汤亚飞, 裴凡, 李正刚, 佘小漫, 于琳, 蓝国兵, 邓铭光, 何自福^,广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室,广州 510640

Identification of Viruses Infecting Peppers in Guangdong by Small RNA Deep Sequencing

TANG YaFei, PEI Fan, LI ZhengGang, SHE XiaoMan, YU Lin, LAN GuoBing, DENG MingGuang, HE ZiFu^,Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

通讯作者: 何自福,Tel：020-87597476;E-mail： hezf@gdppri.com

汤亚飞和裴凡为同等贡献作者。
责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-03-15接受日期:2019-04-29网络出版日期:2019-07-01

基金资助:

国家重点研发计划.2018YFD0201209 广东省科技创新战略专项资金重点领域研发计划.2018B020205003 2017年省级现代农业产业技术推广体系建设项目.2017LM4163

Received:2019-03-15Accepted:2019-04-29Online:2019-07-01
作者简介 About authors
汤亚飞,E-mail：yf.tang1314@163.com

裴凡,E-mail： 1028176331@qq.com。









摘要
【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）(44.0%）、甜椒内源RNA病毒（Bell pepper endornavirus,BPEV）（32.8%）、烟草轻型绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）（31.2%）、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）（29.6%）、辣椒黄脉病毒1（Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1）（26.4%）、甜椒斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（25.6%）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）（18.4%）、辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）（16.8%）、辣椒黄脉病毒6（Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6）（16.8%）、马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y,PVY）（15.2%）、辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）（14.4%）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）（9.6%）、辣椒隐症病毒1（Pepper cryptic virus 1,PCV1）（8.8%）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）（4.0%）。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMoV、ChiVMV和PVMV分布广泛,PMMoV除了茂名外,ChiVMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMoV、ChiVMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMoV、ChiVMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。
关键词： 辣椒病毒病;种类鉴定;小RNA深度测序;RT-PCR;广东省

Abstract
【Objective】 The viral disease is one of the major diseases of pepper production in Guangdong Province. The disease incidence is generally 5%-30% in the field, which can up to 100% in serious field. The objective of this study is to identify virus species infecting pepper in Guangdong Province, and to provide a theoretical basis for the prevention and control of pepper virus disease. 【Method】 From 2013 to 2016, a total of 125 susceptible pepper plant samples were collected from 8 major pepper growing areas of Guangzhou, Foshan, Huizhou, Jiangmen, Meizhou, Zhanjiang, Maoming and Shaoguan in Guangdong Province. Total RNA was extracted respectively from the leaves of 125 pepper samples. The 7 mixed samples collected from Maoming, Meizhou and Shaoguan were analyzed by small RNA deep sequencing. According to the results of small RNA deep sequencing analysis, two pairs of specific primers of each virus were designed to RT-PCR. The first pair of specific primers was designed according to the sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. The second pair of specific primers was designed according to the conserved region sequences of viral genome in the GenBank database with the highest homology to sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. Using disease samples RNA involved in small RNA deep sequencing as a template, the RT-PCR amplification was carried out with the two pairs of primers. Based on RT-PCR amplification results, the better pair of specific primers of each virus was selected. Furthermore, all 125 samples collected from Guangdong Province were subjected to detect viruses with the better pair of specific primers by RT-PCR. 【Result】 Fourteen viruses were identified in 125 samples collected from major pepper growing areas in 8 cities of Guangdong Province. According to the order of detection rate from high to low, they were Pepper mild mottle virus (PMMoV) (44.0%), Bell pepper endornavirus (BPEV) (32.8%), Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) (31.2%), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) (29.6%), Pepper vein yellow virus 1 (PeVYV-1) (26.4%), Pepper veinal mottle virus (PVMV) (25.6%), Cucumber mosaic virus (CMV) (18.4%), Chilli ringspot virus (ChiRSV) (16.8%), Pepper vein yellow virus 6 (PeVYV-6) (16.8%), Potato virus Y (PVY) (15.2%), Capsicum chlorosis virus (CaCV) (14.4%), Broad bean wilt virus 2 (BBWV-2) (9.6%), Pepper cryptic virus 1 (PCV1) (8.8%), Tobacco mosaic virus (TMV) (4.0%). The detection rates of PMMoV, BPEV, TMGMV, ChiVMV, PeVYV-1 and PVMV were over 25%. PMMoV, ChiVMV and PVMV were widely distributed in Guangdong Province. PMMoV (except Maoming), ChiVMV (except Shaoguan) were detected in pepper producing areas of other 7 cities. PVMV was detected in pepper producing areas of 8 cities. According to detection rate and distribution range, it was concluded that PMMoV, ChiVMV and PVMV were the dominant viruses infecting pepper in Guangdong Province. The mixed infection phenomenon was common on peppers in Guangdong Province. The detection rate of mixed infection was up to 88.0% in 125 samples. Among them, the mixed detection rates of 2 kinds, 3 kinds, 4 kinds, 5 kinds, 6 kinds, 7 kinds and 8 kinds of viruses were 28.0%, 25.6%, 12.0%, 9.6%, 6.4%, 1.6%, 2.4%, respectively. So, 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection were the main infection forms on peppers in Guangdong Province. 【Conclusion】 There are 14 kinds of viruses endangering pepper plants in Guangdong Province, among which PMMoV, ChiVMV and PVMV are the dominant viruses. The phenomenon of mixed infection is common. The main infection forms on peppers are 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection in Guangdong Province.
Keywords：pepper virus diseases;virus identification;small RNA deep sequencing;RT-PCR;Guangdong Province


