州师范学院分子生物学实验室进行。

1.2 细胞的复苏与培养

从液氮中取出保存的羊成纤维细胞,迅速在37℃的水浴中融化,立即将细胞转移到盛有37℃预热的含10% FBS和1%双抗的RPMI1640完全培养基中重悬浮使之成为单细胞悬液。用白细胞计数板在显微镜下计数,调整细胞密度至2×10⁴个细胞/mL,于37℃、5% CO₂条件下静置培养,48 h后更换培养液,去除未贴壁的细胞^[11]。贴壁培养的细胞即为羊成纤维细胞,加入RPMI1640完全培养基继续扩大培养待用。

从液氮中取出NFS-60细胞,转移至含有62 ng·mL^-1 hMCSF的基础培养基中（含有10% FBS、1%双抗、2 nmol·L^-1 β-巯基乙醇的RPMI1640培养基）,方法同上,进行传代培养。在GCSF生物学活性检测前,离心收集细胞,基础培养基洗涤细胞3次后,加入基础培养基及含有终浓度为62 ng·mL^-1 hMCSF或30 ng·mL^-1 GCSF或0.1倍体积的待测细胞培养上清样品继续培养待用。

从液氮中取出HEK 293F细胞,迅速在37℃的水浴中融化,立即将细胞转移到盛有37℃预热的FreeStyle^TM 293 表达培养基中重悬浮使之成为单细胞悬液,用白细胞计数板在显微镜下计数,调整细胞密度为5×10⁴个细胞/mL,于37℃、125 r/min、8% CO₂条件下振荡培养,72 h后100×g离心收集细胞更换培养液。调整细胞密度为5×10⁴个细胞/mL传代培养。转染前100×g离心收集细胞更换培养液,调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL,继续培养待用。

1.3 转染与表达量检测

按照2 μg质粒对应4.8 μL的Lipofectin 2000的剂量,进行细胞转染。对照组用pRTL1载体质粒,试验组用pRTL1-GCSF质粒,转染至1×10⁵个细胞/mL的羊成纤维细胞中,连续培养48 h,利用Trizol试剂提取转染后24和48 h的细胞总RNA,经NanoDrop- 2000C微量核酸测定仪检测总RNA的纯度和浓度,RNA的浓度和纯度达到要求,以总RNA为模板反转录为cDNA。

实时荧光定量（qRT-PCR）反应体系（20 μL）：cDNA 1.0 μL,上、下游引物GCSF-pF和GCSF-pR或者GAPDH-pF和GAPDH-pR（10 pmol·L^-1）各0.4 μL, SYBR Green Real-time PCR Master Mix (2×)10 μL, RNase free ddH₂O补足至总体积为20 μL。扩增程序为：95℃ 5 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃ 15s,共45个循环;同时以熔解曲线分析扩增产物的特异性,扩增程序为：95℃ 15 s,60℃ 1 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s。每个样本重复3次,取平均值。

1.4 转染的羊成纤维细胞上清中GCSF生物活性检测

为了测定GCSF的生物学活性,本研究将转染了GCSF的羊成纤维细胞瞬时表达上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60中,测试是否能促进NFS-60细胞的增殖^[25]。详情如下：pRTL1-GCSF为GCSF的分泌型真核表达质粒,转染羊成纤维细胞48 h后,12 000 ×g离心去除细胞碎片,收集培养液上清测试待用。接种1×10⁴个细胞/孔的NFS-60细胞到96孔板中,分成4个处理组：试验组（在基础培养基中添加了10%的pRTL1-GCSF转染羊成纤维细胞的培养上清）,阳性对照组（在基础培养基中额外添加了终浓度为62 ng·mL^-1的hMCSF）^[26],阴性对照组（在基础培养基中额外添加了10%的pRTL1空载转染羊成纤维细胞培养上清）和空白对照组（基础培养基）,每组设3个重复孔,加样后继续培养24和48 h,分别加入10 μL alamarBlue^TM HS Cell Viability Reagent试剂后在细胞培养箱内继续孵育3 h,用EnVision? multimode plate reader酶标仪检测Ex/Em分别为560 nm/590 nm波长下的读值。

1.5 GCSF的真核表达和纯化

按照100 μg质粒对应200 μL的293fectin^TM 转染试剂的剂量将真核表达质粒pRTL1-GCSF转染到HEK 293F细胞中从而表达GCSF蛋白。简要步骤为：HEK 293F细胞在多个500 mL体积的透气细胞摇瓶中用FreeStyle^TM 293培养基培养100 mL细胞至浓度为1×10⁶个细胞/mL,转染100 μg pRTL1-GCSF质粒到细胞中;转染7 d后收集细胞培养上清。按照说明书操作步骤通过Ni-NTA凝胶纯化细胞培养上清中的GCSF蛋白,纯化后进行SDS-PAGE检测。

