黄峰^,, 魏起超, 李侠, 刘春梅, 张春晖^,中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室,北京 100193

Research Progress on Mechanisms of Apoptosis to Postmortem Tenderization in Muscle

HUANG Feng^,, WEI QiChao, LI Xia, LIU ChunMei, ZHANG ChunHui^,Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193

通讯作者: 张春晖,E-mail: dr_zch@163.com

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-08-30接受日期:2020-11-24网络出版日期:2021-05-16

基金资助:

国家自然科学基金.32072244

Received:2020-08-30Accepted:2020-11-24Online:2021-05-16
作者简介 About authors
黄峰,E-mail: huangfeng226@foxmail.com。







摘要
嫩度是决定肉食用品质的重要指标。宰后肉的嫩度发生不连续变化,严重降低了消费者的购买意愿,因此阐明宰后嫩化机理一直是肉品科学领域的研究热点。自“凋亡”的概念引入至宰后肌肉嫩化过程后一直广受关注,动物被屠宰放血后,活性氧（reactive oxygen species,ROS）大量累积,ATP（adenosine triphosphate）逐渐耗尽,必然导致细胞死亡。宰后肌细胞死亡和肌肉嫩化都是在一系列调控因子作用下激活肌肉内源酶,并由内源酶水解蛋白质破坏细胞结构,因此这两个生化过程被认为高度相关。本文综述了宰后肌细胞主要以凋亡的形式死亡,分析了除凋亡外,宰后早期产生少量ROS时细胞会通过自噬启动自身防御系统,宰后后期ATP逐渐耗尽肌细胞可能从凋亡转变为坏死;明确了线粒体通路是宰后肌肉中细胞凋亡酶激活的关键路径,线粒体死亡因子释放是细胞内死亡级联反应的总开关,其开放状态直接决定着细胞以何种途径进行死亡,并进一步从线粒体膜通透化和内膜嵴重构两方面,讨论了宰后线粒体损伤诱导凋亡因子的释放机理;综述了线粒体损伤变化及其对嫩化过程的影响,并从线粒体通过参与能量代谢影响肌肉pH以及通过释放凋亡因子调控细胞凋亡酶活性两方面分析了其潜在机理;探讨了宰后肌肉线粒体与内质网间相互作用以影响Ca²⁺信号传导以及细胞凋亡过程,或与溶酶体相互作用,破坏溶酶体膜稳定性,使其释放组织蛋白酶以激活线粒体Bax和Bid而加速线粒体膜通透性;综述了细胞凋亡酶在宰后早期被激活,并参与部分肌原纤维蛋白的有限降解,但随着宰后时间的延长,ATP逐渐耗尽等因素导致细胞凋亡酶失活,因此细胞凋亡酶只参与宰后早期的嫩化过程。综述内容可为完善宰后肌肉嫩化过程提供理论参考。
关键词： 宰后嫩化;细胞凋亡;细胞凋亡酶;线粒体损伤;凋亡因子

Abstract
Tenderness has been considered as one of the most important eating quality characteristics of meat, while inconsistent changes of tenderness in postmortem (PM) muscles can significantly reduce the purchasing intention. Therefore, investigating mechanism of postmortem muscle tenderization is becoming more and more important in the past decade. Since apoptosis definition was highlighted in the PM tenderization process, it has been widely concerned. Shortly after slaughter, the reactive oxygen species (ROS) was significantly accumulated, and ATP (adenosine triphosphate) was gradually exhausted within muscle fibers, which inevitably led to skeletal cell death. Both PM cell death and meat tenderization refer to the activation of muscle endogenous enzymes by a series of regulatory factors, followed by the degradation of muscle structural proteins. The two biochemical processes are considered to be highly related. PM muscle cells die mainly through apoptosis. Besides, in the early stage of PM, when a small amount of ROS is produced, the cells start their defense system by autophagy and ATP therefore gradually deplete muscle cells in the later stage, which may change from apoptosis to necrosis. It has been documented that mitochondrial pathway is crucial for the apoptosis activation in PM muscles. The release of apoptotic factors from mitochondria is the master node of the intracellular death cascade reaction. The opening status of mitochondrial outer membrane directly determines the way, in which the muscle fiber dies. In this paper, the release mechanism of apoptotic factors induced by PM mitochondrial damage was discussed from the perspectives of mitochondrial membrane permeability and cristae remodeling, and the regulation of mitochondrial damage on PM muscle tenderization was discussed. Moreover the underlying mechanism behind it was also analyzed to reveal the effect of mitochondria on muscle pH regulation through energy metabolism, the release of apoptotic factors and regulation of apoptosis enzyme activity. At the same time, the interaction between mitochondria and endoplasmic reticulum were discussed, focusing on Ca²⁺ signal transduction and cell apoptosis process. The interaction between mitochondria and lysosome was further investigated, by highlighting the stability of lysosomal membrane and the subsequently released cathepsin to activate Bax and Bid to accelerate mitochondrial membrane permeability. Caspases were activated and involved in the limited degradation of some myofibrils in the early stage of PM tenderization, followed by the inactivation resulting from the decreasing ATP or other factors with the extended PM time. Therefore, caspases maybe only involve the early stage of tenderization. This review could provide a theoretical reference for the perfection of PM muscle tenderization investigations.
Keywords：postmortem tenderization;apoptosis;caspases;mitochondrial damage;apoptotic factors


