吴云雨^,1,2, 肖宁^1,2,4, 余玲^1,2, 蔡跃^1,2, 潘存红^1,3, 李育红^1,2, 张小祥^1,2, 黄年生^1,2, 季红娟^1,2, 戴正元^1,3, 李爱宏^,1,2,31江苏里下河地区农业科学研究所,江苏扬州225007
²扬州大学江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室,江苏扬州225009
³扬州大学江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心,江苏扬州225009
⁴中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193

Construction and Analysis of Broad-Spectrum Resistance Gene Combination Pattern for Japonica Rice in Lower Region of the Yangtze River, China

WU YunYu^,1,2, XIAO Ning^1,2,4, YU Ling^1,2, CAI Yue^1,2, PAN CunHong^1,3, LI YuHong^1,2, ZHANG XiaoXiang^1,2, HUANG NianSheng^1,2, JI HongJuan^1,2, DAI ZhengYuan^1,3, LI AiHong^,1,2,31Lixiahe Institute of Agricultural Sciences of Jiangsu, Yangzhou 225007, Jiangsu
²Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu
³Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu
⁴State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

通讯作者: 李爱宏,E-mail：yzlah@126.com

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2020-07-13接受日期:2020-08-24网络出版日期:2021-05-01

基金资助:

国家自然科学基金.31801342 国家自然科学基金.31971868 江苏省农业科技自主创新基金.CX182022 江苏省重点研发计划.BE2019339 江苏省农业重大新品种创制项目.PZCZ201702 江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室.BM2018003 江苏省自然科学基金.BK20181216 中国农业科学院植物病虫害生物学国家重点实验室开放基金.SKLOF201909

Received:2020-07-13Accepted:2020-08-24Online:2021-05-01
作者简介 About authors
吴云雨,E-mail：wuyunyuyu@163.com。













摘要
【目的】基因聚合是实现水稻稻瘟病广谱抗性的有效途径之一。通过构建粳稻背景下不同双基因聚合系,利用长江下游粳型稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea）菌株评价其抗性效应并解析其抗性效应产生的构成因子,为长江下游粳稻抗稻瘟病育种提供广谱抗性基因组合模式和种质资源。【方法】以粳稻07GY31为背景的Piz基因座不同复等位基因（Pigm、Pi40、Pi9、Pi2、Pizt和Piz）单基因系为核心,利用不完全NCII交配设计,分别与其他广谱抗性基因（Pi1、Pi54和Pi33）单基因系杂交,经分子标记辅助选择和农艺性状筛选,共构建18种不同基因组合的双基因聚合系。2019年利用长江下游粳稻种植区采集、分离的109个稻瘟病代表性菌株进行苗瘟、穗瘟人工接种鉴定及不同病圃的自然诱发鉴定,评价不同双基因聚合系的抗性效应,并分析双基因聚合系抗性效应的构成因子。【结果】Genotyping by sequencing（GBS）分析表明所构建的双基因聚合系均具有较高的背景恢复率,分布于97.08%（PPL^Piz/Pi33）—99.08%（PPL^Pigm/Pi1）。表明除了目标基因区域不同外,所有双基因聚合系的遗传背景几乎完全与受体亲本07GY31一致。同时人工接菌鉴定表明绝大部分双基因聚合系苗瘟和穗瘟抗性水平都优于单基因系。其中苗瘟抗性效应较好的聚合系分别为PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/Pi54、PPL^Pigm/Pi33、PPL^Pi9/Pi33、PPL^Pi9/Pi54、PPL^Pi40/Pi54、PPL^Pi40/Pi33、PPL^Pi40/Pi1、PPL^Pi9/Pi1, 而穗瘟抗性效应较好的聚合系分别为PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/Pi54、PPL^Pigm/Pi33、PPL^Pi40/Pi33、PPL^Pi40/Pi54、PPL^Pi40/Pi1、PPL^Pizt/Pi33。不同抗性基因聚合后产生不同的效应,其中互补效应高且能有效表达是提高双基因聚合系苗瘟和穗瘟抗性的关键因子。双基因聚合系PPL^{Pigm / Pi1}、PPL^{Pigm / Pi54}和PPL^{Pigm / Pi33}在苗瘟和穗瘟的人工接种,以及在不同病圃的自然诱发鉴定中均表现稳定的广谱抗性,同时,农艺性状调查结果也表明这3个双基因聚合系的基本农艺性状与轮回亲本07GY31基本一致,因此,基因组合Pigm/Pi1、Pigm/Pi54和Pigm/Pi33是适于长江下游粳稻的广谱抗性基因组合模式。【结论】抗性基因的组合方式影响聚合系的抗性水平,互补效应高且能有效表达是粳型双基因聚合系抗性效应提高的关键因子。本研究构建的双基因聚合系及其抗性效应分析为长江下游广谱稻瘟病抗性粳稻品种的精准培育提供了种质资源和理论支撑。
关键词： 长江下游;粳稻;稻瘟病菌;稻瘟病;基因聚合;效应分析

