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甜瓜种皮颜色控制基因CmSC1的精细定位及候选基因分析

本站小编 Free考研考试/2021-12-26
马建,1, 李丛丛,2, 黄亚婷1, 谢雨黎1, 程玲玲1, 王建设,11北京市农林科学院蔬菜研究中心/农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,北京 100097
2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心/农业基因资源与生物技术北京市重点实验室,北京 100097

Fine Mapping and Candidate Gene Analysis of Seed Coat Color Gene CmSC1 in Melon

MA Jian,1, LI CongCong,2, HUANG YaTing1, XIE YuLi1, CHENG LingLing1, WANG JianShe,1 1Beijing Vegetable research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100097
2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing 100097

通讯作者: 王建设,E-mail: wangjianshe@nercv.org

马建和李丛丛为同等贡献作者。
责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-07-30接受日期:2020-09-3网络出版日期:2021-05-16
基金资助:国家自然科学基金.31701937
蔬菜中心科研创新基金.KYCX202001-11
北京市农林科学院科技创新能力建设专项.KJCX20200113


Received:2020-07-30Accepted:2020-09-3Online:2021-05-16
作者简介 About authors
马建,E-mail: majian@nercv.org。

李丛丛,E-mail: cong861109@163.com。







摘要
【目的】通过对甜瓜种皮颜色进行遗传分析及基因精细定位,并推测其候选基因和开发特异分子标记,为下一步该基因的功能研究及合理利用奠定基础。【方法】利用白色种皮材料HP22和黄色种皮材料B8、B150分别配制杂交组合,获得后代遗传分离群体并进行种皮颜色的表型调查及遗传分析,通过基因图位克隆方法完成基因的精细定位。通过对定位区间内注释基因进行编码区序列和功能分析确定关键候选目的基因。【结果】甜瓜白色种皮对黄色种皮为显性,由单显性基因CmSC1控制并表现延迟遗传效应。利用368个黄色种皮F2单株最终将CmSC1精细定位于第5号染色体分子标记S27和S28之间物理距离约95 kb区间内,共包含12个注释基因。其中一个为拟南芥AtTT8同源的编码bHLH转录因子蛋白的MELO3C014406,经序列变异位点分析,黄色种皮材料B8和B150分别在该基因ATG下游第47位碱基处插入碱基A以及在第260位碱基处缺失14 bp导致翻译蛋白提前终止,致使后面功能结构域完全缺失,进而通过开发特异分子标记YS及序列分析,发现65份黄色种皮材料均发生这两种突变形式中的一种,推测MELO3C014406即为控制种皮颜色CmSC1的目的基因。【结论】本研究将控制种皮颜色的CmSC1精细定位于第5染色体95 kb区间内,推测MELO3C014406为最终目的基因,并开发了特异分子标记YS。
关键词： 甜瓜;种皮颜色;基因定位;原花青素;bHLH转录因子

Abstract
【Objective】In this study, the genetic analysis and fine mapping of melon seed coat color gene were performed, and the candidate gene was isolated and the molecular marker developed, so as to provide a foundation for gene function and rational utilization. 【Method】The inbred line HP22 with white seed coat was crossed with the inbred line B8 and B150 with yellow seed coat, and the offspring population was obtained, respectively. The seed coat colors of offspring plants were investigated by visual inspection. The locus of gene was fine mapped through map-based cloning strategy, and the candidate target gene in the mapping region was determined by gene sequencing and function analysis of gene coding region. 【Result】The white seed coat was dominant to yellow, which was controlled by a single dominant gene locus, named CmSC1, showed delayed genetic characteristic. Using 368 yellow seed coat individuals from F2 population, the target gene CmSC1 was delimited to a 95 kb interval flanked by markers S27 and S28 on chromosome 5 that contained twelve annotated open reading frames (ORFs). Among of them, the MELO3C014406 gene encoded a bHLH transcription factor protein which was homologous to the Arabidopsis AtTT8 gene. Sequence analysis of MELO3C014406 gene in the yellow seed coat inbred lines indicated that two types of sequence variation were identified. The first type was an A insertion at the 47th base pairs position downstream of ATG, and the other was a 14 bp deletion at the 260th base pair position downstream of ATG, which caused premature termination and produced truncated proteins, respectively. Furthermore, the sequencing analysis of 65 yellow seed coat accessions were detected by specific molecular marker YS, and the results showed that they all contained one mutation type of two variation types. These results suggested that the MELO3C014406 gene was an ideal candidate gene for CmSC1 controlling seed coat color.【Conclusion】In this study, the CmSC1 gene regulating seed coat color was finally mapped to a 95 kb interval, and the MELO3C014406 gene was presumed to be the candidate gene. In addition, a specific marker YS was developed based on the 14 bp deletion of MELO3C014406 gene.
Keywords：melon (Cucumis melo L.);seed coat color;gene mapping;proanthocyanidins;basic helix-loop-helix transcription factor