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本文引用格式
汤亚飞, 裴凡, 李正刚, 佘小漫, 于琳, 蓝国兵, 邓铭光, 何自福. 基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类[J]. 中国农业科学, 2019, 52(13): 2256-2267 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.006
TANG YaFei, PEI Fan, LI ZhengGang, SHE XiaoMan, YU Lin, LAN GuoBing, DENG MingGuang, HE ZiFu. Identification of Viruses Infecting Peppers in Guangdong by Small RNA Deep Sequencing[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(13): 2256-2267 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.006

0 引言

【研究意义】病毒病是辣椒（Capsicum annuum）生产上的主要病害,在世界各辣椒产区普遍发生,影响辣椒的产量与品质。广东是我国辣椒主要产区之一,年种植面积约10万公顷,其中年冬种面积超过70%,病毒病每年均对辣椒生产造成不同程度的损失。因此,对危害广东辣椒的病毒种类开展研究,对减轻辣椒病毒病的危害以及促进辣椒产业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】可侵染辣椒并引起病害的病毒种类众多,世界各地陆续报道的辣椒病毒有70种以上^[1],而我国发现至少有37种^{[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]},具体包括烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）、蚕豆萎蔫病毒1号（Broad bean wilt virus 1,BBWV-1）、马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）、烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）、辣椒斑驳病毒（Pepper mottle virus,PepMoV）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）、花生黄斑病毒（Groundnut yellow spot virus,GYSV）、中国辣椒黄化曲叶病毒（Pepper yellow leaf curl China virus,PYLCCNV）、云南辣椒曲叶病毒（Pepper leaf curl Yunnan virus,PeLCYnV）、烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus,TbCSV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）、烟草轻型绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）、番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）、番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）、辣椒内源RNA病毒（Bell pepper endornavirus,BPEV）、凤仙花坏死斑点病毒（Impatiens necrotic spot virus,INSV）、辣椒黄脉病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）、甜椒斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）、西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus,WSMoV）、甜瓜蚜传黄化病毒（Melon aphid- borne yellows virus,MABYV）、甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、南瓜蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borne yellow virus,CABYV）、烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）、辣椒隐潜病毒1号（Pepper cryptic virus 1,PCV1）、辣椒隐潜病毒2号（Pepper cryptic virus 2,PCV2）。对于危害广东辣椒的病毒种类也有一些报道,如饶雪琴等^[30]对广州市郊及邻近地区的辣椒病毒病进行调查与病原检测,CMV与TMV的检出率分别为36.67%和43.33%;张竹青^[5]从广东省39份辣椒病样中检测到TMV、ChiVMV、CMV、BBWV-1、BBWV-2、PVY、ToMV、PMMoV和PVMV 9种病毒,以TMV检出率最高,为30.76%;刘勇等^[12]在广州辣椒病样中检测到CaCV。应用RT-PCR方法,姚玉荣等^[31]在采集于广东湛江、茂名等地120份辣椒病样中检测到CMV、PMMoV、PVY、TYLCV、PVX,其中CMV检出率最高,为24.17%;汤亚飞等^[26]在广东兴宁辣椒病样中检测到WSMoV。【本研究切入点】前人的研究大多根据病株症状、已有的研究结果等作为依据,选择几种病毒作为检测对象,应用鉴别寄主、血清学及RT-PCR等检测鉴定方法,这些方法难以发现未知的病毒,而且辣椒上病毒复合侵染十分普遍,“多毒一症”的现象也并不少见,研究结果的局限性显而易见。本研究采用小RNA深度测序结合RT-PCR检测验证,可较全面地检测与鉴定侵染广东辣椒的病毒种类。【拟解决的关键问题】明确危害广东辣椒的病毒种类,为进一步防控辣椒病毒病提供科学依据。