Abstract
【Objective】Gene pyramiding is one of the most effective ways to achieve broad-spectrum resistance against Magnaporthe oryzae. The objective of this study is to construct a set of polygene pyramiding lines (PPLs) under the background of japonica rice, to evaluate their resistance performances and analysis the components of their resistance effects using M. oryzae strains collected from lower region of the Yangtze River, China, thus providing broad-spectrum resistance gene combination pattern and germplasm resources for japonica rice resistance breeding in lower region of the Yangtze River, China. 【Method】Monogenic lines with multiple alleles of the Piz locus (Pigm, Pi40, Pi9, Pi2, Pizt and Piz) with the background of japonica rice 07GY31 as the backbone, crossed with other broad-spectrum resistance gene Pi1, Pi54 and Pi33, respectively using the incomplete NCII mating design. A total of 18 different PPLs were constructed using marker-assisted selection (MAS) and agronomic traits screening. Artificial inoculation assays at seedling and heading stage with 109 representative M. oryzae strains collected from lower region of the Yangtze River, combined with natural induction identification under multiple field environments were conducted to evaluate the resistance performances of different PPLs, and to analyze the component factors of the resistance effects of the PPLs. 【Result】Genotyping by sequencing (GBS) analysis shows that the constructed PPLs all have a high background recovery rate, which was ranging from 97.08% (PPL^Piz/Pi33) to 99.08% (PPL^Pigm/Pi1), indicated that the genetic background of all PPLs was almost fully identical to that of the recurrent parent 07GY31. The seedling blast and panicle blast resistance levels of most PPLs were significantly higher than those of monogenic lines under artificial inoculation conditions, the PPLs with better resistance to seedling blast are PPL^Pigm/Pi1, PPL^Pigm/Pi54, PPL^Pigm/Pi33, PPL^Pi9/Pi33, PPL^Pi9/Pi54, PPL^Pi40/Pi54, PPL^Pi40/Pi33, PPL^Pi40/Pi1 and PPL^Pi9/Pi1, respectively, and the PPLs with outstanding performance in panicle blast are PPL^Pigm/Pi1, PPL^Pigm/Pi54, PPL^Pigm/Pi33, PPL^Pi40/Pi33, PL^Pi40/Pi54, PPL^Pi40/Pi1 and PPL^Pizt/Pi33, respectively. Different resistance gene combinations produced different effects after pyramiding. High complementary effect and which could be fully expressed is the key factor for the improvement of the resistance level of seedling blast and panicle blast of the PPLs. In addition, PPL^Pigm/Pi1, PPL^Pigm/Pi54 and PPL^Pigm/Pi33 displayed broad-spectrum resistance in artificial inoculation at seedling and heading stage, and showed stable broad-spectrum resistance under different disease nurseries. Besides, agronomic traits evaluation also showed PPLs with these three gene combinations were at par to the recurrent parent. Therefore, Pigm/Pi1, Pigm/Pi54 and Pigm/Pi33 are broad-spectrum resistance gene combination patterns suitable for japonica rice resistance breeding in lower region of the Yangtze River, China. 【Conclusion】The combination pattern of resistance genes affects the resistance level of the PPLs, and high complementary effect and which could be fully expressed is the key factor for the improvement of the resistance level of the PPLs in japonica background. In addition, the development of PPLs and component factors analysis in this study provides valuable theoretical support and innovative germplasm resources for the precise breeding broad-spectrum japonica varieties in lower region of the Yangtze River, China.
Keywords：lower region of the Yangtze River; japonica rice;Magnaporthe oryzae;rice blast;gene pyramiding;effect analysis


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吴云雨, 肖宁, 余玲, 蔡跃, 潘存红, 李育红, 张小祥, 黄年生, 季红娟, 戴正元, 李爱宏. 长江下游粳稻稻瘟病广谱抗性基因组合模式分析[J]. 中国农业科学, 2021, 54(9): 1881-1893 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.006
WU YunYu, XIAO Ning, YU Ling, CAI Yue, PAN CunHong, LI YuHong, ZHANG XiaoXiang, HUANG NianSheng, JI HongJuan, DAI ZhengYuan, LI AiHong. Construction and Analysis of Broad-Spectrum Resistance Gene Combination Pattern for Japonica Rice in Lower Region of the Yangtze River, China[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(9): 1881-1893 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.006


