毕崇亮¹, 刘俊俊², 王亨^2,3, 王娟¹, 韩照清¹, 关立增^,11 临沂大学农林科学学院,山东临沂 276005
2 扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009
3 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协调创新中心, 江苏扬州 225009

Effects of Selenium on the Key Factors in Nod2/MAPK/mTORs Signaling Pathways in the bMECs Infected S. aureus

BI ChongLiang¹, LIU JunJun², WANG Heng^2,3, WANG Juan¹, HAN ZhaoQing¹, GUAN LiZeng^,1 1 College of Agriculture and Forestry Science, Linyi University, Linyi 276005, Shandong
2 College of Medicine and Veterinary, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu
3 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009 Jiangsu

通讯作者: 关立增,Tel：15216519159;E-mail：guanlizeng@163.com

收稿日期:2018-12-6接受日期:2019-03-26网络出版日期:2019-08-16

基金资助:

国家自然科学基金青年基金.31802254 山东省高等学校科技计划项目.J18KB074

Received:2018-12-6Accepted:2019-03-26Online:2019-08-16
作者简介 About authors
毕崇亮,Tel：15589035156;E-mail：lydxbcl@163.com。








摘要
【目的】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10 ⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8 μmol·L ^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。 【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.01）。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L ^-1 的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05）; S . aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）; S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L ^-1 和8 μmol·L ^-1 硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。 【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。
关键词： 硒;金黄色葡萄球菌;Nod2/MAPK/mTORs;奶牛乳腺上皮细胞

Abstract
【Objective】Whether selenium (Se) could regulate the inflammatory damage of bovine mammary epithelial cells (bMECs) induced by S. aureus through Nod2/MAPK/mTOR pathway remains to be further studied. So in the study, the effects of Se on the key proteins in the Nod2/MAPK/mTORs signaling pathway in the bovine mammary epithelial cells (bMECs) infected by S. aureus was studied in order to provide a theoretical basis for elucidating the immune regulation mechanism of Se.【Method】 Firstly, the bMECs were inoculated into the 6 well plates with 10 ⁶cells/well. When more than 80% of the cells were confluent, the medium was replaced with the one containing different concentrations of Se (2, 4 and 8 μmol·L ^-1) and continued to culture for 12 h. Then after washing each well for 3 times with PBS, S.aureus was added into 6-well plates at a ratio of MOI=1:1 and continued to culture for 0.5 h. The bMECs were collected for further detection of related proteins expression. The experiment was divided into three groups: control (Con) group (bMECs), model (Mod) group (bMECs+S. aureus) and experimental group. The experimental group was divided into three sub-dose groups, namely Low group (bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus), Mid group (bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S.aureus) and Hig group (bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus), with three replicates each group. Total protein was extracted from the above bMECs using a bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. The expressions level of Nod2 and RIP2 and the phosphorylation level of JNK, AKT and mTOR proteins in bMECs were detected by Western blotting. The protein samples were loaded into 10% SDS polyacrylamide gel for electrophoresis, and the uniform volume of protein was 20 μg/hole. Then the protein was transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes. The PVDF membranes were blocked with 5 mL 5% nonfat milk for 2 h, then skimmed the nonfat milk and washed the membranes with TBST, subsequently the membranes were incubated overnight with 5 mL primary antibodies including Nod2, RIP2, JNK, AKT, mTOR and β-actin. The primary antibodies were recovered, and 5 mL second antibodies were added to the membranes and incubated for 2 h at room temperature. Subsequently the second antibodies were recovered the membranes were washed with TBST for 5 times. Finally the membranes were developed with chemiluminescent substrate under darkroom conditions.【Result】S. aureus could significantly increase the expression of Nod2 and RIP2 proteins and the phosphorylation of JNK, AKT and mTOR proteins in bMECs (P<0.01). At 0.5 h after S. aureus infection, the level of Nod2 protein increased significantly (P<0.01). The expression of Nod2 protein was significantly inhibited by adding 2 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.01), and the expression of Nod2 was significantly inhibited by adding 8 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.05); at 0.5 h after S. aureus infection, RIP2 protein level was significantly increased (P<0.05), while the expression of RIP2 protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.05); at 0.5 h after S. aureus infection, the phosphorylation level of JNK protein in model group was significantly higher than that in control group (P<0.01). The phosphorylation of JNK protein was significantly inhibited by adding 4 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.05), and the phosphorylation of JNK protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.01); at 0.5 h after S. aureus infection, the phosphorylation level of AKT protein in the model group was significantly higher than that in the control group (P<0.01). The phosphorylation level of JNK protein was significantly inhibited by adding 4 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.01). The phosphorylation level of AKT protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.05). After 0.5 h of S. aureus infection, the phosphorylation level of mTOR protein was significantly increased in the model group (P<0.01). The phosphorylation of mTOR protein was significantly inhibited by adding 4 and 8 μmol·L ^-1 Se to the medium (P<0.05). 【Conclusion】Se could alleviate the inflammatory response of bMECs induced by S. aureus by inhibiting the protein expression of key factors in the bMECs Nod2/MAPK/mTORs signaling pathway.
Keywords：selenium; S. aureus;Nod2/MAPK/mTORs;bMECs