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本文引用格式
马建, 李丛丛, 黄亚婷, 谢雨黎, 程玲玲, 王建设. 甜瓜种皮颜色控制基因CmSC1的精细定位及候选基因分析[J]. 中国农业科学, 2021, 54(10): 2167-2178 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.012
MA Jian, LI CongCong, HUANG YaTing, XIE YuLi, CHENG LingLing, WANG JianShe. Fine Mapping and Candidate Gene Analysis of Seed Coat Color Gene CmSC1 in Melon[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(10): 2167-2178 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.012


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0 引言

【研究意义】甜瓜（Cucumis melo L.）为葫芦科甜瓜属一年生草本植物,是重要的园艺作物之一。我国甜瓜的种植面积、产量和消费量均居世界首位,甜瓜本身具有较强的杂种优势,通过杂交方式培育甜瓜新品种具有广阔的市场前景和较大的经济价值[1]。由于甜瓜杂交种子生产多采用人工授粉的方式进行,导致种子收获及加工过程存在生物学混杂和机械混杂等问题,而对于杂交种的纯度鉴定,不论是田间鉴定还是室内分子标记检测,都是工作量大、成本较高,如果利用黄色种皮等作为杂种纯度鉴定的目测标记性状,则可节约纯度鉴定的部分成本[2]。探究甜瓜种皮颜色的遗传机制,定位并克隆种皮颜色控制基因,对阐明甜瓜种子发育中色素调控的分子机制,培育特色甜瓜品种及种皮颜色标记性状的利用具有重要意义。【前人研究进展】对模式植物拟南芥的研究表明,种子中类黄酮的代谢途径主要包括花青素途径、黄酮途径以及原花青素途径[3,4,5]。拟南芥的种皮颜色主要由原花青素的合成和积累决定,正常情况下原花青素被氧化形成棕色物质而使种皮呈现褐色,若原花青素的合成和积累受阻,种皮颜色则变为透明无色,籽粒呈现黄色。研究表明原花青素的生物合成主要受两类基因的控制,一类是结构基因,主要编码生物合成途径中所需的一些酶类,另一类是调控基因,主要编码一些转录因子来调控结构基因的时空表达,这两类基因的突变,都会导致原花青素的合成和积累异常[6]。目前,拟南芥种皮中原花青素合成的调控网络已研究得比较清楚,主要受MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体的调控,包括TT2、TT8和TTG1三个基因[7]。其中TT8编码bHLH类转录因子,是参与类黄酮代谢的重要转录因子,直接调控DIHYDROFLAVONOL 4-REDUCTASE（DFR）和BANYULS（BAN）等基因的表达[8]。已有研究表明bHLH类转录因子是广泛存在于植物中的重要转录因子,其显著特点是包含约60个氨基酸残基组成的碱性螺旋环螺旋（bHLH）结构域,碱性区域位于N端,与HLH基序相邻,主要为DNA结合区域,而HLH基序则主要是形成同源或异源二聚体,从而结合下游靶基因启动子进而调控基因的转录[9,10]。拟南芥基因组中包含约133个bHLH类转录因子,共分为12个亚家族[9],其中主要参与类黄酮合成调控途径的IIIf亚家族特点为N端包含蛋白与蛋白互作的R2R3-MYB或称MYC结构域[11,12,13],该亚家族蛋白包括GLABRA3（GL3）[13]、ENHANCER of GLABRA3（EGL3）[14,15]、TRANSPARENT TESTA8（TT8）[8]以及AtMYC1[16]等蛋白。此外,IIIf亚家族在其他植物中也参与花青素合成途径,例如白菜型油菜的BrTT8[17]、矮牵牛中的ANTHOCYANIN1（PhAN1）[18,19]、玉米中的INTENSIFIER1（ZmIN1）[20]以及水稻的Rc[21]蛋白。目前,对瓜类作物的种皮颜色相关研究中,谭澍等[22]研究表明苦瓜种皮颜色的黑色对棕黄色受1对显性基因控制;周庆友[23]研究表明丝瓜的黑色种皮对白色为显性,受Ws（white seed）控制;LI等[24]对西瓜的种皮颜色遗传研究表明黑色对黄色受单显性基因ClCS1控制,推测可能是由于多酚氧化酶基因（polyphenol oxidase,PPO）发生了突变所致。在甜瓜中,种皮颜色分为灰白色或白色、黄色和棕褐色等类型,其中厚皮甜瓜的种子以黄色居多,而薄皮甜瓜的种子则多为灰白色。1936年,HAGIWARA和KAMIMURA[25]首次对甜瓜种皮颜色的遗传进行了研究,认为白色种皮对黄色和棕褐色为显性,由Wt（White testa）控制。PéRIN等[26]对甜瓜资源PI414723的白色种皮性状进行了遗传分析,表明白色种皮对黄色受单显性基因Wt-2控制,并将该基因定位于第IV连锁群。张可鑫等[27]利用分子标记将控制甜瓜白色种皮的WT定位在第5连锁群20.3 cM范围内,与标记HD0520和HD0519连锁。【本研究切入点】随着甜瓜基因组测序的完成,与甜瓜果肉颜色[28]、株型[29]、苦味[30]和抗性[31]等性状有关的基因相继被定位和克隆,但关于控制种皮颜色的基因尚未明确。【拟解决的关键问题】本研究以甜瓜白色种皮HP22和黄色种皮B8、B150为材料,通过构建后代分离群体进行种皮颜色的遗传分析和基因定位,以确定控制甜瓜种皮颜色的关键目的基因,为将来该基因的功能研究及利用提供借鉴。