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0 引言

【研究意义】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea）引起的稻瘟病是威胁世界水稻安全生产的主要真菌类病害之一^[1],控制该病害最为经济有效、绿色安全的策略是利用抗病基因培育抗病品种^[2],但目前已鉴定的绝大多数稻瘟病抗性基因为垂直抗性基因,其中部分抗性基因存在不能兼顾苗瘟和穗瘟抗性、抗谱窄等缺点,同时由于稻瘟病菌的致病性分化快、生理小种多、变异频繁,导致抗病品种应用3—5年后便“丧失”抗性变为感病品种。抗性基因聚合被证明是培育广谱抗病品种的主要途径之一^[3,4],然而,不同的抗性基因聚合后会产生不同的抗性效应。因此,合理利用不同抗性基因进行聚合并评价其抗性效应,进而发掘有效的广谱抗性基因组合模式对培育广谱抗病品种、保障水稻安全生产具有重要现实意义和实践应用价值。【前人研究进展】宿主对病原菌的抗性反应可分为完全抗性和部分抗性两种类型,完全抗性通常由单个主效抗病基因控制,而部分抗性通常由多个微效抗性基因控制^[5,6]。水稻稻瘟病主效抗病基因大多为来自STAND（signal transduction ATPases with numerous domains）亚家族中的NBS-LRR蛋白家族成员^[7],NBS-LRR蛋白以直接或间接方式识别病原菌无毒蛋白后激活下游基因表达从而激发水稻抗病免疫反应^[8,9,10,11]。目前,已鉴定的稻瘟病主效抗性基因超过100个,部分抗性基因约347个^[12,13]。其中有28个主效抗性基因（Pit、Pish、Pi37、Pi64、Pib、Pid2、Pid3、Pi25、Pi2、Pi9、Pizt、Pi50、Pigm、Pizh、Pi36、Pi5/Pii、Pia/Pi-CO39、Pi1、Pi54/Pi54rh、Pikm、Pikp、Pik、Pike、Pita和Ptr）^[14,15,16]及5个部分抗性基因（pi21、Pi35、Pi63、Pb1和Pid3-I1）^{[17,18,19,20,21]}被成功克隆,为稻瘟病抗性育种提供了有效基因资源,但由于稻瘟病菌群体的高度变异及新的毒性种群的出现,许多携带单一抗病基因（Pi9、Pita、Pi54和Pib）的抗性品种在大规模种植一段时间后失去了抗性效应变为感病品种^[22,23,24]。为降低抗性丧失风险,利用不同抗病基因进行基因聚合是培育广谱、持久抗病品种的一个有效途径。JIANG等^[25]和XIAO等^[26]分别报道聚合Pi1/Pi2/D12和Pi46/Pi2的改良系对中国南方稻区稻瘟病菌菌株具有广谱抗性,而聚合Pi2/Pi54则对印度稻瘟病菌群体表现出广谱抗性^[4]。但抗病基因聚合后并不简单表现出抗性效应累加,有的还存在正向甚至负向互作。国际水稻研究所以Co39为背景构建携带不同抗性基因的聚合系,鉴定结果显示Piz⁵/Pita的基因聚合系抗性不如单基因抗性品系^[27]。同样,XIAO等^[28]研究发现在粳稻07GY31背景下Pi9/Pi54双基因聚合系穗瘟抗性显著低于Pi9单基因系;WU等^[29]以籼稻扬稻6号为背景,构建了15种不同的抗性基因聚合系,发现Pigm/Pi1、Pigm/Pi54 和Pigm/Pi33为籼稻背景下的广谱抗性基因组合模式,同时也发现部分基因组合产生了负向互作效应。此外,由于稻瘟病菌生理小种依赖于水稻宿主生存,生理小种基因型分布与水稻宿主种植区域有关,来自籼稻、粳稻种植区域的生理小种被明显分为“籼稻群”和“粳稻群”^[30,31]。因此,在不同种植区需选择与当地稻瘟病菌菌群非亲和性的抗性基因进行基因聚合,确保基因聚合后可有效提高其抗性水平。【本研究切入点】长江下游地区为我国主要粳稻种植区之一,约占全国粳稻总种植面积的40%^[32,33],该地区粳稻主要含有Pish、Pita、Pib、Pikm和Pi54等抗性基因^[34,35]。近年来,随着耕作制度和气候条件的变化,稻瘟病在长江下游粳稻种植区常态化发生。如2014年江苏水稻稻瘟病发生面积98万公顷,2016年上升至128.7万公顷,且发病面积呈逐年增加趋势,水稻生产存在严重安全隐患。表明长江下游应用品种现有携带的抗性基因已远不能控制稻瘟病的发生,亟需导入新的抗性基因/基因组合。【拟解决的关键问题】以粳稻07GY31为背景的Piz基因座不同复等位基因（Pigm、Pi40、Pi9、Pi2、Pizt和Piz）单基因系为核心,采用不完全NCII交配设计,分别与其他广谱抗性基因（Pi1、Pi54和Pi33）单基因系杂交,经过分子标记辅助选择和农艺性状筛选,构建18种不同基因组合的双基因聚合系。从长江下游不同粳稻种植区采集稻瘟病菌菌株进行苗瘟和穗瘟的人工接种鉴定,以及开展病圃的自然诱发鉴定,评价不同双基因聚合系的抗性效应,并分析双基因聚合系抗性效应的构成因子,从而明确适宜长江下游粳稻的稻瘟病广谱抗性基因组合模式,以期为该地区粳稻抗稻瘟病育种提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料及菌株

轮回亲本07GY31由江苏省农业科学院粮食作物研究所育成,该品系农艺性状优良,但高感稻瘟病。NIL^Pigm、NIL^Pi40、NIL^Pi2、NIL^Pi9、NIL^Pizt、NIL^Piz、NIL^Pi1、NIL^Pi54和NIL^Pi33 9个广谱抗性基因近等基因系均以07GY31为轮回亲本构建而成^[36]。

2013—2019年分别从江苏、安徽、浙江、江西、湖北等长江下游粳稻种植区采集并分离109个稻瘟病菌菌株应用于本研究。稻瘟病菌的单孢分离、菌株培养及菌液制备按照PURI等^[37]报道的方法进行。

1.2 分子标记检测

1.2.1 基于分子标记的前景选择 在双基因聚合系构建过程中,采用简易TPS快速提取法提取水稻基因组DNA^[38]。利用表1所示引物进行基因扩增,以便对各目标基因进行前景选择。20 μL PCR反应体系含MgCl₂（25 mmol·L^-1）2.0 μL,10×PCR buffer 2.0 μL,引物（上下游引物,10 μmol·L^-1）1.5 μL,dNTP（10 mmol·L^-1）0.4 μL,Taq DNA聚合酶（5 U·μL^-1）0.2 μL,模板DNA 2.0 μL;ddH₂O 11.9 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s;55—58℃（视不同引物而定）退火45 s;72℃延伸1 min,进行35个循环,最后72℃充分延伸10 min。根据扩增产物的大小,分别采用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶及4%琼脂糖凝胶电泳对目标扩增产物进行电泳分离。