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本文引用格式
毕崇亮, 刘俊俊, 王亨, 王娟, 韩照清, 关立增. 硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响[J]. 中国农业科学, 2019, 52(16): 2891-2898 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.16.014
BI ChongLiang, LIU JunJun, WANG Heng, WANG Juan, HAN ZhaoQing, GUAN LiZeng. Effects of Selenium on the Key Factors in Nod2/MAPK/mTORs Signaling Pathways in the bMECs Infected S. aureus[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(16): 2891-2898 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.16.014

0 引言

【研究意义】奶牛金黄色葡萄球菌（S. aureus）性乳房炎是奶牛养殖业中常见疾病之一^[1,2]。该病不仅造成奶产量和奶品质显著下降,给奶牛养殖业带来严重的经济损失,同时也严重威胁着人类的食品安全健康^[3]。研究表明,金黄色葡萄球菌（S. aureus）具备侵入到宿主细胞内部从而逃避宿主的胞外免疫攻击的能力,这为该病的治疗带来了巨大的困难^[2]。奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）是乳腺组织抵御病原感染的第一道防线^[4,5]。当感染发生时,bMECs可通过胞外模式识别受体快速识别胞外病原,进而免疫应答反应,而对于进入到胞内的病原则主要依赖于胞内模式识别受体^[6]。Nod2近些年来新发现的一种胞内模式识别受体,研究Nod2受体及其介导的信号通路对于更好的理解胞内免疫反应具有重要的意义。本课题组前期研究发现Nod2可诱导多条信号通路的表达其中包括经典的炎症信号通路MAPK^[7]。而MAPK信号通路中的核心蛋白JNK又是连接多条信号通路的枢纽,比如mTOR信号通路^[8]。mTOR信号通路作为细胞内的一条重要的转导途径,在细胞的生长、存活、增殖、凋亡等过程中发挥着重要的生物学作用。硒是动物体必需的微量元素,在动物体的免疫防御过程中也发挥着重要的调控作用^[9,10]。临床研究表明,饲料中添加适量的硒,能显著降低奶牛乳腺炎的发病率或减轻乳腺的病变程度。那么硒能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。【前人研究进展】一些研究者研究表明,在饲料中补充适量的硒后,不仅动物硒的营养状况得到改善,而且各种类型的乳腺炎发病率也明显降低^[11,12,13]。如ARIBI等研究发现,在饲料中添加硒后,患乳腺炎奶牛的体内嗜中性粒细胞的迁移速率显著增高,被感染乳区内巨噬细胞的数量也明显增加^[14]。HEMINGWAY 等研究发现,在日粮中添加硒后,奶牛乳汁内的体细胞数显著减少^[15]。上述研究结果表明：奶牛日粮中硒的缺乏将增加乳腺被微生物感染的几率。而在饲料中添加硒可增强乳腺组织内免疫细胞的活性和数量,从而对病原微生物起到抑制作用。然而最近研究表明,硒也可抑制炎症相关信号通路的激活而抑制炎性介质的释放而起到抗炎的效果^[16]。硒对信号通路的调控为乳腺炎的预防和治疗提供了新的方向。NF-κB和MAPK作为两条经典的炎症信号通路,在TLR2和Nod2等上游通路的介导下可诱发机体的炎症反应,并产生相应的免疫效应,如炎症细胞因子的释放和免疫细胞的分化。补硒能极显著地抑制巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路的激活,降低炎症细胞因子的表达^[17,18]。如ZHANG等研究发现,TNF-α的表达可反馈性的诱导NF-κB的活化,同时负反馈抑制硒蛋白的表达^[19]。硒也可通过对NF-κB信号通路的调控抑制炎症细胞因子的基因表达,加速细胞的氧化还原反应,进而表现出抗炎作用^[20]。硒也可通过对MAPK信号通路的调控抑制炎症细胞因子的基因表达,加速细胞的氧化还原反应,进而表现出抗炎作用^[21]。【本研究切入点】硒虽然可以通过调节TLR2信号通路而减轻bMECs炎症反应^[11],但硒是否可通过调控Nod2/MAPK/mTORs信号通路而抑制S. aureus诱导的bMECs炎症反应,有必要进行深入的研究。【拟解决的关键问题】本研究利用S. aureus感染预孵育硒的bMECs后,检测bMECs Nod2/MAPK/ mTORs信号通路中相关基因表达水平变化情况,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2016年9月至2018 年8月在临沂大学农林科学学院进行。