1 材料与方法

试验于2013年9月至2016年12月在广东省农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 样本来源

2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主产区随机采集病毒病疑似病样125份,其中广州22份、佛山4份、惠州9份、江门3份、梅州10份、湛江34份、茂名27份、韶关16份。采集的样品在田间及时放入干冰速冻,带回实验室保存于-80℃冰箱。

1.2 主要试剂

植物RNA提取试剂盒（Easy Pure Plant RNA Kit）及大肠杆菌DH5a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;反转录试剂盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA分子量标记（DL2000、DL5000）、pMD20-T、Solution Ⅰ、Premix Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司;胶回收试剂盒（Gen JET Gel Extraction Kit）购自Thermo 公司;氨苄青霉素、X-gal、EDTA购自生工生物工程（上海）股份有限公司（简称上海生工）;琼脂糖购自广州华奇盛生物科技有限公司;其他常规分析纯试剂购自广州市芊荟化玻仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病害调查 采用5点取样法对广东省辣椒主产区的病毒病发生情况进行调查,每点调查不少于20株,观察田间症状,并统计病株率。

1.3.2 小RNA深度测序 从茂名、梅州、韶关3市的辣椒病样中按地点和症状分别取5—6个病样进行等量混合,其中茂名4份、梅州1份、韶关2份共计7份混合病样,用于小RNA深度测序,小RNA深度测序委托上海生工完成。

1.3.3 RT-PCR检测 病样RNA提取：分别取125份辣椒病样叶组织各100 mg,用植物RNA提取试剂盒分别提取其总RNA,溶解于40 μL DEPC处理的ddH₂O中,保存于-80℃冰箱,用于后续试验。

引物设计：根据小RNA深度测序分析结果,应用引物在线设计网站（http://primer3.ut.ee/）为每种病毒均设计2对特异性引物。第1对引物是直接根据小RNA深度测序拼接出的病毒基因片段序列设计;第2对引物是根据GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计,目的片段大小为400—800 bp。引物由上海生工合成。

引物筛选：以参与小RNA深度测序的病样RNA为模板,用上述2对特异引物分别进行RT-PCR扩增,验证小RNA深度测序分析结果的同时筛选出后续病样中病毒检测的引物对。取5 μL病样RNA,用随机引物（TaKaRa公司）反转录合成cDNA,反应体系和具体方法按照试剂盒说明书上的步骤进行,然后进行PCR扩增反应。PCR反应体系：上述反转录产物1 μL,PCR MIXER 25 μL,10 μmol·L^-1的上、下游引物各2 μL,加灭菌水至终体积50 μL。反应程序：94℃变性3 min,94℃变性0.5 min,52℃退火0.5 min,72℃ 1 min,35个循环;72℃延伸反应10 min。反应结束后,1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;进一步切胶回收特异片段,进行克隆、测序与比对分析,根据序列比对结果、RT-PCR扩增效果,每种病毒筛选出一对特异引物,用于对辣椒病样RT-PCR检测。

RT-PCR检测：应用筛选获得的每种病毒特异性较好的引物对,对采集于广东各辣椒产区的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,以明确其所含病毒种类。

2 结果

2.1 广东辣椒病毒病发生与危害情况

2013—2016年,调查了广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名、韶关8个辣椒主产区的辣椒病毒病发生情况,结果显示,辣椒病毒病主要表现为花叶、黄化、皱缩、泡斑等症状（图1）,其中以花叶最为普遍。一般田块辣椒病毒病的病株率5%—30%,严重的田块的病株率可达60%以上,甚至100%。