1 材料与方法

试验于2018—2019年在北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青农场进行。

1.1 试验材料及表型调查

分别以白色种皮厚皮甜瓜自交系材料HP22和黄色种皮薄皮甜瓜自交系材料B8（源自‘羊角脆’）为双亲配制正、反交获得F1,F1自交获得F2代。以HP22为父本、黄色种皮厚薄中间型自交系材料B150（源自‘黄子金玉’）为母本杂交获得F1,F1自交获得F2,F2分单株自交获得F2:3家系。以B8为父本、B150为母本杂交获得F1,F1自交获得F2。其余101份材料中,除4份F1材料（‘雪丽脆’‘瑞金’‘冀州鲜’和‘火焰二号’F1）为市场收集外,其余为笔者实验室保存的高代自交系材料。所有材料、后代群体均是育苗后移栽于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青基地大棚内种植。

种皮颜色的调查方法:各材料、后代群体分单株自交,待果实成熟后收获种子,种子晾干后调查种皮颜色,记载该植株对应表型。例如,种植F1代单株,考察F1代所结种子颜色示为F1代表型。每个F2:3家系种植10株,分单株调查表型并记载。

1.2 DNA提取及PCR扩增、检测

利用CTAB法[32]提取甜瓜叶片的基因组DNA。InDel标记PCR扩增采用10 μL扩增反应体系,包括1 μL Buffer、0.8 μL dNTPs（2.5 mmol?L-1 each）、1 μL Primers（10 μmol?L-1,F+R）、1 μL基因组DNA（50 ng?μL-1）、0.1 μL EasyTaq? DNA Polymerase for PAGE（购自北京全式金生物技术有限公司）和6.1 μL ddH2O;反应程序:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,运行35个循环;72℃延伸5 min。扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染后在观片机上拍照、记录。

1.3 RNA提取与基因扩增、测序

两周左右的甜瓜幼苗经液氮研磨后按照植物RNA提取试剂盒（0416-50 GK型,北京华越洋生物科技有限公司）提供的方法提取总RNA。采用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成第一链cDNA。基因扩增PCR反应体系:2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL,10 μL dNTPs（2 mmol?L-1 each）,2 μL引物（10 μmol?L-1,F+R）,1 μL KOD FX酶（1 U?μL-1,东洋纺（上海）生物科技有限公司）,2 μL DNA模板（100 ng?μL-1）,加ddH2O至50 μL。反应条件:94℃预变性2 min;98℃变性10 s,59℃退火30s,68℃依片段大小延伸~1 kb?min-1,35个循环;68℃延伸5 min。扩增产物利用1%琼脂糖胶检测,由北京博迈德科技发展有限公司完成测序,所得序列用DNAMAN软件拼接比对。

1.4 分子标记的开发

根据甜瓜基因组数据库（http://cucurbitgenomics.org/organism/18）公布的基因组及基因注释数据,利用在线引物设计程序Primer-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计引物,并交由北京博迈德科技发展有限公司合成,所用引物序列见表1。