1.1 试验材料

S. aureus（ATCC29213）,扬州大学兽医学院外科教研室惠赠;BCA蛋白测定试剂盒,购自美国BioChain公司;聚偏氟乙烯（PVDF）膜,购自德国MiLople公司;Nod2、RIP2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司（使用浓度1﹕2 000）;HRP标记羊抗兔IgG 购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 bMECs的分离和培养与试验分组

根据本课题组已经建立的原代奶牛乳腺上皮细胞培养方法^[19],采用机械剪碎配合 II 型胶原酶消化法培养原代奶牛乳腺上皮细胞。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。

1.3 S. aureus感染bMECs模型的建立

将bMECs以10⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用不同浓度硒（2,4和8 μmol·L^-1）的培养基替换原来的培养基,继续培养12 h。然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞。

1.4 Western blotting检测相关关键因子蛋白的表达

根据试剂盒说明书的步骤,利用BCA蛋白测定试剂盒从上述被S. aureus感染的bMECs中提取总蛋白。然后将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上;将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗;之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗;PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。

1.5 数据分析

用SPSS13.0软件进行数据分析,结果以Mean± SEM的形式表示。取P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异。采用Graph pad prism 6.0软件绘图。

2 结果

2.1 硒对S. aureus诱导的bMECs中Nod2信号通路Nod2和RIP2 蛋白表达的影响

用2、4和8 μmol·L^-1浓度的硒对bMECs进行预孵育,然后再进行S. aureus感染处理,在感染后0.5 h,bMECs被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了Nod2和RIP2蛋白表达水平。结果显示,S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L^-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L^-1的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05, 图1-A）。

图1

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图1硒对S. aureus诱导的bMECs中Nod2信号通路Nod2和RIP2 关键蛋白表达影响

A：Nod2蛋白相对表达量;B：RIP2蛋白相对表达量。“#”表示模型组与对照组相比P<0.05、“##”表示模型组与对照组相比P<0.01;“★”表示实验组与模型组相比P<0.05、“★★”表示实验组与模型组相比P<0.01。下同
Fig. 1Effects of Se on the expression of Nod2 and RIP2 key proteins in the Nod2 signaling pathway of bMECs induced by S. aureus

A: relative expression of Nod2 mRNA; B: relative expression of RIP2 mRNA. “#”indicates the model group(Mod) compares with the control group (Con) at P<0.05 level, “##”indicate model group (Mod) compares with control group (Con) at P<0.01 level; “★”indicates the test group compares with the model group (Mod) at P<0.05 level, “★★”indicate the test group compares with the model group (Mod) at P<0.01 level. The same as below


结果显示,S. aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L^-1硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05, 图1-B）。

上述结果表明：硒能调控Nod2和RIP2 蛋白表达而抑制S. aureus诱导的bMECs炎症反应。

2.2 硒对S. aureus诱导的bMECs中MAPK信号通路JNK 蛋白磷酸化水平的影响

用2、4和8 μmol·L^-1浓度的硒对bMECs进行预孵育,然后再进行S. aureus感染处理,在感染后0.5 h,bMECs细胞被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了JNK 蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,S. aureus感染0.5 h后,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L^-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L^-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）（图2）。结果表明：硒能调控JNK 蛋白表达而抑制S. aureus诱导的bMECs炎症反应。

图2

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图2硒对S. aureus诱导的bMECs中MAPK信号通路JNK 磷酸化水平的影响

Fig. 2Effect of Se on phosphorylation of JNK in MAPK signaling pathway of bMECs induced by S. aureus