Table 1
表1
表1用于检测目的基因的分子标记详细信息
Table 1Detail information of molecular markers tightly linked to different resistant genes

基因 Gene	标记 Marker	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	退火温度 Annealing temperature (℃)	预期片段大小 Expected size (bp)
Pi2	Pi2-InDel	F: GCAGCGGCTAGGGTTTATC	60	110
		R: CACCCAGCAACTGATTTGTCA
Pi9	M-Pi9	F: GCTGTGCTCCAAATGAGGAT	55	291
		R: GCGATCTCACATCCTTTGCT
Pi40	AP5659-5	F: CTCCTTCAGCTGCTCCTC	55	288
		R: TGATGACTTCCAAACGGTAG
Pigm	Z4794	F: TGAATGTGAGAGGTTGACTGTGG	55	334
		R: CACGCCACCCTTCAATGGAGACT
Pizt	AP22	F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA	58	143
		R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC
Piz	S29742	F: CAGTGAAACGAACGCTATG	55	454
		R: AATAGGAAGGGTTGATGTTG
Pi1	RM224	F: ATCGATCGATCTTCACGAGG	55	163
		R: TGCTATAAAAGGCATTCGGG
Pi54	Pi54-1	F: ATCGATCGATCTTCACGAGG	55	216
		R: GCTTCAATCACTGCTAGACC
Pi33	RM72	F: CCGGCGATAAAACAATGAG	55	240
		R: GCATCGGTCCTAACTAAGGG

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1.2.2 基于genotyping by sequencing（GBS）的背景分析 利用DNAsecure Plant Kit试剂盒（Qiagen,USA）提取所有试验材料的基因组DNA。利用BioPhotometer plus核酸测定仪（Eppendorf,Germany）检测核酸浓度及质量。高质量的DNA用于GBS文库构建和测序,首先应用限制性内切酶BamH I和Msp I对基因组DNA进行酶切,酶切后的片段参考POLAND等^[39]方法进行建库并用第二代测序仪Illumina HiSeq 2000 Sequencer（Illumina,USA）进行双末端（pair end）测序。测序深度为~10×coverage,去除原始测序序列中的接头序列和低质量的短读序列,剩下的高质量序列采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序将其匹配到日本晴参考基因组上^[40]。利用GATK（V4.1）软件^[41]提取SNP,每个聚合系以轮回亲本对照,利用Tassel（V5.0）去除聚合系与轮回亲本间相同的SNP,不同SNP在染色体上的密度做图参照R语言包（Cmplot V3.6.0）,随机选择3万个SNP标记用于背景恢复率的计算,背景恢复率=（相同标记数/总标记数）×100%。

1.3 抗性鉴定

1.3.1 人工接种鉴定 2019年5月在江苏里下河地区农业科学研究所万福基地采用109个稻瘟病菌菌株对9个单基因系、18个双基因聚合系进行苗瘟抗性鉴定。供试水稻材料播种于塑料盆中,加入营养土于人工气候室中育苗（27—30℃,正常光照）。所有供试水稻材料都随机设置3个重复,并以轮回亲本07GY31及普感品种LTH作为阴性对照。待秧苗长至3—4叶期时移至玻璃接种箱内。将孢子悬浮液配制成浓度为5×10⁴个/mL,并加入0.02% Tween-20作为表面活性剂。用连接空气压缩机的喷枪在接种箱内喷雾接种,每个秧盘内接种40—50 mL的孢子悬浮液。26℃黑暗保湿24 h,然后转移至可控温室内,在温度为26—28℃、相对湿度>95%的温湿环境下生长。7—10 d后调查、记载各家系植株叶片上的病斑数目及反应类型,病情调查按MACKILL等^[42]分级标准进行。2019年正季在自然条件下,采用人工注射接种法对以上材料进行穗瘟抗性鉴定。参考WU等^[43]的选择标准,从109个稻瘟病菌菌株中挑选出28个代表性菌株用于穗瘟接种鉴定。每个试验材料种植成120株的小区,每区10行,每行12株,株行距13.3 cm×25 cm,采用完全随机区组设计（RCBD）,每个试验材料重复种植两次,常规水肥管理。8月初选择孕穗期剑叶叶枕与倒二叶距离为3—4 cm左右的穗苞进行接种,每个菌株接种每个株系10穗,每穗注射1 mL,孢子接种浓度为5×10⁴个/mL,并对接种后的稻穗作好标记。接种21 d后调查发病情况,穗瘟鉴定评价参照WU等^[36]标准。抗性频率（resistance frequency,RF）=（接种后表现抗的菌株数/接种总菌株数）×100%。

1.3.2 病圃的多点自然诱发鉴定 2019年正季将以上单基因系及双基因聚合系分别种植于江苏金坛、安徽庐江和浙江长兴的常年稻瘟病重发区。每个试验材料栽10行,每行10株,株行距13.3 cm×25 cm,采用完全随机区组设计（RCBD）,每个试验材料重复种植3次。为了使每个鉴定材料都能与诱发品种接触,每隔两个鉴定小区的材料播一行感病诱发品种。病圃水层保持10 cm,进行田间自然诱发。试验田不使用任何杀菌剂,其他按常规肥水管理。齐穗30 d后调查每个鉴定材料的穗发病情况。调查、评价方法参照WU等^[29],健康稻穗率（health panicle proportion,HPP）=（小区未感染稻瘟病穗数/小区总穗数）×100%。