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黄峰, 魏起超, 李侠, 刘春梅, 张春晖. 细胞凋亡对宰后肌肉嫩化作用机理的研究进展[J]. 中国农业科学, 2021, 54(10): 2192-2202 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.014
HUANG Feng, WEI QiChao, LI Xia, LIU ChunMei, ZHANG ChunHui. Research Progress on Mechanisms of Apoptosis to Postmortem Tenderization in Muscle[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(10): 2192-2202 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.014


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0 引言

嫩度是决定肉食用品质的一个重要指标,消费调查显示,大多数消费者对嫩度较好的肉具有更强的购买意愿^[1],且愿意购买价格高但嫩度有保证的肉^[2]。与风味和多汁性不同,宰后肉的嫩度会发生不连续变化,刚屠宰的肉嫩度最好,由于尸僵的发生,嫩度会降低,随后的解僵成熟又使嫩度逐步改善。这种不连续变化极易造成肉的最终嫩度较差且不稳定,严重降低肉的商品价值和消费者满意度。为充分改善宰后肉的嫩度、缩短嫩化时间,亟需阐明宰后肉的嫩化机理。

宰后肌肉嫩化机理研究可分为以下阶段:第一阶段,明确肌原纤维蛋白有限降解是宰后嫩度改善的主要原因,而肌节长度主要在僵直过程影响嫩度,结缔组织含量决定肉的“本底硬度”^[3,4]。第二阶段,集中在“钙学说”和“钙激活酶学说”之争,最终明确钙激活酶是宰后肌肉嫩度改善的主要原因^[4,5]。第三阶段,揭示了宰后肌细胞以凋亡的形式死亡,除钙激活酶外,细胞凋亡酶在宰后早期肌肉嫩化中也发挥重要作用,宰后嫩化是多种内源酶协同作用的结果^[6]。本文重点讨论基于细胞凋亡的宰后嫩化机制最新研究进展,并分析嫩化过程中可能存在的生化调控网络。

1 宰后肌细胞的死亡形式

1.1 细胞凋亡是宰后肌细胞死亡的主要形式

动物被屠宰放血后,肌细胞的营养基质及氧气供应被中断,造成活性氧（reactive oxygen species,ROS）大量累积、ATP（adenosine triphosphate）逐渐耗尽等剧烈应激变化,必然导致细胞死亡^[7]。目前已发现的细胞死亡方式包括凋亡、坏死、自噬等,其中凋亡和坏死是两种主要死亡模式^[8]。每种死亡方式都有其典型特征,凋亡与坏死的区别在前期研究中有详细综述^[9]。早期有关宰后肌肉生化的研究并没有关注细胞的死亡方式,但随着凋亡概念引入至宰后肌肉嫩化领域^[6],宰后肌细胞死亡逐渐受到****关注,并被认为与宰后肌肉嫩化过程高度相关^[10]。OUALI等^[6]发现宰后肌细胞间隙的增大并不是由传统认为的pH下降所引起,而可能是由细胞发生死亡、产生皱缩而导致,并最早提出宰后肌细胞是以凋亡的形式死亡^[11]。随后的相关研究也表明宰后肌细胞发生收缩、细胞核收缩并边缘化、磷脂酰丝氨酸外翻、细胞核原位末端（terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL）和laminin双重染色呈阳性、出现凋亡小体,这些形态学变化均支持宰后肌细胞是以凋亡的形式死亡^[12,13,14]。细胞凋亡出现的典型形态特征主要是细胞内一类称为半胱氨酸天冬氨酸水解酶（细胞凋亡酶）的蛋白酶家族激活后,切割特定的底物引起。因此,细胞凋亡酶的激活及对相关特征底物的裂解是细胞凋亡的重要生化特征。目前,大多数研究发现宰后肌肉中细胞凋亡酶能够被激活,如KEMP等^[15]利用免疫印记技术在屠宰1 h后的猪肉背肌中检测到细胞凋亡酶-3的酶原及激活片段,且其活性约在宰后2 h达到最大值。CHEN等^[16]在宰后鸡胸肉中也检测到细胞凋亡酶-3的激活片段,同时也检测到血影蛋白被细胞凋亡酶-3特异性降解的120 kD片段。虽然UNDERWOOD等^[17]报道宰后牛肉中细胞凋亡酶-3不能够被激活,但大多数研究从宰后肌细胞形态学和生化特征变化方面均揭示宰后肌细胞是以凋亡的形式死亡。