1.6 细胞增殖检测

待羊成纤维细胞长至培养瓶的80%时用胰酶消化,并按1×10⁵个细胞/mL分别接种于96孔板中,每孔100 μL,分成2个处理组：对照组（不添加羊GCSF的基础培养基）和试验组（添加了30 ng·mL^-1羊GCSF蛋白的基础培养基）,每组设3个重复孔,连续培养2 d,每天定时加入10 μL alamarBlue^TM HS Cell Viability Reagent试剂后放置在细胞培养箱内继续孵育3 h,用EnVision? multimode plate reader酶标仪检测Ex/Em分别为560 nm/590 nm波长下的读值。

1.7 细胞周期检测

4 mL羊成纤维细胞按2×10⁵个细胞/mL的密度接种于60 mm细胞培养皿中,测试时分成2个处理组：对照组（不添加羊GCSF的基础培养基）和含有30 ng·mL^-1 GCSF蛋白的试验组,每组设3个重复。待羊成纤维细胞孵育24和48 h后,分别用胰酶充分消化处理收集单细胞。100×g离心3 min,PBS洗涤2次。细胞用1 mL PBS重悬后,加入4 mL -20℃预冷的无水乙醇对细胞进行固定,边加边混匀,避免细胞结团。固定细胞过夜后,离心去除固定液收集细胞,用含有2% FBS的PBS重悬细胞。加入终浓度为1 μg·mL^-1的PI对细胞进行染色,避光室温孵育15 min。用流式细胞仪进行检测,每次计数最少2×10⁴个细胞,NovoExpress软件分析拟合细胞周期。

1.8 细胞凋亡检测

按照之前方法和分组,在对照组和试验组收集细胞后,用含2% FBS的PBS洗涤细胞2次,100×g离心5 min,弃上清,加入500 μL Binding Buffer使细胞悬浮,分别同时或单独加入5 μL Annexin-V FITC和/或PI染液,轻轻吹打混匀,室温（25℃）避光孵育15 min后采用流式细胞仪的FITC通道和PerCP通道调节补偿后进行检测。

1.9 统计分析

采用GraphPad Prism 6.0软件统计分析。细胞试验数据以平均值±SEM表示,t检验分析使用Multiple t tests-one per row程序,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,P≥0.05表示差异不显著。定量结果根据2^-ΔΔCt法^[15]进行处理,用内参基因GAPDH对羊的不同组织中GCSF的表达水平进行均一化处理。

2 结果

2.1 转染羊成纤维细胞后GCSF表达

pRTL1-GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞,48 h后分别收集细胞提取总RNA,并反转录为cDNA。通过qRT-PCR,以GAPDH为内参,检测其中GCSF的表达量变化。定量结果根据2^-ΔΔCt法进行处理,如图1所示。在转染了pRTL1-GCSF的羊成纤维细胞中,GCSF的表达量是转染了空载对照组的（50 615.92± 4 738.83）倍,表达量差异极显著（P<0.01）,羊GCSF基因可以在羊成纤维细胞中得到瞬时高表达。

图1

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图1GCSF转染羊成纤维细胞后的mRNA表达水平

**代表差异极显著（P<0.01）
Fig. 1GCSF expression in mRNA level of transformation sheep fibroblast cells

** means extremely significant difference between the treatments (P<0.01)

2.2 GCSF转染羊成纤维细胞的生物学活性

将转染了羊成纤维细胞的GCSF培养上清,加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60中,测试是否能促进细胞的增殖,结果如图2所示,试验组、hCMSF阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）。试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。

图 2

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图 2转染后成纤维细胞表达的GCSF的生物学活性检测

**代表差异极显著（P<0.01）,ns代表差异不显著（P>0.05）
Fig. 2Bio-activity of GCSF expressed by transformation fibroblast cells

** means extremely significant difference between the treatments (P<0.01), ns means no significant difference between treatments (P>0.05)

2.3 GCSF的真核表达和纯化

pRTL1-GCSF真核表达质粒转染HEK 293F悬浮细胞后的第7天收集细胞培养上清,利用6×His标签按照Ni-NTA标准方法纯化,进行SDS-PAGE检测,如图3所示,纯化的蛋白符合目的条带的大小,纯度较高。

图3

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图3纯化的羊GCSF的SDS-PAGE检测

泳道M：PageRuler? Prestained Protein Ladder;泳道1：GCSF,箭头指示处为纯化的羊GCSF蛋白
Fig. 3SDS-PAGE of purified sheep GCSF