2.3 硒对S. aureus诱导的bMECs中mTOR信号通路AKT和mTOR 蛋白磷酸化水平的影响

用2、4和8 μmol·L^-1浓度的硒对bMECs进行预孵育,然后再进行S. aureus感染处理,在感染后0.5 h,bMECs细胞被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了AKT和mTOR 蛋白磷酸化水平。如图3-A所示,与对照组相比,S. aureus感染0.5 h后,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L^-1硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L^-1硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）（图3-A）。

图3

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图3硒对S. aureus诱导的bMECs中mTOR信号通路AKT和mTOR 磷酸化水平的影响

A：AKT蛋白磷酸化水平;B：mTOR蛋白磷酸化水平
Fig. 3Effect of Se on phosphorylation of AKT and mTOR in mTOR signaling pathway of bMECs induced by S. aureus

A: relative phosphorylation level of AKT protein; B: relative phosphorylation level of mTOR protein


结果显示,S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4和8 μmol·L^-1的硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05,图3-B）。

上述结果表明：硒能调控AKT和mTOR 蛋白表达而抑制S. aureus诱导的bMECs炎症反应。

3 讨论

S. aureus可侵入到宿主细胞内部从而逃避胞外模式识别受体的攻击,而在这个过程中Nod2信号通路发挥了重要的作用^[22,23]。目前,Nod2信号通路与炎症的关系也有了一定的研究进展,其中活化的Nod2蛋白主要通过CARD-CARD结构域之间的相互作用与RIP2分子结合,并以RIP2作为衔接蛋白进一步诱导后续炎症反应^[24]。适当的炎症对机体是有益的,但是过度的炎症则会对组织器官造成伤害^[25]。在本研究中发现在S. aureus感染0.5 h后,Nod2和RIP2蛋白表达增加,此结果说明Nod2信号通路在S. aureus早期感染中起重要作用。Western blotting结果证实,2 μmol·L^-1和8 μmol·L^-1的硒对Nod2蛋白的表达有一定的抑制作用,而8 μmol·L^-1的硒对RIP2蛋白的表达有一定的抑制作用。上述结果说明硒能通过抑制Nod2信号通路的激活。

Nod2信号通路可进一步激活MAPK和mTORs等通路进一步诱导后续的炎症进程^[26]。MAPK可分为ERK、P38和JNK 3个亚群^[27]。在之前的研究中,我们发现硒对p38和ERK的磷酸化具有一定的调控作用^[21]。而硒对JNK磷酸化的调控作用我们尚未涉及。因此,本研究利用Western blotting技术进一步探究了硒对JNK磷酸化水平的影响。结果表明,S. aureus可显著提高 JNK蛋白磷酸化水平,4 μmol·L^-1和8 μmol·L^-1硒能降低S. aureus诱导的JNK磷酸化表达。该结果也进一步说明硒可有效调控MAPK信号通路。

AKT是MAPK和mTORs信号通路之间的主要衔接蛋白^[28,29]。伴随着MAPK信号通路的激活AKT也将随之活化将炎症信号向下游继续传导。本研究采用Western blotting技术检测了S. aureus感染bMECs过程中AKT磷酸化水平的变化。结果表明,S. aureus感染0.5 h后,AKT蛋白磷酸化水平显著增加,4和 8 μmol·L^-1可有效降低AKT蛋白磷酸化表达水平。mTOR是AKT的重要底物。AKT可直接磷酸化mTOR的SER位点,激活mTORs信号通路^[30]。本研究发现S. aureus感染bMECs 0.5 h后,mTOR蛋白磷酸化水平增加,而硒同样可抑制mTOR蛋白的磷酸化表达。上述结果说明,硒对Nod2/RIP2/JNK/mTOR这条通路具有有效的调控作用。

4 结论

在奶牛乳腺炎过程中,S. aureus可激活bMECs Nod2/MAPK/mTOR信号通路,而硒可通过调控Nod2、RIP2、JNK和mTOR等蛋白的表达而调控Nod2/ MAPK/mTOR信号通路。