Table 1
表1
表1本研究所用的PCR引物序列
Table 1PCR primer sequences used in this study
引物名称 Primer正向引物 Forward primer (5'-3')反向引物 Reverse primer (5'-3')
ID1716TTCCACGAACTCAGGAGCTGAGTAGCATGAGGCTAGACTTGA
S24TGAACTCGTGTCTAACGTACCAACTCCACTCTCGTATCCAGT
S26GCAATGGAGGTGAGTGCCAAGCATGTCTTTGCCATGTTGTGT
S27ATGACCAAACAATGGTGCTGTGGCTTGTGTGAGAGTAAATCAAGGT
S2AGAGGGAAGCCATCAAGCAAATTGTACATACTGTCTAGGGTTTCT
S28AAACCATTGACACAAGCTCCAACATCACATGTATCAAGTGCCT
S29ATTCCATTTTCGTCAAACAACTTTCGTCCATCATGATCTATCGCAAAA
S30GGCTTTCCTTTGTCAGATTCCACCAAAGTGGGGTAGGAGCATT
S33GGTTTATGATGAAAACGACCGAGAGGTGACGAGGTCCAAATAA
S34CACCCACTTAGGGTTGAAGAAGTTTGGAATTGAAGTACACACCT
S35GAGCATTAAGACCAAAGACACAATAAGTAACGAGTGAGGTTGGG
ID3716GCTACAAGCCATGTTGAACTCTTGAAGAAGCGAGGAAAGAATAGG
YSCTTATCCGCCTCCGACACCAGTTAACGCACCCGAACCC
CmSC1AGACCCATTTGTTTCACTTTCACCCAGAGAAGCTTCCACTCCCA

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1.5 蛋白质结构域预测及进化树分析

利用在线程序SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）对蛋白质结构域进行预测。利用NCBI在线程序Protein BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对CmSC1的同源蛋白进行搜索,并利用MEGA4.0软件Neighbor-joining方法构建系统进化树,其中所用蛋白编号为:CmSC1（Cucumis melo,MELO3C014406）、ATX68131.1（Rosa chinensis）、AGL81357.1（Pyrus communis）、LjTT8（Lotus japonicus,BAH28881）、PsbHLH（Pisum sativum,ADO13282）、PhAn1（Petunia hybrida,AAG25927）、NtAN1a（Nicotiana tabacum,AEE99257）、NtAN1b（Nicotiana tabacum,AEE99258）、AtTT8（Arabidopsis thaliana,AT4G09820）、CsaV3_ 6G037080（Cucumis sativus）、Cla97C07G128490（Citrullus lanatus）、OsRC（Oryza sativa,LOC_Os07g11020）、ZmIN1（Zea mays,AAB03841）、AtEGL3（Arabidopsis thaliana,AT1G63650）、CsMYC2（Citus sinensis,ABR68793）、AtGL3（Arabidopsis thaliana,AT5G41315）、MtEGL3（Medicago truncatula,KEH21065）、LjEGL3（Lotus japonicus,AB492284）、BoEGL3（Brassica oleracea,Bo9g035460）[33,34,35]。

2 结果

2.1 甜瓜种皮颜色的表型及遗传分析

如图1所示,HP22种皮颜色为白色,B8和B150种皮颜色为黄色。以HP22为母本、B8或B150为父本杂交F1当代种子种皮颜色为白色,反之以B8或B150为母本、HP22为父本杂交F1当代种子种皮颜色为黄色,而以B8和B150为双亲,正、反交F1代种子种皮颜色均为黄色（图1,表2）。以HP22和B8或B150为双亲的正、反交F1代自交后所得F2代种子种皮颜色均为白色;以B8和B150为双亲的正、反交F1代自交后所得F2代种子种皮颜色均为黄色（图1,表2）,这些数据表明种皮颜色表现为延迟遗传效应。进一步对各杂交组合F2代植株种皮颜色进行调查统计,结果表明:HP22和B8杂交F2代植株所结种子（即F3代）种皮颜色分离比例为白色:黄色=1 029:368,表现3:1的孟德尔遗传分离比（χ20.05=1.41<3.84,p=0.23）;HP22和B150杂交F2代植株种皮颜色分离比例为白色:黄色=358:112,也表现3:1的孟德尔遗传分离比（χ20.05=0.28<3.84,p=0.59）;B8和B150杂交F2代中的115个单株种皮颜色均为黄色。以上数据表明B8和B150中黄色种皮性状由单隐性核基因控制,且受同一基因或一对等位基因控制。因此,暂定该基因名称为CmSC1（Seed Color1）。

图1

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图1种皮颜色表型

Fig. 1Phenotype of seed coat color



Table 2
表2
表2种皮颜色的遗传分析
Table 2Genetic analysis of the seed coat color
亲本或组合
Parents or generation		白色种皮株数
White seed color individuals		黄色种皮株数
Yellow seed color individuals		分离比
Expected ratio		χ20.05值
χ20.05
HP22 (P1)50
B8 (P2)05
B150 (P3)05
F1 (P1♂×P2♀)010
F1 (P1♀×P2♂)100
F1 (P1♂×P3♀)010
F1 (P1♀×P3♂)100
F1 (P2♂×P3♀)010
F1 (P2♀×P3♂)010
F2 (P1×P2)100
F2 (P2×P3)010
F2:3 (P1×P2)10293683:11.41
F2:3 (P1×P3)3581123:10.28
F2:3 (P2×P3)0115