1.2 宰后早期肌细胞死亡可能是从自噬到凋亡的转化

目前的研究虽揭示了凋亡是宰后肌细胞的主要死亡方式。但肌细胞是一种典型的多核细胞,其死亡方式相比单细胞更为复杂^[18],且宰后肌肉内环境变化剧烈,宰后所有骨骼肌细胞是否都是以凋亡的形式死亡,有没有可能存在自噬、坏死等其他死亡方式,这些都值得进一步探讨。有****认为,自噬、凋亡、坏死等可能是细胞在形态学和生化学上死亡的终点,在死亡过程中各种死亡方式间可出现并存,甚至相互转化^[19]。宰后肌肉嫩化一般分为3个阶段:（1）僵直前阶段,氧气供应终止,但肌肉仍保持生理状态。（2）僵直阶段,能量被逐渐耗尽,逐渐达到最大僵直状态,嫩度最差。（3）成熟阶段,肌肉内源酶水解蛋白质,嫩度逐步改善。每个阶段可能存在不同的细胞死亡变化（图1）。动物刚被屠宰放血后,一方面ROS大量产生,促使肌细胞走向死亡;另一方面机体本能的启动防御系统,热休克蛋白等保护因子被激活,抵抗ROS损伤细胞,细胞发生自噬行为以保护损伤肌细胞。LANA等^[20]也认为宰后肌肉中ROS可能诱导肌细胞发生凋亡或自噬,尤其在ROS不过量时细胞会通过自噬启动自身的防御系统。已有研究也表明,宰后肌细胞缺氧环境下出现了Becline-1和LC3蛋白表达量提高等典型自噬特征,并可通过细胞自噬诱导剂雷帕霉素及其抑制剂3-甲基腺嘌呤孵育处理调控细胞自噬,并进一步调控凋亡过程^[21]。宰后肌细胞自噬应该是机体发生的一种短暂保护行为,随着宰后时间的延长,持续的缺氧使ROS大量累积,机体的抗氧化功能消失,最终肌细胞必然凋亡。自噬和凋亡是宰后肌细胞生死走向的两个方向,两者发生程度的大小主要受线粒体调控。因为线粒体是产生ROS的主要场所,同时也最易受到ROS攻击,造成线粒体损伤,其释放出“死亡因子”或“保护因子”的多少和程度,直接调控缺氧环境下细胞是否死亡以及如何死亡。

图1

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图1宰后肌肉嫩化过程中的生化变化

Fig. 1Biochemical changes of postmortem muscle tenderization

1.3 宰后后期肌细胞可能从凋亡转变为坏死

随着对宰后肌细胞死亡方式研究的逐渐深入,有****发现并不是所有的宰后肌细胞以凋亡形式死亡,随着宰后时间延长,肌细胞中出现坏死的典型特征。如CAO等^[12]观察宰后牛肉骨骼肌细胞形态时发现了肌纤维的玻璃化,部分细胞核的核质完全溃散,核质消失等典型坏死特征,并认为宰后肌细胞凋亡和坏死共存。DEGTEREV等^[22]认为凋亡和坏死是细胞死亡的两种极端类型,两种死亡方式可相互转化,并会出现凋亡和坏死特征并存的现象。因此,宰后肌细胞死亡可能存在凋亡、凋亡性坏死等多种模式共存,宰后早期出现凋亡特征,而后期转化为坏死,且凋亡和坏死机制并不是截然分开,而是共存或者重叠（图1）。