1.4 基本农艺性状调查

除用于接种鉴定外,各株系材料同时种植一份用于农艺性状调查。5月18日播种,6月13日进行移栽,单本栽插,每区10行,每行12株,株行距13.3 cm×25 cm,常规水肥管理。适期取每株系中间第2—9行之间的5株材料进行抽穗期、株高、单株有效穗数、每穗总粒数、结实率、千粒重、单株产量等基本农艺性状的调查。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2016进行数据整理和表格绘制,多重比较采用IBM SPSS Statistics 22进行数据分析,双基因聚合系抗性效应的构成因子分析的桑基图及双基因聚合系在不同病圃抗性表现的三维散点图均使用Python语言包（v 3.7.7）进行作图。

2 结果

2.1 构建的双基因聚合系具有较高的背景恢复率

双基因聚合系构建方法参考WU等^[29]的方法,采用不完全双列杂交法（NCII）配制18个杂交F₁组合,针对每个组合,开展目标基因的特异性标记检测,筛选目标双基因均为杂合带型的F₁单株进行自交,获得1 000个左右F₂单株的群体。结合标记辅助选择和农艺性状筛选,在不同F₂群体中分别筛选出4—22个目标双基因纯合且基本农艺性状类似轮回亲本07GY31的双基因聚合单株,将这些单株加代到F₃种植成株系。进一步选择2—4个农艺性状与07GY31基本一致的F₃株系,通过GBS分析进行背景回复率检测。选择背景恢复率最高的一个株系用于后续的抗性鉴定评价。GBS分析结果表明不同双基因聚合系均具有较高的背景恢复率,普遍在97.00%以上,分布于97.08%（PPL^Piz/Pi33）—99.08%（PPL^Pigm/Pi1）（图1）。表明除了目标基因区域不同外,所有双基因聚合系的遗传背景几乎完全与受体亲本07GY31一致。

图1

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图118个基于SNP分型的双基因聚合系基因型图

圆圈代表R基因所在的基因座位置
Fig. 1Graphical SNP maps of the 18 PPLs

The circle represents the locus of the R gene

2.2 双基因聚合系抗性水平普遍优于单基因系

利用采集到的稻瘟病菌菌株对9个单基因系、18个双基因聚合系及轮回亲本分别在苗期及抽穗期进行人工接种鉴定,结果表明不同抗性基因聚合后,其苗瘟及穗瘟的抗性水平显著高于单基因系（图2-A、2-B）。就苗瘟抗性而言,不同基因聚合后产生了不同的聚合效应,导致不同聚合系之间的抗性水平存在显著差异（图2-C）。根据抗性水平的不同,可将不同聚合系划分为两个抗性等级,第一级为PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/Pi54、PPL^Pigm/Pi33、PPL^Pi9/Pi33、PPL^Pi9/Pi54、PPL^Pi40/Pi54、PPL^Pi40/Pi33、PPL^Pi40/Pi1、PPL^Pi9/Pi1 9个双基因聚合系,抗性频率在88.99%—99.08%;第二级则为以PPL^Pi2/Pi1为代表的另外9个双基因聚合系,抗性频率分布在28.44%—73.39%。针对高抗性水平基因Pigm而言,尽管NIL^Pigm的抗性频率高达94.50%,但是与Pi1和Pi54聚合后其抗性频率均提高了4.58%。对于低抗性水平基因Piz而言,其单基因系的抗性频率为27.52%,与Pi1、Pi54和Pi33聚合后其抗性频率则分别提高了20.19%、13.76%和0.92%。

图2

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图2双基因聚合系、单基因系和轮回亲本人工接种下的苗瘟及穗瘟抗性表现

A、B：双基因聚合系、单基因系和轮回亲本间苗瘟和穗瘟的综合比较分析;C、D：双基因聚合系、单基因系和轮回亲本的苗瘟、穗瘟抗性表现
Fig. 2Resistance performances of PPLs, NILs and the recurrent parent for seedling and panicle blast resistance under artificial inoculation

A、B: Comprehensive comparative analysis on seedling blast and panicle blast RF of PPLs, NILs and the recurrent parent; C、D: Resistance performances of PPLs, NILs and the recurrent parent for seedling blast and panicle blast resistance


针对穗瘟而言,不同基因聚合后同样产生不同聚合效应,导致不同聚合系间抗性水平存在显著差异（图2-D）。总体而言,穗瘟的抗性频率普遍要低于苗瘟。根据抗性水平的不同,同样将聚合系抗性水平划分为两个等级,第一级为PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/Pi54、PPL^Pigm/Pi33、PPL^Pi40/Pi33、PPL^Pi40/Pi54、PPL^Pi40/Pi1、PPL^Pizt/Pi33 7个双基因聚合系,抗性频率在64.29%—85.71%。第二级则为以PPL^Pi2/Pi54为代表的11个双基因聚合系,抗性频率分布在21.43%—50.00%。尽管NIL^Pigm的穗瘟抗性频率为82.14%,但是与Pi1和Pi54聚合后其抗性频率均提高了3.57%。值得注意的是,Pizt单基因系抗性频率仅为35.71%,与Pi33（RF=28.57%）聚合后,其双基因聚合系PPL^Pizt/Pi33的抗性频率达到64.29%;而与Pi1（RF=39.29%）和Pi54（RF=35.71%）聚合后,其双基因聚合系PPL^Pizt/Pi1和PPL^Pizt/Pi54的抗性频率同样达到46.43%,相对NIL^Pizt的抗性水平得到显著提高。由此可见,对于部分抗性效应不好的单基因,选择合适的基因组合方式,可达到显著提高抗性水平的目的。