图1

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图1辣椒病毒病田间症状

Fig. 1Symptoms of pepper plants infected by virus in the field

2.2 小RNA深度测序分析

通过小RNA深度测序从7份混合辣椒病样分析出13种病毒（表1）,每个地区的病毒种类存在差异（表2）,茂名4份混合样品中分析出ChiRSV、BBWV-2、CMV、ChiVMV、PVMV、CaCV、TMGMV、PCV1、PeVYV-1、PeVYV-6、BPEV 11种病毒;梅州1份混合样品分析出BPEV、CaCV、PVMV、PMMoV、PVY 5种病毒;韶关2份混合样品中分析出CaCV、PCV1、PMMoV 3种病毒。

Table 1
表1
表1小RNA深度测序分析出的病毒种类所属的科属情况
Table 1Family and genus of the viruses analyzed by small RNA deep sequencing

病毒Virus	科Family	属Genus
Broad bean wilt virus 2 (BBWV-2)	Secoviridae	Fabavirus
Bell pepper endornavirus (BPEV)	Endornaviridae	Alphaendornavirus
Cucumber mosaic virus (CMV)	Bromoviridae	Cucumovirus
Pepper vein yellows virus 1 (PeVYV-1)	Luteoviridae	Polerovirus
Pepper vein yellows virus 6 (PeVYV-6)	Luteoviridae	Polerovirus
Chilli veinal mottle virus (ChiVMV)	Potyviridae	Potyvirus
Pepper veinal mottle virus (PVMV)	Potyviridae	Potyvirus
Chilli ringspot virus (ChiRSV)	Potyviridae	Potyvirus
Potato virus Y (PVY)	Potyviridae	Potyvirus
Capsicum chlorosis virus (CaCV)	Tospoviridae	Orthotospovirus
Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV)	Virgaviridae	Tobamovirus
Pepper mild mottle virus (PMMoV)	Virgaviridae	Tobamovirus
Pepper cryptic virus 1 (PCV1)	Partitiviridae	Deltapartitivirus

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Table 2
表2
表2小RNA深度测序分析广东辣椒样品中病毒的结果
Table 2The viruses derived from small RNA deep sequencing of pepper samples collected from Guangdong

病毒 Virus	拼接得到与病毒有同源性的contings（条）Numbers of assembled contings
	茂名-1 Maoming-1	茂名-2 Maogming-2	茂名-3 Maoming-3	茂名-4 Maoming-4	梅州 Meizhou	韶关-1 Shaoguan-1	韶关-2 Shaoguan-2
ChiRSV	5	9	10	-	-	-	-
BBWV-2	7	2	5	-	-	-	-
BPEV	12	11	5	-	21	-	-
CMV	5	6	16	5	-	-	-
PeVYV-1	6	5	2	-	-	-	-
ChiVMV	9	6	19	-	-	-	-
PVMV	18	7	-	-	5	-	-
PeVYV-6	2	3	2	-	-	-	-
CaCV	-	-	15	-	16	23	80
TMGMV	-	-	-	2	-	-	-
PCV1	-	-	-	2	-	3	-
PMMoV	-	-	-	-	3	-	2
PVY	-	-	-	-	3	-	-

-：阴性Negative

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2.3 RT-PCR验证小RNA深度测序结果

应用1.3.3设计的每种病毒2对特异引物,以用于小RNA测序病样RNA为模板,进行RT-PCR扩增。结果显示（表3）,所有小RNA深度测序分析出的病毒均能得到RT-PCR验证,同时发现应用RT-PCR方法能在少量病样中检测到小RNA深度测序未分析出的病毒种类。

Table 3
表3
表3小RNA深度测序分析结果与RT-PCR验证结果比较
Table 3Comparison of results between small RNA deep sequencing and RT-PCR

病毒 Virus	茂名-1 Maoming-1		茂名-2 Maoming-2		茂名-3 Maoming-3		茂名-4 Maoming-4		梅州 Meizhou		韶关-1 Shaoguan-1		韶关-2 Shaoguan-2
	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR	sRNA	RT-PCR
ChiVMV	+	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	-	-	-
TMGMV	-	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	+	-	-
BBWV-2	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
PCV1	+	+	-	-	-	-	+	+	-	-	+	+	+	+
CaCV	-	-	-	-	+	+	-	-	+	+	+	+	+	+
ChiRSV	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
PVMV	+	+	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	-	+
PMMoV	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	+
PVY	-	+	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	-	-
TMV	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+
CMV	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+
PeVYV-6	+	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	-	-	+
BPEV	+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	-	+	-	-
PeVYV-1	+	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+	-	+