宰后肌细胞多种死亡模式间的交叉、转换可能与外界刺激的强度、持续时间及动物品种等因素相关。目前关于这方面的研究还未见相关报道,从理论本质上分析,细胞内能量变化和线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放状态可能是调控宰后肌细胞死亡的关键。首先,细胞凋亡是一个需要消耗能量的过程,而坏死的发生不需要能量。动物被屠宰放血后,机体能量再生功能丧失,残存的ATP在无氧条件下也急剧下降,如猪肉宰后24 h的ATP几乎被耗尽^[23],当需要大量能量的凋亡过程不能进行时,凋亡过程可能转化为坏死。相反,如果能阻止明显的ATP耗竭,细胞坏死可能就很难发生^[19]。其次,线粒体不仅是细胞内能量代谢的场所,同时也是细胞死亡的决策者和执行者^[24]。MPTP调控的线粒体死亡因子释放是细胞内死亡级联反应的总开关,其开放状态直接决定着细胞以何种途径进行死亡^[25]。大多数凋亡过程需要细胞凋亡酶来完成最后的执行过程,钙激活酶虽然也参与部分细胞凋亡过程,但其主要是执行细胞的坏死程序。如果宰后细胞是以多种死亡形式共存,凋亡过程可以转化为坏死,那么细胞凋亡酶和钙激活酶之间应该存在交互作用。HUANG等^[26]研究发现,宰后肌肉成熟过程中细胞凋亡酶-3可以降解Calpastatin,从而影响钙激活酶的活性,Calpastatin可能是细胞凋亡酶和钙激活酶之间相互作用的中间链接,相似的试验结果在病理性凋亡模型中也有报道^[27,28]。同时也有研究表明,钙激活酶可以直接裂解细胞凋亡酶而使其失活^[29]。因此,宰后肌肉中细胞凋亡酶和钙激活酶之间是存在相互作用的,并且细胞凋亡酶早于钙激活酶激活,激活的细胞凋亡酶可通过降解Calpastatin参与钙激活酶的激活过程,而激活后的钙激活酶可使细胞凋亡酶失活。这也与宰后肌细胞从凋亡向坏死转变的推想一致。

2 细胞凋亡酶的主要激活通路

细胞凋亡酶激活是大多数凋亡程序所必需的程序,虽然少数凋亡不需要凋亡酶参与。细胞凋亡酶激活涉及到一系列激活/抑制因子的调控,在细胞受到不同的凋亡刺激时,细胞凋亡酶按不同通路被激活。目前已发现的激活通路主要包括死亡受体通路（外通路）、线粒体通路（内通路）和内质网通路^[30]（图2）。

图2

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图2细胞凋亡的主要通路

Fig. 2The main pathways of apoptosis

2.1 死亡受体通路

死亡受体通路主要涉及肿瘤坏死因子受体和接头蛋白。肿瘤坏死因子受体以三聚体形式存在于细胞表面,具有一个胞外的配体结合结构域,一个单次跨膜结构域和一个膜内的死亡结构域（death domain,DD）。接头蛋白一端为DD,另一端为死亡效应结构域（death effector domain,DED）。当细胞受到凋亡刺激后,肿瘤坏死因子受体的配体结合结构域与配体结合,并发生构象变化,引起其死亡结构域与接头蛋白的死亡结构域结合。接头蛋白另一端DED募集凋亡启动酶-8和-10的前体,形成死亡诱导信号复合体,凋亡启动酶-8和-10的酶原前体互相靠近,发生自我切割而得以活化。活化后的凋亡启动酶-8和-10进一步激活下游的凋亡效应酶-3、-6和-7,并由凋亡效应酶切割特定底物而完成细胞凋亡过程。

2.2 线粒体通路

线粒体通路通常在细胞内部损伤或应激条件下激活。细胞收到凋亡信号后,在Bcl家族蛋白的调控下,线粒体中细胞色素c（cytochrome c,Cyt-c）、第二线粒体来源细胞凋亡酶激活因子（second mitochondria- derived activator of caspase,SMAC）、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）和核酸内切酶G（endonuclease G,Endo G）等凋亡因子被释放,释放至细胞质中的Cyt-c与凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factors 1,Apaf-1）结合。Apaf-l有一个CARD（caspase recruitment domain）结构域,一个核酸结合结构域和多个WD40结构域。生理条件下,1个CARD结构域和2个WD40结构域结合,而释放至细胞质中的Cyt-c由于CARD与WD40结构域结合,从而释放出Apaf-1的CARD结构域。在ATP/dATP存在下,Apaf-1进一步寡聚化,形成七聚体复合物,即凋亡小体,进而CARD结构域被暴露在外,与凋亡启动酶-9酶原前体的CARD结构域结合,使凋亡启动酶-9前体相互靠近,发生自我切割而活化。活化后的凋亡启动酶-9激活下游的凋亡效应酶-3、-6和-7,导致细胞凋亡。除Cyt-c外,线粒体释放出的SMAC可竞争性结合细胞中存在的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）,从而起到对细胞凋亡酶的抑制作用;而AIF和Endo G可不依赖细胞凋亡酶,直接作用于细胞核,导致染色体皱缩和DNA碎片化,这也说明存在独立于细胞凋亡酶活化的另一条凋亡通路。