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2.2 CmSC1的定位和物理图谱构建

为分离CmSC1,利用HP22和B8后代F2群体对该基因进行定位。首先,利用实验室保存的420对InDel引物对两亲本的基因组DNA多态性进行鉴定,其中表现出多态性引物248对。随后,利用248对引物对10个黄色种皮F2单株以及亲本HP22、B8共12个样品进行连锁分析,结果表明:5号染色体短臂标记ID1716与黄色种皮性状表现出连锁关系。进一步利用34个黄色种皮F2单株将基因CmSC1初步定位于两标记ID1716和ID3716之间约2 Mb区间内（图2-A）。

图2

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图2CmSC1的物理图谱

A:CmSC1的初步定位;B:CmSC1的精细定位,标记下面的数字代表重组单株数目;C:定位区间内的物理图谱,箭头代表注释基因,其中黑色箭头代表可能的候选基因
Fig. 2Physical maps of the CmSC1 locus

A: The primary mapping of CmSC1 gene; B: Fine mapping of the CmSC1 gene and the numbers under markers indicated the numbers of recombinants (Rec.) ; C: Physical map of the CmSC1 region based on the reference sequence, arrows indicated annotated open reading frames (ORFs) and two black arrows indicated candidate genes in this region


在此基础上,根据甜瓜参考基因组及基因组重测序数据在两标记之间开发出9对多态性分子标记,并对368个黄色种皮F2单株进行基因型数据分析,最终将CmSC1精细定位于标记S27和S28之间,物理距离约为95 kb（chr5:2748480—2844110）,并与标记S2共分离（图2-B）。根据甜瓜V3.6版本的基因组注释信息（http://cucurbitgenomics.org/organism/18）,定位区间内共包含12个注释基因（图2-C,表3）。

Table 3
表3
表3定位区间内的注释基因
Table 3Annotated ORFs of the final region
预测基因编号
Predicted ORF code		基因名称
Gene name		预测基因功能
Putative function
1MELO3C014412铝激活的类苹果酸转运蛋白12 Aluminum-activated malate transporter 12-like
2MELO3C014411富含半胱氨酸的类受体激酶蛋白 Cysteine-rich receptor-kinase-like protein
3MELO3C014408类bHLH69转录因子 Transcription factor bHLH69-like isoform X1
4MELO3C014407醛糖/酮还原酶家族蛋白 Aldo/keto reductase family protein
5MELO3C031122碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Basic helix-loop-helix transcription factor
6MELO3C031072碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Basic helix-loop-helix transcription factor
7MELO3C014405未知功能蛋白 Unknown protein
8MELO3C014409未知功能蛋白 Unknown protein
9MELO3C014403蛋白前转位酶亚基SCY2 Preprotein translocase subunit SCY2
10MELO3C014402FANTASTIC FOUR 2蛋白 Protein FANTASTIC FOUR 2
11MELO3C014401硫胺素磷酸合成酶 Thiamine phosphate synthase
12MELO3C014400硫胺素磷酸合成酶 Thiamine phosphate synthase

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2.3 定位区间内基因序列分析及目的基因确定

根据之前获得的HP22和B8基因组重测序数据,对95 kb区间内12个预测编码基因的编码区序列变异位点进行分析。结果表明:亲本HP22中,物理位置2750429处发生A到C的突变,导致基因MELO3C014412发生单个氨基酸的突变（I65L）;物理位置2765792处插入一个碱基A,物理位置2766079处发生A到G的突变,分别导致基因MELO3C014408在编码第8个氨基酸位置处发生移码突变和单个氨基酸的突变（T104A）;物理位置2755903处发生T到A的突变,导致基因MELO3C014409编码106个氨基酸残基蛋白而提前终止;亲本B8中,物理位置2781790处插入一个碱基A而引入终止密码子,导致基因MELO3C031122编码15个氨基酸残基蛋白而提前终止,其余基因与参考基因组序列一致（表4）。因此,推测MELO3C031122是最可能的候选基因。

Table 4
表4
表4HP22和B8间变异位点检测
Table 4The variation sites of HP22 and B8
基因名称
Gene		变异位点 Variation site
DHL92HP22B8
MELO3C0144122750429A (I65)2750429C (L65)2750429A (I65)
MELO3C0144082765792-, 2766079A (T104)2765792A (移码突变 Code shift mutation), 2766079G (A104)2765792-, 2766079A (T104)
MELO3C0144092755903T2755903A (终止密码 Termination coden)2755903T
MELO3C0311222781790-2781790-2781790A (终止密码 Termination coden)

