董衍坤^,1, 黄定全², 高震², 陈栩^,2,*1福建农林大学资源与环境学院, 福建福州 350002
²福建农林大学海峡联合研究院园艺植物生物学及代谢组学研究中心, 福建福州350002

Identification, expression profile of soybean PIN-Like (PILS) gene family and its function in symbiotic nitrogen fixation in root nodules

DONG Yan-Kun^,1, HUANG Ding-Quan², GAO Zhen², CHEN Xu^{,2,* 1}College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
²Haixia Institute of Science and Technology, Horticultural Plant Biology and Metabolomics Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

通讯作者: *陈栩, E-mail:chenxu@inbox.com

收稿日期:2021-01-11接受日期:2021-04-26网络出版日期:2022-05-18

基金资助:

本研究由国家重点研发计划“七大农作物育种”专项课题作物器官发育与养分高效利用的互作机制项目资助(2016YFD0100705)

Received:2021-01-11Accepted:2021-04-26Published online:2022-05-18

Fund supported:

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China “Seven Major Crop Breeding” Special Topic Crop Organ Development and Nutrient Efficient Use Interaction Mechanism(2016YFD0100705)

作者简介 About authors
E-mail:dongyk1124@163.com



摘要
植物激素生长素在植物的生长发育过程中发挥了至关重要的作用, 它的稳态和浓度梯度建立控制了几乎所有器官的极性建成。生长素在特定细胞中合成、运输、感知以及代谢降解建立了符合器官发育的生长素浓度梯度。在豆科植物中, 根与土壤微生物互作形成了根瘤这一特殊的器官, 进行生物固氮。然而, 生长素稳态控制生物固氮的功能还未知。拟南芥中的研究表明, PIN-Like (PILS)蛋白协助调节的细胞内生长素稳态, 并介导下游细胞核内的生长素信号传递。本研究以大豆作为研究模型, 在大豆基因组中鉴定获得19个PILS家族基因(GmPILS), 不均匀分布于大豆10条染色体上。GmPILS在大豆9种组织部位中表现出多种表达模式, 且具有明显的组织表达特异性。GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤菌体区域富集表达, 使用人工微RNA沉默(artificial microRNA interference, amiRNAi)下调GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤的表达, 导致根瘤的固氮酶活性上升, 而过量表达GmPILS1f导致根瘤的固氮酶活性下降, 因此GmPILS1e和GmPILS1f可能参与大豆固氮酶活性的调节。这些结果为进一步解析大豆GmPILS家族基因的功能和作用机制奠定了基础, 同时也为结瘤固氮在农业育种中的应用提供了有价值的基因资源。
关键词： 大豆;PIN-Like (PILS)基因家族;根瘤;共生固氮

Abstract
Plant hormone auxin plays a vital role in the growth and development of plants. Auxin homeostasis and concentration gradient establishment control the polar formation of almost all organs. The synthesis, transportation, perception, and metabolic degradation of auxin in specific cells establish a concentration gradient of auxin in accordance with organ development. In legumes, roots interact with soil microorganisms to form a special organ called nodules, which is used for biological nitrogen fixation. However, the function of auxin homeostasis control of biological nitrogen fixation is unknown. Studies showed that PIN-Like (PILS) proteins in Arabidopsis helped to regulate intracellular auxin homeostasis and mediate auxin signal transmission in the downstream nucleus. In this study, 19 PILS family genes (GmPILSs) were identified in soybean genome and distributed unevenly on 10 chromosomes of soybean. GmPILSs exhibited a variety of expression patterns in nine tissue parts of soybean, and had obvious specificity of tissue expression. GmPILS1e and GmPILS1f were enriched and expressed in the rhizobia region, and the expression of GmPILS1e and GmPILS1f in nodules was down-regulated by artificial microRNA interference (amiRNAi), resulting in the increase of nitrogenase activity in the nodules. However, the overexpression of GmPILS1f leaded to the decrease nitrogenase activity in root nodules, GmPILS1e and GmPILS1f might participate in the regulation of soybean nitrogenase activity. These results lay the foundation for further analysis of the function and mechanism of soybean GmPILS family genes, and also provide valuable genetic resources for the application of nodulation and nitrogen fixation in agricultural breeding.
Keywords：Glycine max;PIN-Like (PILS) gene family;nodule;symbiotic nitrogen fixation