2.3 互补效应为提升双基因聚合系抗性水平的关键因子

为进一步分析聚合系抗性提高的原因,将聚合系对稻瘟病菌菌株的抗性效应归为重叠效应、互补效应和互作效应3种类型。分析各效应与苗瘟及穗瘟的抗性关系,发现重叠效应和互补效应与聚合系的抗性显著相关,其中互补效应及其能否有效表达是影响聚合系抗性水平的关键因子。在苗瘟抗性中,具有较高抗性频率的第一级的9个聚合系均有较高的互补效应,其平均互补效应为50.87%,并且46.48%的互补效应能有效表达（即聚合的两个目的基因一方为抗病表型,可以互补另一方的感病表型,导致聚合系为抗病表型）,提高了聚合系的抗性效应,只有4.39%的互补效应不能有效表达（即聚合的两个目的基因一方为抗病表型不能互补另一方的感病表型,导致聚合系为感病表型）,降低了聚合系的抗性效应。而在以PPL^Pi2/Pi1为代表的抗性频率较低的第二级的另外9个聚合系中,其平均互补效应为43.94%,且只有27.32%的互补效应得到有效表达,提高了聚合系的抗性效应,而有16.62%的互补效应不能有效表达,导致聚合系出现感病表型（图3-A）。同样地,在穗瘟抗性反应中,具有较高抗性频率的第一级的7个聚合系均有较高的互补效应,其平均互补效应为50.00%,且有39.80%互补效应提高了聚合系的抗性效应,如穗瘟抗性表现最好的PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/Pi54和 PPL^Pigm/Pi33的互补效应分别为46.43%、57.14%和60.71%。而以PPL^Pi2/Pi54为代表的抗性频率较低的第二级的另外11个聚合系中,其平均互补效应为43.08%,且仅有22.64%的互补效应得以有效表达,提高了聚合系的抗性水平,而有20.44%的互补效应不能表达,从而降低了聚合系的抗性效应。抗性效应最低的PPL^Piz/Pi1和PPL^Piz/Pi33其互补效应均仅为32.14%,且均只有14.28%的互补效应提高了聚合系的抗性效应（图3-B）。此外,所有基因组合中都存在一定的正向互作效应（即聚合的两个目的基因双方都为感病表型,聚合后表现为抗病表型）,导致基因聚合后抗性效应得到进一步的提高,如Pizt单基因系穗瘟抗性频率仅为35.71%,与Pi33聚合后,分别产生了10.72%的重叠效应,25.00%的互补效应及28.57%的互作效应,导致其双基因聚合系PPL^Pizt/Pi33的穗瘟抗性频率达到了64.29%。因此,抗病基因的组合方式直接决定了聚合系的抗性水平,选择互补效应高且能有效表达的抗病基因组合模式对培育广谱抗性品种具有重要作用。

图3

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图3双基因聚合系抗性效应分析桑基图

A：双基因聚合系苗瘟抗性效应分析桑基图Analysis of resistance effect of PPLs against seedling blast with sankey diagram;B：双基因聚合系穗瘟抗性效应分析桑基图Analysis of resistance effect of PPLs against panicle blast with sankey diagram。OE：重叠效应Overlapping effect;CE：互补效应Complementary effect;IE：互作效应Interaction effect
Fig. 3Analysis of resistance effect of PPLs with sankey diagram

2.4 含有Pigm的基因组合在不同病圃间抗性表现最为稳定

为进一步明确不同聚合系在自然种植、病原菌强胁迫条件下的发病情况,各聚合材料及轮回亲本07GY31分别种植于江苏金坛、安徽庐江和浙江长兴3个稻瘟病重发区,进行田间自然诱发鉴定。结果显示,轮回亲本07GY31在这3个地区均属于高感类型（表2）,表明当地稻瘟病发病严重,是理想的稻瘟病自然诱发鉴定病圃。同时对比人工接种鉴定结果与自然鉴定结果,发现人工鉴定的各个材料的穗瘟抗性表现与在金坛、庐江和长兴的自然鉴定抗性表现基本一致,其决定系数（R²）分别为0.7828、0.6788和0.8236（图4-A）。此外,PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/P54和PPL^Pigm/Pi33 3个双基因聚合系在不同鉴定点抗性效应最好也最为稳定,小区健康稻穗率均在94.00%以上,与人工鉴定结果基本一致（图4-B、表2）。其他双基因聚合系的田间穗瘟抗性水平存在显著差异,且在不同鉴定点间抗性水平表现明显的特异性。如PPL^Pizt/P33在庐江的小区健康稻穗率为91.00%,表现为3级抗性水平;而在金坛和长兴的小区健康稻穗率分别为77.00%和69.00%,表现为7级感病水平（图4-B、表2）。表明Pizt/Pi33基因组合的抗性表现存在地区特异性,对金坛和长兴的稻瘟病菌群体表现一定程度的特异亲和性。

Table 2
表2
表218个双基因聚合系及轮回亲本07GY31的基本农艺性状表现
Table 2Agronomic performance of 18 PPLs and recurrent parent 07GY31