2.3 内质网通路

内质网通路是指内质网受到长时间刺激或刺激强度过大时,内质网内大量错误蛋白或未折叠蛋白急剧增加,超过细胞生存途径所能处理的范围,使内质网内的稳态遭到破坏,导致细胞凋亡。细胞凋亡酶-12在内质网应激诱导的细胞凋亡途径中具有核心作用,目前关于细胞凋亡酶-12的激活还不确定,主要存在两种方式:一是Ⅰ型跨膜糖蛋白激酶通过受体分子TRAF2与细胞凋亡酶-12酶原反应,使细胞凋亡酶-12酶原从TRAF2上被释放,然后经同源二聚化和自动加工过程而激活^[31];二是内质网应激过程释放的钙离子,激活钙激活酶,裂解细胞凋亡酶-12的CARD前肽区域,细胞凋亡酶-12合成的p30亚基被自动加工成活跃的p20和p10亚基。激活后的细胞凋亡酶-12进一步激活凋亡效应酶3,最终导致细胞发生凋亡。

3 线粒体通路是宰后细胞凋亡酶激活的重要路径

动物被屠宰后,由于氧供应的终止,肌细胞很快处于无氧环境。在这种条件下,肌细胞可能以线粒体通路来进行凋亡^[32]。相关试验结果也表明,宰后肌肉中细胞凋亡酶-9早于细胞凋亡酶-3激活,且两者之间具有相关性^[33]。HUANG等^[34]在宰后牛肉中发现线粒体中的Cyt-c可被释放至胞浆中,并认为Bax可能是调控细胞凋亡的关键因子。WANG等^[35]在宰后牦牛肉中检测到线粒体活性氧大量累积、膜电位下降、MPTP开放、Cyt-c释放、细胞凋亡酶激活等线粒体通路的典型特征。R?NNING等^[36]利用原代牛骨骼肌细胞缺氧模型也检测到了线粒体膜电位的下降和Cyt-c的释放。这些结果均说明线粒体通路是宰后肌肉细胞凋亡酶的一条重要激活路径。

3.1 宰后肌肉线粒体凋亡因子的释放

线粒体是细胞凋亡的决策者和执行者,线粒体内Cyt-c、SMAC等凋亡因子的释放是线粒体通路凋亡的核心程序,其释放机理一直是凋亡研究领域的热点和难点^[37]。线粒体具有典型的脂质双分子膜结构（图3）,包括外膜（OM）和内膜（IM）,线粒体内膜中平行于外膜的部分称为内边界膜（IBM）;向线粒体基质折叠形成大小和形状各异的凹陷结构称为嵴（Cristae）,内边界膜与嵴的连接处是一种狭窄的颈状结构,称为嵴连接点（Crista junctions）^[38]。早期研究主要认为线粒体膜通透化是引起线粒体凋亡因子释放的主要原因,主要受Bcl家族蛋白调控。在线粒体膜结构中存在由腺苷转移酶（ANT）、电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel,VDAC）和亲环素D共同组成的线粒体通透性膜通透转运孔,生理情况下MPTP仅允许相对分子质量小于1.5×10³的分子通过,维持线粒体膜内外的电位差。当细胞受到凋亡刺激后,Bcl蛋白家族中的促凋亡成员引发死亡效应物Bax/Bak的寡聚化,形成寡聚复合物并转移至线粒体外膜,从而引起MPTP开放和线粒体膜电位下降并释放凋亡因子^[39]。WANG等^[35]利用环孢菌素A（形成MPTP的抑制剂）原位处理宰后牦牛肉后发现,MPTP的开放是造成线粒体膜电位下降和Cyt-c释放的原因,并可通过激活细胞凋亡酶而改善宰后嫩度。