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本文引用格式
董衍坤, 黄定全, 高震, 陈栩. 大豆PIN-Like (PILS)基因家族的鉴定、表达分析及在根瘤共生固氮过程中的功能. 作物学报, 2021, 48(2): 353-366 DOI:10.3724/SP.J.1006.2022.14006
DONG Yan-Kun, HUANG Ding-Quan, GAO Zhen, CHEN Xu. Identification, expression profile of soybean PIN-Like (PILS) gene family and its function in symbiotic nitrogen fixation in root nodules. Acta Crops Sinica, 2021, 48(2): 353-366 DOI:10.3724/SP.J.1006.2022.14006


植物激素生长素在植物的生长发育过程中发挥着重要作用, 几乎影响了植物生长的所有方面, 包括胚胎发生、器官形成、维管束发育、根的生长、向性反应以及顶端优势和衰老等等^[1,2,3]。在器官建成过程中, 生长素浓度梯度的建立以及稳态的维持是控制器官极性建成的必要条件之一^[4]。迄今为止, 生长素精细控制根形态建成的机制被阐明的尤为清晰, 包括主根和侧根的发生和发育等^[5,6]。根的生长和极性建立需要生长素在特定细胞中的合成、运输、信号感知和传递以及代谢降解建立合适的生长素浓度梯度^[7,8,9]。

根系作为植物和土壤之间的主要接口, 是植物主要的养分和吸水器官^[10]。在土壤环境中, 根部被复杂的微生物群落包围^[11], 微生物群落可以与植物根部建立不同类型的分子和物理相互作用^[12]。例如, 豆科植物可以与根瘤菌相互作用, 形成新的植物器官—根瘤^[13,14]。利用根瘤, 豆科植物能够将空气中的氮气转换为可供植物吸收的铵, 这种绿色、无污染的氮素吸收模式叫做生物固氮^[15]。研究表明, 豆类完成其生命周期所需的50%至60%的氮是通过生物固氮获得的^[16]。根瘤的形成和发育涉及复杂的调节机制, 其中生长素发挥了必不可少的作用。在苜蓿的感染过程中, 生长素信号传导在根毛中被激活, 生长素响应基因MtARF16a的突变会减少根瘤菌感染^[17]。响应结瘤因子的信号传导, 苜蓿和百脉根在根瘤原基的起始过程中建立了生长素最大值^[18,19,20]。生长素转运抑制剂1-萘氨甲酰苯甲酸(N-1- naphthylphthalamicacid, NPA)或2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-Triiodobenzoic acid, TIBA)的施用会导致苜蓿中形成假瘤^[21,22]。大豆中过量表达生长素生物合成的调节因子GmYUC2a会延迟根瘤器官的发生并使根瘤的数量减少^[23]。苜蓿中生长素流入载体MtLAX2的突变会使根瘤的数量减少^[24]。因此, 多项前期研究均证明生长素通过合成、信号以及极性运输参与根瘤的建成^[25,26]。除生长素外, 其他植物激素在根瘤建成和发育中也发挥着必不可少的作用, 近几年的研究表明植物激素信号通路逐渐成为根瘤共生的重要调节因子^[26]。细胞分裂素和独脚金内酯的局部积累能够促进根瘤的形成^[27,28]。乙烯、茉莉酸、脱落酸和赤霉素均负向调控侵染线的形成和根瘤的发育^[26,29]。油菜素甾醇参与调控根瘤的数目、大小和固氮酶活性^[30]。水杨酸抑制不定型根瘤的形成和发育, 但不抑制定型根瘤的形成发育^[26,30]。此外, 一些肽激素也参与了根瘤的形成^[26]。

拟南芥根中的模型表明, 生长素浓度梯度的建立取决于输出载体PIN蛋白家族的组织分布和在相应根细胞中的极性定位^[31]。除PIN家族蛋白外, 还有一类与PIN蛋白序列具备10%~18%同源性的类PIN (PIN-like)蛋白, 被命名为PILS蛋白, 他们参与调节细胞内的生长素稳态^[32]。PILS于2012年首次在拟南芥中被报道, 与PIN蛋白不同的是, 所有的拟南芥PILS (AtPILS1~AtPILS7)都位于内质网中^[32]。AtPILS2、AtPILS3、AtPILS5和AtPILS6蛋白调控细胞内生长素的积累和结合速率, 进而影响生长素核信号的传导^[32,33,34]。诱导AtPILS2在烟草细胞中的表达可促进生长素的积累; 而atpils2 atpils5双突变的原生质体则表现出明显较高的生长素输出量^[32,35]。与野生型相比, atpils5突变体拟南芥幼苗的游离生长素水平显著升高^[32]。AtPILS不仅有助于细胞内生长素的稳态, 而且通过触发生长素信号转导速率的变化来控制细胞的差异生长^[34]。在顶端弯钩的形成过程中, 诱导过量表达AtPILS2、AtPILS3和AtPILS5造成核内生长素信号减少, 从而消除过量生长素造成的生长抑制^[34]。此外, AtPILS蛋白还能够将环境信号整合到生长过程中^[33]。光感知触发AtPILS2和AtPILS3的表达, 参与顶端钩的形成^[34]; 高温降低了AtPILS6蛋白的丰度, 参与调节根的生长^[33]。