+：阳性Positive;-：阴性Negative

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2.4 RT-PCR检测引物筛选

根据每种病毒2对特异引物的扩增效果和条带单一性,13种病毒各筛选到一对扩增效果较好的引物（表4）,用于后续病毒种类的检测。小RNA深度测序结果中未分析出TMV,而有前人研究报道TMV是引起广东辣椒病毒病的主要病原,因此,对广东辣椒病毒种类检测时,除检测上述13种病毒外,还增加了对TMV检测。

Table 4
表4
表4用于检测14种病毒的引物
Table 4Primers used to detect 14 viruses in this study

病毒Virus	引物Primer	序列Sequence (5′-3′)	目的片段Product (bp)
ChiVMV	ChiVMV1-F	CGAGTCTCATAAGTAATTGCAC	752
	ChiVMV1-R	AAGACATTTACTGATACCCTCC
TMGMV	TMGMV1-F	CCTCCCTGGTAATAGTACTATAC	407
	TMGMV1-R	CCAACTGTCCAATAGTACTTCT
ChiRSV	ChiRSV2-F	GAGTTCCACAGAGTAATGATCT	500
	ChiRSV2-R	GACTAACTGACTCTCACTCTTAC
BBWV-2	BBWV-2-1-F	GAGTTCAGTTACAGAAATTGGG	674
	BBWV-2-1-R	CATATGGGTTCCTTGAAATGAC
BPEV	BPEV1-F	AGGAGATGTGATTTCAGTAGAC	558
	BPEV1-R	TCTAATATTCTCTCCCCTCCTAG
PeVYV-1	PeVYV1-1-F	CTAGTCTACCTTAAGATCTCAGC	678
	PeVYV1-1-R	GTACTACCTTCTACCTATTTCGG
PVMV	PVMV2-F	GGTTTGGTGTATAGAAAATGGG	758
	PVMV2-R	CAGACTCTATCAGGTGGTATAAC
PeVYV-6	PeVYV6-1-F	GAAAAGAAAGTGGTGGAAGTAG	794
	PeVYV6-1-R	GGCTACCAATTGATCTACTAGAG
CaCV	CaCV1-F	CAGCTCTTAAATCAGTACTAGGG	472
	CaCV1-R	GTGTTTCCTGCATTAGTTCTAG
PCV1	PCV1-F	CAACACATATTCAGCATACTCC	608
	PCV1-R	GGGCGTATCTCTGATAATGATAG
PMMoV	PMMoV2-F	GCAGATCCCCTACGGTTCAA	761
	PMMoV2-R	CGCTATTCATCATCGCCAAAGT
PVY	PVY2-F	GAAGCGCGAGGAGAGAGAAA	728
	PVY2-R	TTATCGCTGCAACTCTGCCA
CMV	CMV-F	ATGGACAAATCTGRATCWMCC	764
	CMV-R	CTGGATGGACAACCCGTTC
TMV	TMV-F	CGGTCAGTGCCGAACAAGAA	600
	TMV-R	ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT

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2.5 广东各地辣椒病样RT-PCR检测结果

应用筛选获得的每一种病毒特异性较好的引物,对125份疑似辣椒病毒病样分别进行RT-PCR检测。结果表明（表5）,广州病样中检测到9种病毒,其中ChiVMV检出率最高,为54.5%;佛山病样中检测到5种病毒,其中PMMoV检出率最高,为100.0%;惠州病样检测到6种病毒,其中PVMV检出率最高,为77.8%;梅州病样中检测到8种病毒,其中PMMoV检出率最高,为100.0%;江门病样中检测到6种病毒,其中ChiVMV、CMV、PMMoV检出率较高,为66.7%;湛江病样中检测到10种病毒,其中PMMoV检出率最高,为73.5%;茂名病样中检测到12种病毒,其中BPEV检测率最高,为59.3%;韶关病样中检测到11种病毒,其中TMGMV检出率最高,为75.0%。