近期的研究表明,线粒体凋亡因子释放时,其内膜中的嵴结构会发生明显变化,主要包括嵴的数量和形状的改变^[40]。有****发现85%的Cyt-c存在于线粒体嵴结构上,如果外膜通透化直接释放Cyt-c,Cyt-c应该可自由通过嵴结构,大量Cyt-c不可能稳定存在嵴结构上^[38]。因此,线粒体凋亡因子释放除外膜通透化外,还需要线粒体嵴的重构（嵴形态变化、嵴连接点扩大等）,打开嵴内部和膜间隙的通道。视神经萎缩蛋白1（optic atrophy1,OPA1）、MICOS复合体等是调控细胞线粒体嵴重构的关键因子^[41]。另外,线粒体作为高度动态的细胞器,细胞发生凋亡时,其外部形态也会发生改变,可从管状向颗粒状转变,这种颗粒状结构主要是由线粒体的分裂大于融合所造成^[42]。

3.2 宰后肌肉线粒体损伤及对嫩度的调控

动物刚被屠宰放血后,由于氧和营养物质供应的终止,细胞内的氧化/抗氧化平衡体系被打破,ROS大量累积,必然造成肌细胞的损伤^[20]。线粒体作为细胞“能量工厂”是ROS产生的主要场所,同时也是最易受ROS攻击的细胞器。宰后肌肉线粒体会逐渐发生氧化损伤,随着宰后时间延长,线粒体损伤水平逐渐提升,而嫩度逐步改善,两者之间具有显著相关性^[35]。同时不同嫩度牛肉的蛋白质组学数据也发现,嫩度较好的肉具有更高的损伤水平^[43]。宰后肌肉中线粒体酶（异柠檬酸脱氢酶）活性也与嫩度之间具有极显著相关性^[44]。因此,宰后肌肉线粒体会发生损伤,并可参与宰后肌肉嫩化的调控过程。

线粒体对宰后嫩化过程的调控机理可能涉及两个方面:（1）宰后早期肌肉中的线粒体仍具有一定的活性,可通过能量代谢影响肌肉pH的变化,从而调控宰后嫩化过程。MATARNEH等^[45]研究发现,离体条件下线粒体可通过增强糖酵解通量、加速ATP水解,而加快pH的下降。该团队的进一步研究发现F₁-ATP合成酶（F₁-ATPase）是线粒体发挥这一功能的主要作用者^[46]。SCHEFFLER等^[47]研究发现,线粒体复合物I、IV、V的抑制剂对宰后牛肉线粒体处理可加速能量代谢和pH下降。这些结果均支持线粒体通过能量代谢影响宰后嫩化过程。（2）除能量代谢外,线粒体在凋亡过程中也发挥重要作用,也可以通过释放系列凋亡因子,调控细胞凋亡酶活性,从而影响宰后嫩化过程。许多研究已表明宰后线粒体途径的凋亡可调控细胞凋亡酶活性和其对肌原纤维蛋白的水解,从而影响宰后嫩度变化。

3.3 宰后肌肉线粒体与内质网间可能的相互作用

线粒体在细胞凋亡的启动和信号扩大过程中发挥重要作用。凋亡过程中线粒体中的钙离子浓度会升高,过量钙离子摄入（钙超载）会导致线粒体发生肿胀、膜电势降低,继而触发凋亡。近年来,凋亡过程中线粒体和内质网之间的互作也广受关注,这种互作可能调控线粒体-内质网间Ca²⁺信号传导以及细胞凋亡过程。LIU等^[48]利用蛋白质组学技术在兔肉骨骼肌中检测到线粒体和肌浆内质网之间的交联,并发现VDAC1、VDAC2和VDAC3可能参与了线粒体和内质网交联体的形成。WANG等^[35]发现宰后肌细胞的钙超载影响MPTP的开放及细胞凋亡过程。HUANG等^[49]研究也表明,除钙激活酶外,钙离子也可调控细胞凋亡酶活性而影响宰后嫩化过程。鉴于钙离子在宰后肌细胞凋亡和嫩化过程中的重要作用,内质网作为细胞内储存钙离子的主要场所,也可能通过调控钙离子释放,从而与线粒体发生交互作用。电镜结构下可观察到线粒体和内质网之间存在偶联结构,并可分离纯化出偶联结构的蛋白复合体MAMs（mitohcondria associated membrane）^[50]。宰后凋亡过程中,MAMs上的IP3R等钙离子调控蛋白可能介导内质网上钙离子的释放,钙离子被线粒体摄入超载后,加速线粒体途径凋亡过程的发生,而凋亡发生后Cyt-c释放入胞浆,通过与IP3R结合并促进其功能,导致更多的钙离子从内质网向线粒体传递,线粒体和内质网间通过钙离子相互促进,逐步放大凋亡信号。内质网与线粒体间除通过钙离子发生交互作用外,也有****发现内质网参与了线粒体分离,从而导致凋亡发生。当线粒体与内质网结构偶联形成后,内质网“缠绕”线粒体促使局部收缩,并逐步“募集”线粒体分裂相关蛋白Drp1/Dnm1等,最后将线粒体分裂为二^[51]。目前,宰后肌细胞中线粒体和内质网是否发生交互及其相关机理的研究还未见相关报道。