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被引期刊影响因子

[1] 李广栋, 吕东颖, 田秀芝, 姬鹏云, 郭江鹏, 路永强, 刘国世 . 组学技术在奶牛乳房炎上应用的相关研究进展
中国农业科学, 2019,52(2):350-358.
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.013Magsci [本文引用: 1]
<p id="C2">奶牛乳房炎发病率较高、病因复杂,是影响世界奶牛业发展的主要常见疾病之一。由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等病原体引起的临床和隐形乳房炎对动物性食品安全及畜牧业的正常发展构成巨大安全隐患,全球每年因奶牛乳房炎导致的经济损失多达数十亿美元。近年来随着测序技术的不断突破和测序成本的不断降低,生命科学的研究进入了多组学时代,其在畜牧业中的应用也越来越广泛。对奶牛乳房炎来说,传统的组织病理学筛查、体细胞计数、牛乳pH检测、牛乳电导率检测、酶活检验、红外热显影等诊断技术由于其自身的局限性难以充分全面地阐明其发病机理,已不能满足科研人员的需求。组学技术即Omics,主要包括基因组学技术、蛋白质组学技术和代谢组学技术等。通过基因组学研究不仅能从转录层面上揭示奶牛乳房炎复杂性状的表型变异及遗传基础,还能从转录后调控（miRNAs、LncRNAs等）和表观遗传学修饰（DNA甲基化、组蛋白修饰等）层面挖掘出相关的DNA和RNA变化及多分子间的相互作用规律,能够帮助我们更好地了解奶牛乳腺组织对病原体的免疫应答机制,筛选鉴定出乳房炎抗性的信号通路及关键候选基因,从而提高基因组预测或选择的准确性。利用蛋白质组学技术能够对不同环境不同状态的牛乳及乳腺组织的蛋白质种类、表达丰度、蛋白互作、翻译后修饰等进行比较分析,对差异表达的蛋白质经过COG功能注释、数据库比对、GO和Pathway富集分析,可以从蛋白水平揭示乳房炎发生及防御过程中的复杂调控机制,同时还能发现乳房炎诊断的标记分子,进而为乳房炎治疗药物的研发提供潜在的精准靶点。代谢组学是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学研究,能够同时对机体在内、外环境等复杂因素作用下及特定生理时期内所有低分子量代谢产物（如氨基酸、脂类、碳水化合物等）进行精准、高效的定性和定量分析,从而阐明相关的代谢途径;其作为基因表达的最下游,能使基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上得到放大,进而可以更充分地反映细胞功能。将代谢组学技术应用到奶牛乳房炎研究中,能够分析出差异代谢物、鉴定出相关的生物标志物,进而揭示奶牛乳腺的生理及病理变化过程。总之,将各组学技术及多组学整合关联分析应用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御机制,进而为乳房炎的预测、诊断和治疗提供有价值的参考和借鉴。本文就最近几年组学技术在奶牛乳房炎领域的研究进展进行综述,以期为我国奶牛健康及奶业安全发展提供指导。</p>
LI G D, Lü D Y, TIAN X Z, JI P Y, GUO J P, LU Y Q, LIU G S . Research progress of omics technologies in cow mastitis
Scientia Agricultura Sinica, 2019,52(2):350-358.(in Chinese)
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.013Magsci [本文引用: 1]
<p id="C2">奶牛乳房炎发病率较高、病因复杂,是影响世界奶牛业发展的主要常见疾病之一。由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等病原体引起的临床和隐形乳房炎对动物性食品安全及畜牧业的正常发展构成巨大安全隐患,全球每年因奶牛乳房炎导致的经济损失多达数十亿美元。近年来随着测序技术的不断突破和测序成本的不断降低,生命科学的研究进入了多组学时代,其在畜牧业中的应用也越来越广泛。对奶牛乳房炎来说,传统的组织病理学筛查、体细胞计数、牛乳pH检测、牛乳电导率检测、酶活检验、红外热显影等诊断技术由于其自身的局限性难以充分全面地阐明其发病机理,已不能满足科研人员的需求。组学技术即Omics,主要包括基因组学技术、蛋白质组学技术和代谢组学技术等。通过基因组学研究不仅能从转录层面上揭示奶牛乳房炎复杂性状的表型变异及遗传基础,还能从转录后调控（miRNAs、LncRNAs等）和表观遗传学修饰（DNA甲基化、组蛋白修饰等）层面挖掘出相关的DNA和RNA变化及多分子间的相互作用规律,能够帮助我们更好地了解奶牛乳腺组织对病原体的免疫应答机制,筛选鉴定出乳房炎抗性的信号通路及关键候选基因,从而提高基因组预测或选择的准确性。利用蛋白质组学技术能够对不同环境不同状态的牛乳及乳腺组织的蛋白质种类、表达丰度、蛋白互作、翻译后修饰等进行比较分析,对差异表达的蛋白质经过COG功能注释、数据库比对、GO和Pathway富集分析,可以从蛋白水平揭示乳房炎发生及防御过程中的复杂调控机制,同时还能发现乳房炎诊断的标记分子,进而为乳房炎治疗药物的研发提供潜在的精准靶点。代谢组学是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学研究,能够同时对机体在内、外环境等复杂因素作用下及特定生理时期内所有低分子量代谢产物（如氨基酸、脂类、碳水化合物等）进行精准、高效的定性和定量分析,从而阐明相关的代谢途径;其作为基因表达的最下游,能使基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上得到放大,进而可以更充分地反映细胞功能。将代谢组学技术应用到奶牛乳房炎研究中,能够分析出差异代谢物、鉴定出相关的生物标志物,进而揭示奶牛乳腺的生理及病理变化过程。总之,将各组学技术及多组学整合关联分析应用到奶牛乳房炎研究中可以更深入地揭示其病原防御机制,进而为乳房炎的预测、诊断和治疗提供有价值的参考和借鉴。本文就最近几年组学技术在奶牛乳房炎领域的研究进展进行综述,以期为我国奶牛健康及奶业安全发展提供指导。</p>