Table 5
表5
表5125份病样RT-PCR检测结果
Table 5The viruses in 125 samples detected by RT-PCR

病毒 Virus	检出率Detection rate (%)
	湛江 Zhanjiang	茂名 Maoming	江门 Jiangmen	佛山 Foshan	广州 Guangzhou	惠州 Huizhou	韶关 Shaoguan	梅州 Meizhou	合计 Total
PMMoV	73.5	0	66.7	100.0	31.8	55.6	12.5	100.0	44.0
BPEV	32.4	59.3	0	0	40.9	0	6.3	40.0	32.8
TMGMV	44.1	29.6	0	0	0	44.4	75.0	0	31.2
ChiVMV	17.6	22.2	66.7	50.0	54.5	44.4	0	50.0	29.6
PeVYV-1	5.9	44.4	0	0	40.9	0	37.5	40.0	26.4
PVMV	2.9	7.4	33.3	25.0	45.5	77.8	12.5	70.0	25.6
CMV	0	48.1	66.7	0	0	22.2	37.5	0	18.4
ChiRSV	8.8	33.3	0	0	4.1	0	0	0	16.8
PeVYV-6	2.9	29.6	0	0	27.3	0	25.0	20.0	16.8
PVY	8.8	7.4	33.3	0	22.7	66.7	6.3	10.0	15.2
CaCV	8.8	11.1	0	75.0	0	0	31.2	40.0	14.4
BBWV-2	0	40.7	0	25.0	0	0	0	0	9.6
PCV1	0	3.7	33.3	0	4.5	0	50.0	0	8.8
TMV	0	0	0	0	0	0	31.3	0	4.0

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2.6 14种病毒在广东省辣椒病样中的检出率及其分布情况

从125份辣椒病样中,共检测出14种病毒（表5）,检出率依次为PMMoV（44.0%）、BPEV（32.8%）、TMGMV（31.2%）、ChiVMV（29.6%）、PeVYV-1（26.4%）、PVMV（25.6%）、CMV（18.4%）、ChiRSV（16.8%）、PeVYV-6（16.8%）、PVY（15.2%）、CaCV（14.4%）、BBWV-2（9.6%）、PCV1（8.8%）、TMV（4.0%）。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上。

14种病毒在广东各辣椒产区的分布存在一定的差异（表5）。PVMV广泛分布于广州、佛山、惠州、梅州、江门、湛江、茂名及韶关8市辣椒产区;PMMoV除了茂名外,其他7市辣椒产区均有分布;ChiVMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVY除了佛山外,其他7市辣椒产区均有分布;PeVYV-1、PeVYV-6、CaCV和BPEV 4种病毒分布于5个市的辣椒产区;TMGMV、CMV及PCV1 3种病毒分布于4个市的辣椒产区;ChiRSV分布于广州、茂名和湛江3个市的辣椒产区;BBWV-2仅分布于佛山和茂名2个市的辣椒产区;而TMV仅在韶关辣椒病样品中检测到。

2.7 广东辣椒病样中病毒侵染情况

广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍（表6）。在125份病样中,仅15份样品中只检测到1种病毒,为单一病毒侵染外,其余均为复合侵染,其中2种病毒侵染的样品有35份,占28.0%;3种病毒侵染的样品有32份,占25.6%;4种病毒侵染的样品有15份,占12.0%;5种病毒侵染的样品有12份,占9.6%;6种病毒侵染的样品有8份,占6.4%;7种病毒侵染的样品有2份,占1.6%;而8种病毒侵染的样品也有3份,占2.4%。

Table 6
表6
表6各地区14种病毒单一或复合侵染的发生情况
Table 6Incidence of single or mixed infection of 14 viruses in samples collected from each region (%)

地点Region	1	2	3	4	5	6	7	8
湛江Zhanjiang	23.5	41.2	20.6	8.8	0	0	0	0
茂名Maoming	22.2	25.9	3.7	0	3.7	22.2	7.4	11.1
江门Jiangmen	0	33.3	66.7	0	0	0	0	0
佛山Foshan	0	25.0	75.0	0	0	0	0	0
广州Guangzhou	0	36.4	36.4	9.1	18.2	0	0	0
惠州Huizhou	11.1	22.2	0	33.3	33.3	0	0	0
韶关Shaoguan	0	6.3	43.8	31.3	12.5	6.3	0	0
梅州Meizhou	0	10.0	40.0	20.0	20.0	10.0	0	0
合计Total	12.0	28.0	25.6	12.0	9.6	6.4	1.6	2.4