品系 Line	抽穗期 Heading date (d)	株高 Plant height (cm)	单株有效穗数 Number of panicles per plant	每穗总粒数 Number of grains per panicle	结实率 Seed fertility (%)	千粒重 1000-grain weight (g)	单株产量 Grain yield per plant
PPLPigm/Pi1	97.2±1.26a	100.55±3.05a	11.38±1.32a	126.32±4.58a	92.02±0.35a	26.32±1.42a	34.81±2.02a
PPLPigm/Pi54	96.5±0.24a	99.82±2.58a	11.22±1.04a	126.25±6.72a	92.52±0.82a	26.04±1.08a	34.12±1.56a
PPLPigm/Pi33	97.0±2.13a	99.65±2.85a	10.78±0.95a	127.95±5.56a	91.89±0.64a	26.54±0.84a	33.63±1.88a
PPLPi40/Pi1	95.5±2.28a	98.75±0.85a	10.95±1.58a	125.85±7.22a	93.25±1.08a	27.06±1.32a	34.77±3.14a
PPLPi40/Pi54	94.7±1.89a	98.28±1.42a	11.32±0.68a	127.46±8.18a	94.28±0.92a	26.38±1.62a	35.89±2.28a
PPLPi40/Pi33	95.2±1.56a	99.12±1.78a	10.56±1.84a	126.28±5.42a	93.75±0.48a	27.59±0.82a	34.49±1.92a
PPLPi9/Pi1	91.8±2.32b	98.30±1.65a	11.24±1.08a	120.24±3.92b	88.32±0.74b	25.88±0.82a	30.89±0.89ab
PPLPi9/Pi54	90.4±1.74b	99.18±1.58a	10.68±0.82a	118.65±7.25b	87.45±0.98b	26.12±1.28a	28.94±1.02b
PPLPi9/Pi33	91.5±1.82b	98.86±0.92a	11.36±1.38a	119.84±6.26b	88.26±1.05b	26.16±0.85a	31.43±1.65ab
PPLPi2/Pi1	98.4±2.16a	102.45±2.37ab	11.69±1.32a	125.38±4.38a	92.45±0.85a	26.64±1.64a	36.10±1.32a
PPLPi2/Pi54	97.5±1.84a	101.84±2.72a	11.88±1.15a	126.56±9.82a	93.28±0.62a	25.98±1.25a	36.43±1.74a
PPLPi2/Pi33	97.2±1.45a	103.22±1.84b	11.21±0.75a	125.58±10.52a	93.75±1.12a	26.49±0.92a	34.96±2.84a
PPLPizt/Pi1	100.5±2.23c	99.48±2.24a	10.95±1.21a	128.25±6.69a	93.55±1.43a	27.18±1.36a	35.71±2.25a
PPLPizt/Pi54	101.8±0.95c	98.95±3.21a	11.22±1.43a	127.84±8.82a	92.45±0.98a	26.52±1.52a	35.16±1.95a
PPLPizt/Pi33	99.6±1.48a	100.24±2.88a	11.47±1.28a	126.57±4.78a	93.12±1.28a	26.35±0.79a	35.62±1.35a
PPLPiz/Pi1	97.5±2.32a	97.32±1.69a	10.98±0.92a	128.48±5.92a	92.88±0.85a	26.38±0.88a	34.56±0.85a
PPLPiz/Pi54	96.5±2.65a	98.48±1.86a	11.22±0.78a	126.32±6.74a	92.05±0.58a	25.94±1.35a	33.84±1.63a
PPLPiz/Pi33	97.2±2.18a	97.85±0.82a	10.92±1.26a	127.62±7.28a	92.69±0.82a	26.36±1.02a	34.05±1.28a
07GY31	96.8±1.24a	98.55±2.52a	11.24±1.34a	126.57±6.28a	92.36±0.74a	26.28±1.28a	34.53±1.56a

同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
Different lowercase letters after the data in the same column indicate significant difference (P<0.05)

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图4

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图4双基因聚合系在3个病圃的抗性表现

A：3个病圃的不同双基因聚合系的小区健康穗率与人工接种下穗瘟抗性频率之间的关系Relationship between HPP of PPLs at three disease nurseries and the RF of PPLs in artificial inoculation evaluation;B：双基因聚合系在不同病圃的穗瘟抗性表现Resistance performance of PPLs against panicle blast among different disease nurseries。JT：金坛Jintan;LJ：庐江Lujiang;CX：长兴Changxing
Fig. 4Resistance performances of PPLs in the three blast nurseries

2.5 双基因聚合系的基本农艺性状表现

考察了双基因聚合系和轮回亲本07GY31的基本农艺性状（表2）。结果表明,大多数双基因聚合系的农艺表现,如株高、抽穗期以及单株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重及单株产量等均与轮回亲本07GY31无明显差异,而携带有Pi9的双基因聚合系与轮回亲本相比则表现为生育期提前,从产量构成性状看,尽管其千粒重与轮回亲本无差异,但每穗总粒数和结实率显著降低,最终导致单株产量显著降低。