3.4 宰后肌肉线粒体与溶酶体间可能的相互作用

线粒体损伤后其“产能”功能也逐渐丧失,从有氧呼吸到无氧酵解,不光造成ATP下降,同时还调控pH的变化。而pH的下降被认为可以破坏溶酶体膜,使组织蛋白酶得以释放,从而参与嫩化过程^[52]。因此,线粒体与溶酶体之间也可能存在交互作用。ZHANG等^[53]调查了宰后牛肉溶酶体和线粒体间相互作用,发现线粒体ROS可以通过累积氧化还原活性的铁离子来破坏溶酶体膜的稳定性,同时溶酶体释放出的组织蛋白酶可以通过激活线粒体Bax和Bid而加速线粒体膜通透性。

4 细胞凋亡酶对宰后肌肉嫩化的作用

宰后肌肉嫩化是一个复杂的生化过程,涉及到内源酶作用下的细胞骨架及相关蛋白的有限降解。宰后肌细胞以凋亡的形式死亡,细胞凋亡酶被激活,这为其参与宰后嫩化过程提供了前提基础。但细胞凋亡酶是否贡献于宰后肌肉嫩化过程还要从其是否参与嫩度相关蛋白的降解来分析。目前有关细胞凋亡酶对宰后肌肉嫩化的相关研究,可归纳为以下几个方面:

4.1 宰后细胞凋亡酶及相关调控因子与嫩度间的相关性

相关性分析是统计学中的一种重要分析方法。如果一种酶或其相关因子与宰后嫩度的变化存在显著相关性,则可以从侧面反映出这种酶类参与肌肉的宰后成熟过程。宰后细胞凋亡酶活性及相关调控因子与嫩度间的相关性被广泛研究。KEMP等^[54]发现宰后猪肉的细胞凋亡酶-3和-7的活性在宰后2 h达到最高,32 h后其活性快速下降,且其宰后0 h和32 h的活性比与嫩度间存在显著相关性。CAO等^[33]在宰后牛肉中也检测到细胞凋亡酶活性和剪切力之间存在显著负相关。ZHANG等^[55]在宰后鸭肉中发现细胞凋亡酶活性变化与肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index,MFI）显著正相关,而与剪切力值显著负相关。BERNARD等^[56]的研究结果也表明抑凋亡因子热收缩蛋白（heat shock protein,HSP）的基因表达与嫩度之间相关性极为显著。这些结果表明细胞凋亡酶与宰后肌肉嫩度之间显著相关,可参与宰后肌肉嫩化过程。然而,也有****研究认为牛肉中细胞凋亡酶-3的活性逐渐下降,但与剪切力之间无显著相关性。这些结果之间的不一致性可能与测定方法或不同物种之间的差异有关,毕竟不同动物对宰后应激条件具有不同的应答能力。

4.2 不同嫩度模型下细胞凋亡酶及相关因子变化

比较不同嫩度肌肉模型（不同部位、嫩化加速或抑制）下内源酶及相关因子的变化差异也是肉品领域研究的常用手段。宰后不同嫩度的背最长肌、腰大肌和半腱肌三部位猪肉,虽然mRNA丰度无区别,但具有不同的细胞凋亡酶3/7表达量和活性变化^[15]。不同嫩度的相同部位肉也具有不同的细胞凋亡酶及相关调控因子表达,如LAVILLE等^[57]发现宰后嫩度较好的牛肉具有更高的线粒体内外膜蛋白表达量。采用不同的方法加速或抑制宰后嫩化过程后,其细胞凋亡酶及相关调控因子也发生对应的变化。如采用钙离子注射肌肉加速嫩化过程后,除钙激活酶加速激活外,细胞凋亡酶的活性及表达量、细胞色素c等凋亡激活因子的表达量也显著提高,而采用锌离子注射得到相反的结果^[49]。CHEN等^[58]利用低频和高频超声处理改善鸡肉嫩度时,发现包括细胞凋亡酶加速激活、α-spectrin被凋亡酶降解生成120 kD特征片段等凋亡级联反应事件。这些结果说明细胞凋亡酶参与了宰后肌肉嫩化过程,改善嫩度。