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不同地区的辣椒病样中病毒复合侵染情况也存在差异（表6）。茂名地区辣椒病样中病毒复合侵染形式最多样化,存在2种、3种、5种、6种、7种、8种病毒复合侵染;其次梅州和韶关,辣椒病样中存在5种复合侵染形式。

3 讨论

本研究应用小RNA深度测序及RT-PCR方法对侵染广东省辣椒的病毒种类进行了较全面的检测与分析,鉴定出侵染危害广东辣椒的病毒14种,分别为PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1、PVMV、CMV、ChiRSV、PeVYV-6、PVY、CaCV、BBWV-2、PCV1、TMV。其中,PMMoV、ChiVMV和PVMV 3种病毒检出率在25%以上,且在本研究8市的辣椒主产区中的7市及以上产区均有分布。由此推测,PMMoV、ChiVMV和 PVMV是目前危害广东辣椒的优势病毒。

关于广东省侵染危害辣椒的病毒种类及其优势病毒,前人报道在广东辣椒上分别检测到CMV、TMV、CaCV、PMMoV、PVX、PVY、PVMV、TYLCV、ChiVMV、BBWV-l、BBWV-2、WSMoV及ToMV 13种病毒,并认为TMV与CMV为主要病原^{[2,5,12,26,30-31]}。本研究通过小RNA深度测序未分析出TMV、PVX、TYLCV、BBWV-1、WSMoV、ToMV 6种病毒,但新发现TMGMV、BPEV、PeVYV-1、PeVYV-6、ChiRSV、PCV1这6种病毒。此外,在检测的14种病毒中,CMV和TMV检出率仅分别为18%和4%,二者在广东辣椒上发生并不普遍,与前人的研究结果不同。导致这些差异的可能原因,一方面是不同地区侵染辣椒的病毒种类固有差异及其演替,另一方面是不同研究所采用的检测方法不同。前人的研究采用应用鉴别寄主、血清学及RT-PCR等检测鉴定方法,这些方法局限于对已知病毒种类的检测,无法发现未知病毒,而小RNA深度测序分析可在无病样中病毒信息的情况下一次性全面扫描病样中含有的病毒,信息量大,可检测到未知病毒,但是检测成本相对较高,也会由于病样中不同病毒含量的差异,造成对含量低的病毒漏检。本研究基于小RNA深度测序分析结果,并通过RT-PCR验证,可较全面地检测与鉴定侵染广东辣椒的病毒种类。

不同地区检测出的病毒种类不同,且优势病毒也存在差异。甘肃河西地区辣椒上有CMV、PMMoV、TMV、PVY、TEV,其中TMV和CMV为优势病毒种类^[32];侵染重庆辣椒的病毒有BBWV-2、CMV、TMV、TuMV、ToMV,其中CMV为优势病毒种类^[4];侵染海南辣椒的病毒有CMV、ChiVMV、PMMoV、ChiRSV和PVMV,其中CMV为优势病毒,但ChiRSV、PMMoV和PVMV 3种病毒的检出率在30%以上,已发展成为海南辣椒上不可忽视的病原^[33];侵染贵州辣椒的病毒为BBWV-2、CMV、PMMoV、TMV、PVY、ToMV、TuMV、TSWV、AMV和PepMoV等10种,其中CMV为优势病毒^[34];侵染天津辣椒的病毒包括BBWV、CMV、TMV、ToMV、TSWV、TYLCV,其中CMV为优势病毒种类^[35];而侵染山东辣椒的病毒包括BBWV-2、CMV、ChiVMV、PMMoV、TMV、PVY、ToMV、TMGMV、AMV、TYLCV、PeVYV、BWYV、MABYV和PCV 14种,其中PMMoV和CMV的检出率非常高,达到60%以上^[36]。本研究结果显示在危害广东辣椒的14种病毒中,PMMoV、ChiVMV和PVMV为优势病毒,与国内其他省辣椒上优势病毒存在明显差异。同时发现,广东省不同地区的优势病毒种类存在明显差异,梅州地区PMMoV检出率最高,为100.0%;佛山地区PMMoV检出率最高,为100.0%;湛江地区PMMoV检出率最高,为73.5%;广州地区ChiVMV检出率最高,为54.5%;江门地区PMMoV、ChiVMV、CMV检出率很高,为66.7%;惠州地区PVMV检出率最高,为77.8%;但茂名和韶关地区检出率最高的病毒分别为BPEV和TMGMV,检出率为59.3%和75.0%,不是危害广东省辣椒的优势病毒ChiVMV、PVMV和PMMoV;这一现象很有可能与当地的种植制度、栽培品种以及栽培环境有关,如茂名地区以冬种辣椒为主,从20世纪80年代开始种植,种植年限长,品种较为单一,以甜椒为主,与广东省其他地区种植模式存在明显差异;韶关属于粤北地区,气候较其他地区存在明显差异,因此栽培品种上存在一定的差异。