Lane M: PageRuler? Prestained Protein Ladder; Lane1: GCSF, the arrow indicates the purified sheep GCSF protein

2.4 GCSF对羊成纤维细胞增殖的影响

羊成纤维细胞培养基中添加GCSF蛋白后继续培养,分别在24和48 h加入10 μL alamarBlue试剂继续孵育3 h后,酶标仪读值检测。结果如图4所示,不管是24 h还是48 h测定细胞活力,未添加GCSF的空白对照组与添加了30 ng·mL^-1 GCSF的试验组相比,荧光强度差异不显著（P>0.05）,表明GCSF的添加不影响羊成纤维细胞的增殖。

图4

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图4GCSF添加24 和48 h后对羊成纤维细胞增殖的影响

ns代表差异不显著（P>0.05）
Fig. 4The effection of GCSF adding on fibroblast cells proliferation at 24 and 48 h

ns means no significant difference between treatments (P>0.05)

2.5 GCSF对羊成纤维细胞周期的影响

外源添加GCSF蛋白培养羊成纤维细胞24 h后,细胞周期拟合结果如图5所示,与对照组（Ctr）相比,试验组（GCSF）G1期细胞比例由（55.29±1.68）%增加到（69.37±0.24）%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由（15.99±0.38）%变为（15.39±0.60）%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞比例显著增多（P<0.05）,由（22.88±1.00）%变为（26.76±0.82）%。表明加入GCSF的24 h后,羊成纤维细胞处于分裂状态和间期的细胞显著增多。添加GCSF 48 h后,细胞周期拟合结果如图5所示,与对照组相比试验组G1期细胞比例由（65.96±0.37）%减少到（45.69±0.26）%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由（13.45±1.33）%增加到（37.87±2.43）%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由（16.42±1.29）%变为（21.80±1.86）%,差异不显著（P>0.05）。表明48 h后加入GCSF的羊成纤维细胞处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。

图5

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图5添加GCSF后成纤维细胞的细胞周期比较

**代表差异极显著（P<0.01）,*代表差异显著（P<0.05）,ns代表差异不显著（P>0.05）
Fig. 5Cell cycles analysis of fibroblast cells with GCSF adding

** means extremely significant difference between the treatments (P<0.01), * means significant difference between treatments (P<0.05), ns means no significant difference between treatments (P>0.05)

2.6 GCSF对羊成纤维细胞凋亡的影响

羊成纤维细胞经GCSF处理后,AnnexinV- FITC/ PI染色,并将凋亡细胞（早期凋亡和晚期凋亡）、正常活细胞和坏死细胞区分,如图6所示。培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是（7.51±0.38）%和（9.16±0.46）%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是（5.73±0.29）%和（5.39±0.27）%。72 h时对照组和试验组的凋亡率分别是（8.88±0.45）%和（5.41±0.27）%。试验组凋亡率和对照组相比,24 和72 h检测时凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。

图6

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图6GCSF处理后羊成纤维细胞不同时段的凋亡

Q2-4：早期凋亡细胞;Q2-2：晚期凋亡细胞;Q2-3：正常活细胞;Q2-1：坏死细胞
Fig. 6Treatment with GCSF on apoptosis in cultured sheep fibroblast cells

Q2-4: Early apoptotic cells; Q2-2: Late stage apoptotic cells; Q2-3: Normal living cell; Q2-1: Dead cells