3 讨论

3.1 含有Pigm的基因组合为有效的抗性基因组合模式

稻瘟病菌生理小种的组成及频率在不同地区、不同年份间存在很大的差异和变化。研究结果表明,我国稻瘟病菌生理小种的地理分布存在明显的地域差异,且籼、粳稻上病菌的致病性也有明显分化,籼型小种主要分布于南方籼稻区,而粳型小种则以北方粳稻区和长江下游籼、粳稻混栽区居多^[30,44]。在大田种植过程中水稻与稻瘟病菌之间会发生协同进化,因此评价一个抗性基因的效应不能仅用少数几个菌株进行鉴定;同样在抗性品种推广应用之前,也需用采用当地生态区有代表性的菌株加以鉴定。在本研究中,利用长江下游109个粳型代表性菌株对构建的18个基因组合进行抗性评价,并分别在江苏金坛、安徽庐江和浙江长兴进行自然诱发鉴定,结果发现双基因聚合系PPL^Pigm/Pi1、PPL^Pigm/P54、PPL^Pigm/Pi33在苗瘟和穗瘟人工接种中表现出广谱抗性,其苗、穗瘟抗性频率分别在85.71%、85.71%和82.14%以上,并在不同病圃也表现出稳定的广谱抗性,小区健康稻穗率分布在94.00%—100.00%。前期笔者采集了158个来自南方稻区的籼型菌株对籼稻背景的不同基因组合进行抗性鉴定,Pigm/Pi1、Pigm/Pi54和Pigm/Pi33 3个基因组合同样表现出广谱抗性,其苗瘟和穗瘟抗性频率分别在92.41%和86.67%以上,并且在3个南方籼稻病圃里面表现出稳定而广谱的抗性水平^[29]。这些结果表明基因组合Pigm/Pi1、Pigm/Pi54和Pigm/Pi33不仅对长江下游粳型稻瘟病菌菌群表现出广谱抗性,同样对南方籼型菌群表现广谱抗性,是具有重要应用价值的广谱稻瘟病抗性基因组合模式。

3.2 不同基因组合方式影响聚合系的抗性效应

在优良受体亲本中聚合非等位抗性基因可有效提高目标材料对稻瘟病广谱抗性,但是对所要聚合的目标基因的选择尤为重要。因为两个非等位抗性基因聚合后,并不简单地表现为单个抗病基因的抗谱之间的简单累加,而是抗性基因之间表现为极显著的基因相互作用,产生多种聚合效应^[45,46,47],在本研究中将其归类为重叠效应、互补效应和互作效应。基因聚合效应的构成因子极为复杂,不同基因组合方式会产生不同的聚合效应;同一个基因与不同基因聚合也会产生不同的聚合效应。以含有Pizt的双基因聚合系穗瘟抗性效应为例,Pizt单基因系穗瘟抗性效应仅为35.71%,与Pi1（RF=39.29%）聚合后分别产生了14.29%的重叠效应、28.57%的互补效应和3.57%的互作效应,导致双基因聚合系PPL^Pizt/Pi1的抗性效应为46.43%;与Pi54（RF=35.71%）聚合后分别产生了10.71%的重叠效应、21.43%的互补效应和14.29%的互作效应,导致双基因聚合系PPL^Pizt/Pi54的抗性效应为46.43%;而与Pi33（RF=28.57%）聚合后则分别产生了7.14%的重叠效应、28.57%的互补效应和28.57%的互作效应,导致双基因聚合系PPL^Pizt/Pi1的抗性效应为64.28%（图2-D）。两个非等位基因聚合后相互作用的分子机制十分复杂,目前还不清楚,然而聚合能够识别不同菌株的抗性基因仍是提高目标材料广谱抗性的有效途径之一,但是在聚合过程中必须对单个目标基因的抗性水平及聚合后的抗性效应进行比较分析,选择互补效应高且能产生较强互作效应的抗病基因组合模式,才能有效提高目标材料的广谱抗性。

3.3 不同受体遗传背景影响基因组合的抗性效应

受体的遗传背景影响抗性基因/组合的抗性效应^[48]。研究表明Pid3-I1在3种不同遗传背景下对来自日本的稻瘟病菌菌株表现为部分抗性,而在TP309遗传背景下则对来自中国的稻瘟病菌菌株表现完全抗性^[22,49]。抗性基因Pi54和Pita在籼、粳基因组中均有分布,但Pi54 仅在籼稻背景下有较好的抗性效应,而 Pita仅在粳稻背景下检测到对抗性表型有较大的贡献^[34]。同样在水稻白叶枯病抗性中也发现受体品种的遗传背景可能会影响抗性基因的抗性表型,如基因组合Xa5/Xa13/Xa21在5个不同水稻受体品种中的抗性表现差异显著,表明在某些水稻品种背景中可能存在抗性基因组合的抑制因子^[50]。在本研究中,笔者发现基因组合Pi2/Pi1在粳稻07GY31背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率分别为69.72%和46.43%,而在籼稻扬稻6号背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率则分别达到了95.57%和83.33%^[29];同样地,基因组合Pi2/Pi33在粳稻07GY31背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率分别为37.61%和32.14%,而在籼稻扬稻6号背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率则分别达到了91.14%和70.00% ^[29];有趣的是基因组合Pi40/Pi54在粳稻背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率分别为91.74%和75.00%,高于籼稻扬稻6号背景下的苗瘟及穗瘟抗性频率（86.71%和66.67%）^[29]。这些结果表明不同遗传背景中可能存在不同的抗性基因组合促进/抑制因子,这就暗示在不同生态区,不同遗传背景下选择合适的抗性基因组合,做到抗性基因组合的合理布局,才能有针对性地培育广谱持久抗性品种。

4 结论

抗性基因的组合方式直接影响了聚合系的抗性水平,而互补效应高且能有效表达是粳型双基因聚合系抗性效应提高的关键因子。双基因聚合系PPL^{Pigm / Pi1}、PPL^{Pigm / Pi54}和PPL^{Pigm / Pi33}在苗瘟和穗瘟人工接种及病圃自然诱发鉴定中均表现出稳定的抗性,为长江下游粳稻的广谱抗性基因组合模式。研究结果可为长江下游广谱稻瘟病抗性粳稻品种选育提供种质资源和理论支撑。

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