[2] 赫娜, 王长法, 杨宏军, 何洪彬, 杨少华, 王立群, 高运东, 仲跻峰 . 牛源金黄色葡萄球菌突变株的筛选、鉴定及其免疫原性的研究
中国农业科学, 2010,43(10):2174-2181.
Magsci [本文引用: 2]
<P><FONT face=Verdana>【目的】诱变牛源金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb),筛选、鉴定弱毒性突变株,并研究其在鼠上的免疫交叉保护性。【方法】牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)化学诱变,经生长特性、回复突变、毒力检测、LD50、多种特征性酶检测、小鼠中免疫保护性等实验比较研究了突变株与亲本株的生物学特性,筛选得到遗传性状稳定β－溶血素缺失的弱毒性突变株。【结果】弱毒性突变株Hx与亲本株相比：其β－溶血性状完全缺失,生长缓慢,耐热核酸酶、血浆凝固酶等胞外蛋白的产量减少,在活体条件下可产生荚膜,半数致死量(LD50)10－1.83<I>&#</I>8226;mL-1远低下于亲本株的10－4.33<I>&#</I>8226;mL-1。亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死量是未接种过的6—50倍。非亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死率是未接种过的5—60倍。【结论】突变株Hx的β－溶血素缺失,毒性减弱,对金黄色葡萄球菌攻击具有较高免疫保护性。<BR></FONT></P>
HE N, WANG C F, YANG H J, HE H B, YANG S H, WANG L Q, GAO Y D, ZHONG J F . Screening an attenuated strain and immunogenicity in mice of a bovine mastitis staphylococcus aureus mutant
Scientia Agricultura Sinica, 2010,43(10):2174-2181. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 2]
<P><FONT face=Verdana>【目的】诱变牛源金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb),筛选、鉴定弱毒性突变株,并研究其在鼠上的免疫交叉保护性。【方法】牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)化学诱变,经生长特性、回复突变、毒力检测、LD50、多种特征性酶检测、小鼠中免疫保护性等实验比较研究了突变株与亲本株的生物学特性,筛选得到遗传性状稳定β－溶血素缺失的弱毒性突变株。【结果】弱毒性突变株Hx与亲本株相比：其β－溶血性状完全缺失,生长缓慢,耐热核酸酶、血浆凝固酶等胞外蛋白的产量减少,在活体条件下可产生荚膜,半数致死量(LD50)10－1.83<I>&#</I>8226;mL-1远低下于亲本株的10－4.33<I>&#</I>8226;mL-1。亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死量是未接种过的6—50倍。非亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死率是未接种过的5—60倍。【结论】突变株Hx的β－溶血素缺失,毒性减弱,对金黄色葡萄球菌攻击具有较高免疫保护性。<BR></FONT></P>

[3] 倪春霞, 蒲万霞, 胡永浩, 邓海平 . 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究
中国农业科学, 2011,44(2):417-422.
Magsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。<BR></FONT></P>
NI C X, PU W X, HU Y H, DENG H P . Research on coagulase genotyping of staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis
Scientia Agricultura Sinica, 2011,44(2):417-422. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。<BR></FONT></P>

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