基于以上拟南芥PILS蛋白在拟南芥植物的生长发育过程中的重要作用, 本文旨在阐明大豆的GmPILS对根瘤发育的影响。本研究对大豆GmPILS基因家族进行了全基因组鉴定, 并对GmPILS基因的表达模式、亚细胞定位、组织定位以及基因功能进行了探究, 鉴定了大豆进化产生的19个GmPILS成员。结合实时定量的表达丰度分析以及启动子驱动GUS报告基因的毛状根转化, 我们获得了有可能参与调控大豆根瘤发育的GmPILS1e和GmPILS1f。进而, 毛状根转化沉默GmPILS1e/f显著提升固氮酶活力, 而过量表达GmPILS1f则降低了固氮酶活力。本研究针对大豆GmPILS家族蛋白的初步分析, 希望为获得高效率固氮的大豆品种研究积累有益的基因资源。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

1.1.1 大豆PILS家族基因的鉴定及序列分析

根据TAIR (http://www.arabidopsis.org/)获取拟南芥AtPILS基因序列, 以拟南芥的序列为探针在Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!infoalias=Org_Gmax)大豆基因组(Wm82.a2.v1)进行Blast, 搜索获得E值小于e^-10的相似性序列。将获得的序列(大豆和拟南芥)在InterProscan5 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)在线分析功能结构域的存在情况, 最终确定目标序列。在Phytozome获得序列的转录名称、编码区长度、CDS序列长度、外显子个数。

1.1.2 大豆PILS家族基因染色体定位和基因结构

通过大豆基因组数据库Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)获得GmPILS基因在大豆染色体上的位置信息, 使用TBtools GENE ON Chromosome软件绘制基因的染色体物理分布图。根据大豆PILS基因家族的基因组DNA及CDS序列, 利用在线工具GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制其基因结构图。

1.1.3 大豆、水稻和拟南芥PILS家族基因的同源进化分析 在Phytozome数据库获得大豆GmPILS蛋白质序列和水稻OsPILS蛋白质序列, 在TAIR数据库获取拟南芥AtPILS蛋白序列, 根据MegaX软件采用邻近算法(Neighbor-Joining, Bootstrap检验1000次)构建大豆GmPILS、水稻OsPILS和拟南芥AtPILS蛋白的系统进化树。

1.2 大豆PILS家族基因表达模式分析

根据Phytozome数据库信息获取GmPILS基因在花、叶、根瘤、豆荚、根、根毛、种子、顶端生长点和茎9个组织部位表达量数据(FPKM), 使用GraphPad Prism8绘制大豆GmPILS家族基因表达模式热图。进一步选取大豆三出复叶时期的根、下胚轴、子叶、茎、叶、开花期的花、结荚期的果荚及接种根瘤菌21 d的根瘤共8个组织, 采用TRIzol 试剂(Invitrogen, USA)提取总RNA, 逆转录成cDNA (TransScript One-Step gDNA Removel and cDNA Synthesis SuperMix, TransGen Biotech, China)。以GmELF1b基因(Glyma.02G276600)为内参, 运用实时定量PCR方法(SYBR FAST qPCR Kit, KAPA Biosystems, USA)检测PILS家族基因在8个组织中的相对表达水平。