4.3 细胞凋亡酶抑制/诱导剂对宰后肌肉肌原纤维蛋白原位降解的影响

肌原纤维蛋白的有限降解是肌肉宰后嫩度改善的主要原因,利用内源酶的专一性抑制剂或诱导剂对宰后肌肉注射/浸泡处理,并分析其对肌原纤维降解的影响是探讨肌肉凋亡酶是否参与宰后嫩化过程的有力证据。HUANG等^[59]发现细胞凋亡酶-3专一性抑制剂DEVD-CHO可明显抑制鸡肉伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白的降解和肌钙蛋白-T 28—30 kD特征降解产物的生成,同时该抑制剂对钙激活酶的活性无显著影响。随后HUANG等^[60]利用细胞凋亡酶-6的专一性抑制剂VEID-CHO处理鸡胸肉也得到相似的结果,并揭示出该抑制剂在宰后早期能抑制肌纤维结构的弱化。CHEN等^[16]发现细胞凋亡诱导剂喜树碱和依托泊苷可加速宰后肌肉中细胞凋亡酶-3和-7的激活,提高肌钙蛋白-T嫩度特征降解产物28—30 kD片段的含量,并加速肌纤维结构中A带和I带的弱化。这些结果说明,细胞凋亡酶的抑制剂或诱导剂可以影响肌原纤维蛋白的降解和肌纤维结构的变化,原位模型下揭示了细胞凋亡酶参与宰后肌肉嫩化过程。

4.4 细胞凋亡酶对宰后肌肉肌原纤维蛋白的体外降解

判断一种肌肉内源酶是否参与宰后嫩化过程的一个重要标准,就是该酶在体外最佳条件下能否模拟自然成熟条件下肌原纤维蛋白的降解变化。体外降解模型可排除肌肉内一系列内源酶和各种激活/抑制因子的干扰作用,在宰后肌肉嫩化领域被广泛使用。KEMP等^[61]利用活性细胞凋亡酶-3体外孵育猪肉肌原纤维蛋白,利用MALDI-TOF（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）质谱检测到肌球蛋白轻链、肌钙蛋白-T和肌动蛋白分别降解生成18、28和32 kD的产物,并通过Western发现该酶引起肌间线蛋白降解。HUANG等^[62]利用活性细胞凋亡酶-3体外孵育鸡肉肌原纤维蛋白,发现该酶能降解伴肌球蛋白和伴肌动蛋白,且降解变化与自然成熟过程相似,但不能导致肌间线蛋白降解,也不能使肌钙蛋白-T降解生成28—30 kD的降解产物。MOHRHAUSER等^[63]用重组细胞凋亡酶-3体外降解牛肉肌原纤维蛋白,但没检测到伴肌球蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的任何降解产物。HUANG等^[64]比较了离体条件下细胞凋亡酶-3、-6对牛肉肌原纤维蛋白降解,发现细胞凋亡酶-3可模拟伴肌球蛋白和伴肌动蛋白降解,不能降解肌间线蛋白,而凋亡效应酶6能够模拟肌间线蛋白部分降解产物。

综上分析,细胞凋亡酶主要在宰后早期被激活,可参与宰后嫩化过程中部分肌原纤维蛋白的有限降解,但随着宰后时间延长,可能由于ATP的耗尽或其他因子作用导致细胞凋亡酶失活,从而使其只参与宰后早期的嫩化过程。因此,细胞凋亡酶和肉中其他内源酶一起参与蛋白质降解,改善嫩度,宰后嫩化是多种内源酶协同作用的结果。

5 结论与展望

宰后细胞死亡和肌肉嫩化是两个高度相关的过程,在宰后肌肉嫩化的同时,伴随着肌细胞的逐渐死亡,两个生化过程最终都是通过内源酶对蛋白质的降解来完成。宰后僵直前期,肌细胞可能在生（自噬）与死（凋亡）之间选择,早期细胞以自噬方式进行自我保护,但随着ROS对细胞的损伤及ATP含量降低,最终细胞选择以凋亡的形式死亡,凋亡过程可能持续至整个僵直期和成熟早期。随着成熟时间的延长,除细胞凋亡外,坏死也可能参与其中,宰后肌细胞可能以多种死亡方式并存的状态完成死亡程序,死亡方式间的转化可能受细胞内能量变化和线粒体通透性转换孔开放状态所调控。未来宰后嫩化机制的研究可以在已发现的内源酶有限降解肌原纤维蛋白的基础上,进一步从内源酶激活通路及各通路间的相互衔接方面,构建宰后肌肉嫩化的生化调控网络,以便对宰后肌肉嫩度进行系统调控。

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