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基因功能注释显示基因MELO3C031122为编码154个氨基酸残基的bHLH类转录因子蛋白,其编码区共包含4个外显子。为了更准确地鉴定该基因的遗传变异位点,对该基因编码区序列进行扩增,但亲本HP22和B8中均未得到扩增产物。随后,根据甜瓜V3.5版本的基因组注释信息,发现该位置基因组注释为MELO3C014406,包含V3.6版本的MELO3C031122和MELO3C031072两个基因（图2-C,表3）,3个基因均编码bHLH类转录因子。根据MELO3C014406的注释信息,重新设计引物并对该基因进行扩增并得到了目的片段,测序结果显示MELO3C014406共包含两个转录本transcript-1和transcript-2,分别包含6和7个外显子,其差异在于transcript-2在对应的第3、4外显子之间包含一个15 bp的外显子,其中transcript-1与参考基因组注释结果一致（图3-A）。HP22和B8中该基因编码区序列与参考基因组比对结果显示,HP22与参考基因组序列一致,而B8中ATG下游47 bp位置处（ATG47）插入一个碱基A,导致翻译蛋白提前终止,只产生包含15个氨基酸残基的蛋白（图3-B）。同时,也对另一份黄色种皮材料B150的编码区进行了测序,结果显示B150中ATG下游47 bp位置处发生碱基T到C的无义突变,而基因在ATG下游260 bp位置处（ATG260）缺失14 bp导致了移码突变,造成翻译蛋白提前终止,只编码95个氨基酸残基蛋白。

图3

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图3MELO3C014406结构、变异位点、蛋白结构域及进化树分析

A:MELO3C01446结构示意图;B:突变位点序列分析;C:基因编码的蛋白结构域示意图;D:CmSC1及其同源蛋白的进化树分析
Fig. 3Gene structure, mutation site, predicated function domains and phylogenetic analysis of MELO3C014406 gene and its protein

A: Gene structure of MELO3C014406;B: Sequence analysis of mutation sites; C: The predicted function domains of MELO3C014406 protein; D: The phylogenetic tree of CmSC1 and its homologs


HP22中两个转录本transcript-1和transcript-2分别编码645和650个氨基酸残基蛋白,蛋白质结构域预测显示两个转录本均编码N端含MYC结构域的bHLH类转录因子蛋白（图3-C）,基因突变后导致关键结构域的缺失可能影响了该基因的功能。进化树分析表明该基因与拟南芥的种皮颜色基因AtTT8和水稻的果皮色泽控制基因Rc亲缘关系较近（图3-D）,推测MELO3C014406即为CmSC1。

2.4 CmSC1标记的开发及验证

基于黄色种皮材料B150在基因CmSC1的ATG260位点存在14 bp的序列变异,开发了一个可特异性识别该变异位点的InDel标记YS（yellow seed）（表1）。该标记从HP22和B150中扩增产物对应的大小分别为131 bp和117 bp（图4）。随后,利用HP22和B150杂交获得的470个F2:3代家系对该标记的准确性进行验证。470个F3代家系中纯合白色种皮家系:分离家系:纯合黄色种皮家系=120:238:112。利用标记YS对470株F2代植株的基因型鉴定结果表明,120株后代纯合白色种皮家系的基因型与HP22一致,扩增产物为131 bp;238株后代分离家系基因型也为杂合型;112株后代纯合黄色种皮家系的基因型与B150一致,扩增产物为117 bp;部分结果如图4所示,这表明470株F2代单株表型与基因型完全一致,标记YS可以准确地对后代单株的基因型进行鉴定。

图4

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图4标记YS对亲本、F1及其部分F2代单株的基因型分析

P1:HP22;P2:B150;1—36:黄色种皮F2单株;M:100 bp DNA ladder
Fig. 4The genotypic analysis of YS marker in two parents, F1 and selected F2 plants

P1: HP22; P2: B150; 1-36: F2 plants with yellow seed coat; M: 100 bp DNA ladder


此外,利用标记YS也对其余的101份甜瓜资源材料（其中白色种皮34份、黄色种皮65份、褐色种皮2份）进行了基因型鉴定,结果表明:34份白色种皮材料中,30份基因型与HP22一致,其余4份F1材料（‘雪丽脆’‘瑞金’‘冀州鲜’和‘火焰二号’F1）基因型为杂合,其F1代种皮颜色为黄色,F1代自交后种皮颜色为白色,基因型与表型相符;65份黄色种皮材料中,47份基因型与B150一致,均可检测出14 bp缺失,其余19份黄色种皮材料以及两份褐色种皮材料中,对等位基因CmSC1的ATG47位点测序后发现,这些材料均存在碱基A的插入,基因型与B8一致（表5）。