1.3 植物生长条件

本研究所采用的大豆品种为华春6号, 大豆慢生型根瘤菌菌株为BXYD3, 均由福建农林大学海峡联合研究院根系中心提供; 大豆生长在光照13 h/黑暗11 h, 25℃恒温的温室中。大豆在蛭石中萌发, 在低氮营养液中进行水培发根, 在蛭石中进行土培结瘤。低氮营养液含有500 μmol L^-1氮元素, 包括KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、NH₄NO₃和(NH₄)₂SO₄ (15∶12∶4∶1.5)以及1200 μmol L^-1 CaCl₂、1000 μmol L^-1 K₂SO₄、500 μmol L^-1 MgSO₄∙7H₂O、25 μmol L^-1 MgCl₂、2.5 μmol L^-1 NaB₄O₇∙10H₂O、1.5 μmol L^-1 MnSO₄∙H₂O、1.5 μmol L^-1 ZnSO₄∙7H₂O、0.5 μmol L^-1 CuSO₄∙5H₂O、0.15 μmol L^-1 (NH₄)₆Mo₇O₂₄∙4H₂O、40 μmol L^-1 Fe-Na-EDTA和500 μmol L^-1 KH₂PO₄。

根瘤菌BXYD3使用酵母甘露醇琼脂(YMA)培养基进行培养, 并用于大豆根系接种YMA培养基由10 g L^-1 d-甘露醇、0.2 g L^-1 MgSO₄∙7H₂O、0.1 g L^-1 NaCl、3 g L^-1酵母提取物、0.25 g L^-1 K₂HPO₄和0.25 g L^-1 KH₂PO₄组成。

1.4 启动子: GUS、过表达和amiRNAi (artificial microRNA interference)的克隆

克隆基因所采用的大肠杆菌(E. coli)菌株为DH10B, 大豆毛状根转化所采用的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)为K599。载体构建涉及的质粒为入门载体pDONR221、miRNA前体载体pRS300、带有GUS和dTomato报告基因的终载体pEEF1A-dTomato-GW:GUS (pGWSET)以及带有35S启动子和dTomato报告基因的amiRNAi终载体和过表达载体pEEF1A-dTomato-CaMV35S:GW (pET7WG2)。本研究采用Gateway连接进行载体构建。

使用高保真聚合酶PCR扩增GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1j、GmPILS1i和GmPILS5a编码序列上游的启动子区域(约2000 bp), 并将其克隆到入门载体pDONR221上。经过测序验证正确后, 使用Gateway LR克隆酶II酶混合物将启动子片段克隆到目的载体pGWSET中, 构建获得pEEF1A- dTomato-GmPILSp:GUS重组载体。

使用高保真聚合酶PCR扩增GmPILS1e和GmPILS1f的编码序列, 并将其克隆到入门载体pDONR221上。经过测序验证正确后, 使用Gateway LR克隆酶II酶混合物将基因片段克隆到目的载体pET7WG2中, 构建获得pEEF1A-dTomato- CaMV35S:PILS载体。

采用叶梅霞等^[36]所述方法进行amiRNA的分子设计及其克隆。根据WMD3-Web MicroRNA Designer网站进行amiRNA的预测。根据预测获得的amiRNA信息, 使用高保真聚合酶PCR扩增得到amiRNA前体, 将其克隆到pRS300载体中。进而采用Gateway LR克隆酶II酶混合物将amiRNA前体克隆到目的载体pET7WG2中, 以获得pEEF1A- dTomato-CaMV35S:PILS-amiRNA载体。

1.5 毛状根转化和土培结瘤试验

本文采用发根农杆菌K599对大豆进行毛状根复合植株的转化^[37]。方法简述如下: 选用萌发4 d的大豆进行毛根转化, 侵染完成后将植株置于低氮营养液中进行培养。培养14~20 d, 毛状根长至5~ 10 cm时方可剪掉植株主根并进行阳性根的筛选。本研究所使用的终载体pGWSET和pET7WG2中带有pEEF1A-dTomato原件, 筛选阳性根时使用LUYOR-3415激发光源对毛状根进行绿光照射, 透过LUV-50A红色眼镜可观察到阳性毛状根发出的红色荧光, 然后将没有红色荧光的毛状根去除即可。将完成筛选的植株放置于低氮营养液中恢复生长5 d, 之后将植株转移至蛭石中培养2 d进行根瘤菌接种(根瘤菌20 mL悬浮液, OD值为0.05)。

植株接种根瘤菌后第9天、第14天和第21天, 进行根瘤取样, 进而通过GUS染色分析GmPILS在根瘤中的组织定位。植株接种根瘤菌后第21天, 分析GmPILS-RNAi和35S::GmPILS的结瘤表型。