植物病毒复合侵染现象在自然界中普遍存在。张竹青^[5]对国内9省辣椒病毒样品检测结果显示,同时感染2种或2种以上病毒的占检测样品的79.33%;姚玉荣等^[31]报道海南省和广东省田间以CMV和PMMoV复合侵染辣椒现象较为普遍;郭思瑶等^[4]报道重庆地区辣椒病毒病复合侵染率为66.10%,其中2种、3种、4种及以上病毒复合侵染率分别为30.51%、26.27%、9.32%;王莉爽等^[34]报道贵州地区辣椒上2种或3种病毒复合侵染率为32.66%。本研究发现广东辣椒上病毒复合侵染十分普遍。在检测的125个病样品中,病毒复合侵染率高达88.0%,其中2种和3种病毒复合侵染形式的检出率最高,分别为28.0%、25.6%。由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要的侵染形式。

4 结论

利用小RNA深度测序及RT-PCR方法鉴定出危害广东辣椒的病毒包括14种,分别为PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1、PVMV、CMV、ChiRSV、PeVYV-6、PVY、CaCV、BBWV-2、PCV1、TMV。其中,PMMoV、ChiVMV和PVMV 3种病毒不仅检出率超过25%,且在广东8市辣椒产区有7市及以上产区有分布,是危害广东辣椒的优势病毒,与国内其他省辣椒上优势病毒存在明显差异;此外,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象较为严重,其中2种和3种病毒复合侵染是主要的侵染形式。

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利用斑点免疫杂交法（Dot-ELISA）和RT-PCR法对重庆地区发生的辣椒病毒病的病原进行了鉴定和优势病毒分析。利用5种常见蔬菜病毒的血清对采自重庆8个区县的152份辣椒病毒病样品进行Dot-ELISA检测，结果表明，共有118份辣椒样品检测呈阳性，其中，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的侵染最普遍，总检出率高达57.89%；番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）的总检出率最低，为22.52%；烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）和蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV-2）的总检出率分别为30.26%、36.18%和24.34%。在118份阳性样品中，有66.10%的样品受两种及以上病毒复合侵染，其中33.33%的样品受到CMV和TuMV复合侵染，有26.27%的样品受3种病毒复合侵染。设计5种病毒的特异性引物，随机选取16份阳性样品进行RT-PCR扩增，克隆测序结果表明扩增片段确实是5种病毒的相应序列，且RT-PCR与ELISA检测结果基本吻合。检测结果表明CMV是重庆地区辣椒上的优势病毒种类，且该地区辣椒上病毒复合侵染现象普遍。本文首次报道了ToMV和TuMV侵染辣椒。
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<p>2014 年在广东辣椒产区发现疑似番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒侵染引起的辣椒褪绿坏<br>死环斑症状。Dot-ELISA 检测显示，该病毒分离物与番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）单<br>克隆抗体不产生血清学反应，表明该病毒不属于TSWV。利用Tospovirus 属病毒通用引物gL3637/gL4435C<br>进行RT-PCR 检测，可以从所有辣椒病样总RNA 中扩增出预期大小约800 bp 的目的片段。基因克隆与序<br>列分析表明，该片段序列与西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）中国广州分离物的<br>同源性最高，为97.5%。系统进化分析也显示，该病毒分离物与WSMoV 各分离物亲缘关系最近，并聚类<br>在一个分支。因此，侵染广东辣椒的病毒分离物为WSMoV。</p>

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