Table 5
表5
表5104份材料的CmSC1基因型分析
Table 5Genotyping of the CmSC1 gene in 104 melon accessions
编号No.材料名称
Accession		种皮颜色（F2）
Seed coat color (F2)		基因型 Genotype编号
No.		材料名称
Accession		种皮颜色（F2）
Seed coat color (F2)		基因型 Genotype
ATG47ATG260ATG47ATG260
1HP22白色 White― ―― ―53H30黄色 Yellow― ―-14 bp
2B8黄色 Yellow+A― ―54H32黄色 Yellow― ―-14 bp
3B150黄色 Yellow― ―-14 bp55H33黄色 Yellow― ―-14 bp
4B1白色 White― ―― ―56H34黄色 Yellow― ―-14 bp
5B2黄色 Yellow+A― ―57H35黄色 Yellow― ―-14 bp
6B3白色 White― ―― ―58H36黄色 Yellow― ―-14 bp
7B4白色 White― ―― ―59H37黄色 Yellow― ―-14 bp
8B5白色 White― ―― ―60H38黄色 Yellow― ―-14 bp
9B6黄色 Yellow+A― ―61H41黄色 Yellow― ―-14 bp
10B7白色 White― ―― ―62H50黄色 Yellow― ―-14 bp
11B9白色 White― ―― ―63H53黄色 Yellow― ―-14 bp
12B10白色 White― ―― ―64H56黄色 Yellow― ―-14 bp
13B11黄色 Yellow+A― ―65H58黄色 Yellow― ―-14 bp
14B12白色 White― ―― ―66H61黄色 Yellow― ―-14 bp
15B13黄色 Yellow+A― ―67H68黄色 Yellow― ―-14 bp
16B14白色 White― ―― ―68H74黄色 Yellow― ―-14 bp
17B15白色 White― ―― ―69H76黄色 Yellow― ―-14 bp
18B16黄色 Yellow+A― ―70H81黄色 Yellow― ―-14 bp
19B17白色 White― ―― ―71H82黄色 Yellow― ―-14 bp
20B18白色 White― ―― ―72H84黄色 Yellow― ―-14 bp
21B19白色 White― ―― ―73H93黄色 Yellow― ―-14 bp
22B20白色 White― ―― ―74H98黄色 Yellow― ―-14 bp
23B21白色 White― ―― ―75H99黄色 Yellow― ―-14 bp
24B22黄色 Yellow+A― ―76H101黄色 Yellow― ―-14 bp
25B23黄色 Yellow+A― ―77H105黄色 Yellow― ―-14 bp
26B24黄色 Yellow― ―-14 bp78H107黄色 Yellow― ―-14 bp
27B27白色 White― ―― ―79H109黄色 Yellow― ―-14 bp
28B29黄色 Yellow― ―-14 bp80H118黄色 Yellow― ―-14 bp
29B31白色 White― ―― ―81H161黄色 Yellow― ―-14 bp
30B32白色 White― ―― ―82HP1白色 White― ―― ―
31B33白色 White― ―― ―83HP2白色 White― ―― ―
32B35黄色 Yellow+A― ―84HP3白色 White― ―― ―
33B36白色 White― ―― ―85HP4白色 White― ―― ―
34B37白色 White― ―― ―86HP5黄色 Yellow― ―-14 bp
35B38白色 White― ―― ―87HP6黄色 Yellow― ―-14 bp
36B39白色 White― ―― ―88HP7黄色 Yellow― ―-14 bp
37B53黄色 Yellow+A― ―89HP8黄色 Yellow― ―-14 bp
38B224黄色 Yellow― ―-14 bp90HP9黄色 Yellow― ―-14 bp
39B98黄色 Yellow+A― ―91HP10黄色 Yellow― ―-14 bp
40B133黄色 Yellow+A― ―92HP11黄色 Yellow― ―-14 bp
41B134黄色 Yellow+A― ―93HP12黄色 Yellow― ―-14 bp
42B196黄色 Yellow+A― ―94H71黄色 Yellow― ―-14 bp
43B198黄色 Yellow+A― ―95H72黄色 Yellow― ―-14 bp
44B220黄色 Yellow+A― ―961520A白色 White― ―― ―
45B241黄色 Yellow+A― ―97Z8白色 White― ―― ―
46H7黄色 Yellow+A― ―98BZ1119褐色 Brown+A― ―
47H16黄色 Yellow+A― ―99BZ2659褐色 Brown+A― ―
48H17黄色 Yellow― ―-14 bp1003A832白色 White― ―― ―
49H19黄色 Yellow― ―-14 bp101雪丽脆 Xuelicui白色 White― ―杂合 Hybrid
50H23黄色 Yellow― ―-14 bp102瑞金 Ruijin白色 White― ―杂合 Hybrid
51H24黄色 Yellow― ―-14 bp103冀州鲜 Jizhouxian白色 White― ―杂合 Hybrid
52H29黄色 Yellow― ―-14 bp104火焰二号F1 F1 of Huoyan 2白色 White― ―杂合 Hybrid