1.6 亚细胞定位和组织定位分析

使用黄定全等^[38]所述方法进行烟草叶片转化。将GmPILS1e或GmPILS1f的全长编码序列克隆到pCaMV35S:GW:GFP载体和pCaMV35S:GFP:GW 载体中, 然后使用烟草叶片进行pro35S:GFP-GmPILS 或pro35S:GmPILS-GFP和pro35S:HDEL-Tdtoamto (作为内质网定位标记)混合菌液的共转化。使用Leica TCS SP8X激光共聚焦显微镜在GFP和HDEL-Tdtoamto的激发和发射波长下检测荧光。激发和检测设置为: GFP, 488 nm, 505~550 nm; HDEL- Tdtomato, 561 nm, 590~760 nm。用于烟草转化的农杆菌为GV3101。使用ImageJ进行信号强度的统计。

使用5%的琼脂糖凝胶进行根瘤包埋, 使用振荡切片机对包埋的样品进行切片, 切片厚度为80 μm。GUS染色液(0.1 mol L^-1 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ buffer, pH 7.0, 1 mmol L^-1 X-Gluc)进行染色3~12 h, 75%乙醇脱色, 透明液(30 mL水, 80 g水合氯醛, 10 mL 100%甘油)制片, NI-U研究级正置显微镜(DIC)采集图片。

1.7 基因定量表达分析

提取生长21 d的根瘤RNA (TransZol Up Plus RNA Kit), 并逆转录成cDNA (NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge), Novoprotein, China)。以GmELF1b基因(Glyma.02G276600)为内参, 运用实时定量PCR 方法(CFX96 Touch实时定量PCR系统, Bio-Rad, USA)检测基因的表达水平。

1.8 固氮酶活性检测

采用乙炔还原法^[39]测定根瘤固氮酶活性 。将根瘤分别收集到8 mL的玻璃瓶中进行密封, 吸出1 mL空气后, 注入1 mL乙炔密封反应2 h, 采用0.5 mol L^-1 NaOH终止反应。随后, 使用带火焰离子化检测器的气相色谱仪(GC-2014AF)测量0.3 mL反应气体, 以计算反应体系中根瘤被固氮酶催化的乙炔量^[40]。

1.9 统计分析

使用Microsoft Excel 2019对数据进行整理, 使用GraphPad Prism 8对数据分析和作图, 采用独立样本t检验进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 GmPILS基因的鉴定和生物信息学分析

在大豆全基因组中共鉴定获得19个PILS家族成员基因, 通过与拟南芥同源基因比对, 我们将这19个基因分别命名为GmPILS1a~GmPILS1l、GmPILS2a、GmPILS2b、GmPILS5a~GmPILS5c、GmPILS6a以及GmPILS6b。其中, GmPILS1d的氨基酸长度最短, 仅259个氨基酸; 而GmPILS2b最长, 有445个氨基酸(表1)。GmPILS的基因组结构显示, GmPILS1f含有最多数量的内含子为11个, 而GmPILS2a和GmPILS2b含有最少数量的内含子, 仅1个。GmPILS1c、GmPILS1b、GmPILS1k、GmPILS6a、GmPILS6b、GmPILS1i、GmPILS5b、GmPILS5a和GmPILS1g各含10个内含子, GmPILS1j、GmPILS1e、GmPILS5c、GmPILS1l各含9个内含子, GmPILS1d有8个内含子, GmPILS1a和GmPILS1h各含6个内含子(图1)。