3 讨论

GCSF是造血细胞生长因子中的一个重要组成部分,在血细胞生成调节机制中具有重要意义。GCSF刺激特定骨髓前体细胞增殖以及分化成粒细胞^[27],并激活中性粒细胞的成熟^{[15, 28]},支持造血祖细胞的增殖^[1,2,3]。此外,中性粒细胞是宿主针对细菌和真菌感染防御机制的关键组分,增强中性粒细胞的功能,促进损伤愈合^[29]。在细菌感染后,其宿主动物机体受到刺激产生GCSF并促进白细胞的分化与增殖的机制可以用于避免抗生素使用的治疗,有报道显示暴露于链球菌的猪在注射给药GCSF后的存活时间更长^[30]。另外,有报道显示感染了犬疱疹病毒的狗在常规治疗之外联合注射了重组犬GCSF后的治疗费用与不联合用药相比更少^[31]。1991年美国FDA最早批准重组人GCSF上市,我国已批准18家制药企业生产重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）,批准文号有69个^[32,33,34]。由大肠杆菌产生的非糖基化重组人粒细胞集落刺激因子在骨髓移植后的康复中被广泛应用于治疗多种严重的人类疾病,目前已经广泛用于预防和治疗癌症、出血热等疾病引起的白细胞缺少症,并用于维持外周血干细胞（PBSC）的细胞数量^[35,36,37]。有研究报道机体中GCSF的表达量差异可能与某些动物的抗病能力密切相关,有研究报道机体中GCSF的表达量差异可能与某些动物的抗病能力密切相关,在体外细胞试验中可以刺激包括人、牛、小鼠和狗等多物种来源的粒细胞增殖,通过体外注射重组人或牛的GCSF蛋白可以提高人和牛等生物的免疫力,提高辅助生殖率及治疗乳房炎等^{[15-19, 38]},到目前为止,仅有两种绵羊GCSF的预测基因序列可以在GenBank的网站中搜索到。但尚无真核表达羊GCSF和该蛋白用于羊的遗传育种方面的研究。本研究将为利用羊GCSF为靶点构建基因编辑稳定细胞系并诱导全能干细胞,培育相应的基因编辑动物,进行分子遗传育种提供理论基础。

本研究将真核分泌表达质粒pRTL1-GCSF转染到羊成纤维细胞中发现转染效率及荧光强度并不高。而利用相同载体骨架的GFP报告基因替换GCSF基因转染细胞,镜检结果显示有大约一半的细胞可以在GFP通道的荧光显微镜下产生荧光。在mRNA水平上,通过qRT-PCR检测pRTL1-GCSF的转染,发现羊GCSF的表达量却显著升高。因此推测羊GCSF在成纤维细胞中的表达量低,与转染效率无关,可能是由于其半衰期较短的原因所致。转染的细胞培养上清（48 h）通过GCSF生物学活力检测发现,10倍比稀释上清中GCSF的生物学活力与添加的阳性对照hMCSF（62 ng·mL^-1）蛋白活力相当,证明功能性羊GCSF蛋白可以分泌表达到羊成纤维细胞培养基上清中,虽然分泌表达的GCSF蛋白量相对较低,但是较低剂量的GCSF足以发挥其生物学功能,尽管如此,在后期对以GCSF为靶标的分子遗传育种或蛋白商业化应用可以尝试使用其他的信号肽或表达形式来提高分泌蛋白的表达量及稳定性。

有研究表明GCSF作为一种生物大分子,与其受体GCSF-R结合,相互作用后将信号传导进入细胞^[39]。GCSF作为集落刺激因子的糖蛋白生长因子家族中的重要组成成员,可能和生长激素发挥作用的机制相似,但这需要进一步验证。羊GCSF可以促进粒细胞增殖^[24],而本研究结果显示其难以改变羊成纤维细胞的增殖。由于羊成纤维细胞较为稳定,有望通过成纤维细胞作为载体工具,将GCSF作为靶标用于羊的分子育种。细胞增殖和凋亡与细胞周期息息相关,前期研究显示,GCSF的添加促进颗粒细胞的增殖,抑制了颗粒细胞的凋亡,S期细胞显著减少,G2/M期细胞显著增加,处于分裂状态的细胞显著增加,在GCSF的动员下,颗粒细胞分裂速度加快,细胞周期的分布显著改变^[24]。而本研究结果显示,羊成纤维细胞经GCSF处理后,细胞增殖情况差异不显著,但流式细胞术验证的细胞周期和凋亡结果显示不同时间段检测的羊成纤维细胞的细胞周期都有显著差异。GCSF处理前期处于分裂状态的细胞显著增加,随着处理时间的延长,到后期处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增加。而在细胞凋亡试验中,前期24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。这可能是与GCSF的半衰期较短,刺激各种抗凋亡因子的时效性差所导致的,同时,也可能解释了GCSF加入到羊成纤维细胞后,由于羊成纤维细胞细胞周期和细胞凋亡在前期和后期的平衡调节,从而不影响细胞的增殖。追踪其机制,有研究显示,GCSF可以在大鼠脑溢血模型中通过PI3K/AKT通路显著调高抗凋亡因子B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,抑制促凋亡因子caspase-3的表达,从而影响细胞生长和凋亡^{[23, 40-41]}。本研究在外源添加GCSF到羊成纤维细胞的培养基中后,细胞周期和细胞凋亡状态都有一定的变化,也很可能是通过相同或相似的分子机制产生的调节作用,具体情况还有待于进一步研究验证。

4 结论

羊粒细胞集落刺激因子可以在羊成纤维细胞中瞬时过量表达并具有生物学活性;它不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控羊成纤维细胞的周期,影响细胞凋亡。

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