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3 讨论

在拟南芥中,原花青素特异在种皮内皮层和合点等位置积累,并在种子成熟过程中被氧化聚合成褐色色素,致使种皮呈现褐色。这种多聚物的抗氧化特性形成了对胚胎的保护屏障,能够增强种子休眠以及寿命[36]。在种子中,MBW转录复合体可通过调控结构基因的表达来调控原花青素的生物合成,其中以TT8为代表的IIIf亚家族bHLH类转录因子在该复合体中具有重要作用[17,18,19,20,21]。关于甜瓜类黄酮途径的关键调控基因还未见报道,本研究通过遗传定位的方法对甜瓜的种皮颜色基因进行了定位,发现编码bHLH转录因子的CmSC1可能是控制种皮颜色的关键基因。

种皮本身是由母体细胞发育而来的,其表型由母体基因型决定,母体基因型控制的性状要在下一代才能表现出来,表现为典型的延迟遗传,这一现象在本研究中也得到了印证。本研究结果与张可鑫等[27]的研究结果一致,表明白色对黄色受单显性基因CmSC1控制,并将该基因也定位在第5连锁群,与PéRIN等[26]的研究结果不一致,这可能是由于PéRIN等[26]开展的研究较早,与基因组测序后的连锁群划分存在差异。本研究的定位区间内包含一个编码bHLH的转录因子蛋白,为拟南芥AtTT8的同源基因,氨基酸序列相似性为50.7%。通过对白色种皮和黄色种皮亲本材料该基因的编码区测序表明,黄色种皮材料分别在ATG下游47 bp位置处插入一个碱基A和ATG下游260 bp处缺失14 bp,两种突变形式均导致翻译蛋白提前终止,这与水稻的Rc类似,而不一致的地方在于水稻的红色果皮对白色为显性。水稻Rc也编码一个bHLH转录因子,与拟南芥TT8同源[37]。白米中主要存在两类突变位点,一处为ATG下游1 353 bp处碱基C到A的突变,引入终止密码子;一处为ATG下游1 408 bp处14 bp的缺失,两处突变均导致翻译蛋白的提前终止[37],其变异形式与CmSC1相似。此外,SWEENEY等[38]研究表明Rc基因位点受人工驯化的强烈选择,是导致野生稻红色果皮变成栽培稻白色果皮的单一突变位点,其中97.9%的水稻白米品种中该基因存在14 bp片段缺失,其他小于3%的白米品种则为C到A的单碱基突变,而且14 bp缺失这一突变位点起源于粳稻亚种,跨越生殖隔离后导入籼稻亚种。本研究通过开发分子标记及对ATG47测序表明,CmSC1的14 bp缺失主要发生在厚皮甜瓜中,薄皮甜瓜则基本为单碱基A的插入,这也可能与该位点的驯化有关。此外,对拟南芥AtTT8[36]和水稻Rc[39]研究表明,种皮颜色与种子的休眠性有关,在甜瓜中该基因是否与休眠相关有待进一步研究。

HAGIWARA和KAMIMURA[25]研究认为白色种皮对褐色也为显性,由基因Wt控制。MCCREIGHT和BOHN[40]报道了r（red stem）既控制茎秆的颜色也导致褐色种皮的产生。本研究也对两份褐色种皮材料BZ1119和BZ2659的遗传模式进行了研究,表明白色种皮对褐色为显性,F2代分离比为15:1,受两对非等位基因控制,其中一个与CmSC1位点连锁,褐色种皮材料也发生了ATG47位置处的单碱基A的插入;而黄色对褐色也为显性,可能受另外一对等位基因r控制。将来对另一个位点基因的克隆将有助于进一步揭示甜瓜种皮颜色的形成机制。

4 结论

甜瓜白色种皮对黄色种皮受单显性核基因CmSC1控制,利用分子标记将该基因定位在5号染色体分子标记S27和S28之间约95 kb的区间内。定位区间内MELO3C014406编码bHLH类转录因子,与拟南芥的AtTT8同源。通过开发特异分子标记YS以及基因测序发现黄色种皮材料中该基因分别在ATG47位置处发生单碱基A的插入突变或者ATG260位置处发生14 bp缺失突变,两种突变形式均造成编码蛋白提前终止,推测该基因为控制甜瓜种皮颜色基因CmSC1的最终目的基因。

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