Table 1
表1
表1GmPILS基因家族基本信息
Table 1Basic information of GmPILS gene family

基因名称 Gene name	基因ID Gene ID	氨基酸数量 No. of amino acids	内含子数量 No. of introns	5'-3'坐标 5'-3' corrdinates
GmPILS1a	Glyma.10G189100	313	6	Chr10: 42227422-42231792
GmPILS1b	Glyma.20G201600	400	10	Chr20: 43857079-43862374
GmPILS1c	Glyma.10G189000	400	10	Chr10: 42220046-42225237
GmPILS1d	Glyma.20G201700	259	8	Chr20: 43863679-43868413
GmPILS1e	Glyma.07G113100	418	9	Chr07: 11724201-11741130
GmPILS1f	Glyma.07G113200	418	11	Chr07: 11780634-11792223
GmPILS1g	Glyma.03G113600	424	10	Chr03: 32066847-32080424
GmPILS1h	Glyma.16G114900	297	6	Chr16: 25456379-25485759
GmPILS1i	Glyma.11G088600	415	10	Chr11: 6695030-6700783
GmPILS1j	Glyma.01G156200	415	9	Chr01: 49361352-49366442
GmPILS1k	Glyma.09G195600	414	10	Chr09: 42022526-42029030
GmPILS1l	Glyma.16G115500	414	9	Chr16: 25622503-25630816
GmPILS2a	Glyma.09G116100	440	1	Chr09: 26549730-26551878
GmPILS2b	Glyma.19G072900	445	1	Chr19: 26101897-26103958
GmPILS5a	Glyma.11G087300	419	10	Chr11: 6547702-6555660
GmPILS5b	Glyma.01G157700	419	10	Chr01: 49570825-49577993
GmPILS5c	Glyma.09G196900	409	9	Chr09: 42160775-42168544
GmPILS6a	Glyma.09G271100	414	10	Chr09: 48791789-48796501
GmPILS6b	Glyma.18G218300	414	10	Chr18: 50525980-50531206

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图1

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图1GmPILS基因家族的基因结构

黄色框代表外显子, 黑色线条代表不同GmPILS基因的内含子。
Fig. 1Gene structures of GmPILS gene family The yellow boxes represent the exons and black lines represent the introns of different GmPILS genes.



通过Phytozome数据库获得大豆GmPILS基因家族染色体定位信息, 本研究将大豆中的19个GmPILS成员分别定位在大豆染色体组的10条染色体上(图2): GmPILS1j和GmPILS5b分布在1号染色体上, GmPILS1g分布在3号染色体上, GmPILS1e和GmPILS1f分布在7号染色体上, GmPILS2a、GmPILS1k、GmPILS5c和GmPILS6a均分布在9号染色体上, GmPILS1c和GmPILS1a分布在10号染色体上, GmPILS5a和GmPILS1i分布在11号染色体上, GmPILS1i和GmPILS1h分布在16号染色体上, GmPILS6b分布在18号染色体上, GmPILS2b分布在19号染色体上, GmPILS1b和GmPILS1d分布在20号染色体上。说明, 大豆GmPILS基因家族的19个成员在染色体上的分布是不均匀的, 其中有12个GmPILS基因两两分别分布6条染色体上, 有4个基因均分布在一条染色体上, 而另外3个基因则单独分布在3条染色体上。染色体定位的数据暗示了串联复制和染色体片段复制事件在GmPILS家族基因进化过程中发挥了重要功能。

图2

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图2GmPILS基因在大豆染色体中的分布

Fig. 2Distribution of GmPILS genes on soybean chromosomes

2.2 GmPILS的系统发育分析

为研究大豆、拟南芥以及水稻基因组中PILS之间的进化关系, 本研究针对大豆的19个GmPILS、拟南芥的7个AtPILS、水稻的7个OsPILS蛋白的氨基酸序列构建了系统发育树(图3)。结果表明, PILS蛋白分为3个不同的亚枝。其中, GmPILS1、AtPILS1/3/4和OsPILS1分为一个亚枝, GmPILS5、AtPILS7和OsPILS7分为一个亚枝, GmPILS2、AtPILS2、OsPILS2、GmPILS6、AtPILS6和OsPILS6分为一个亚枝。由于大豆中GmPILS家族基因的功能是未知的, 而拟南芥和水稻中PILS家族基因研究的比较深入, 因此, 将拟南芥和水稻的PILS家族基因和大豆GmPILS家族基因进行同源分析, 能为大豆PILS家族基因功能研究提供指导。例如, 在拟南芥中AtPILS6是核生长素输入和器官生长的温度敏感调控因子, 高温会降低AtPILS6蛋白的丰度, 从而增加了核生长素信号和根的生长^[33]。这暗示着GmPILS6可能也参与了大豆对外界温度的感应过程。

图3

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图3GmPILS、AtPILS和OsPILS蛋白序列的系统进化树

Fig. 3Phylogenetic tree of GmPILS, AtPILS, and OsPILS proteins

2.3 GmPILS基因组织表达模式分析

利用Phytozome 数据库中GmPILS基因的组织表达量数据(FPKM), 对GmPILS基因在花、叶、根瘤、豆荚、根、根毛、种子、顶端生长点、茎等9个组织部位的表达模式进行分析(图4-A)。结果表明, GmPILS基因具有明显的组织富集特异性, 其中GmPILS1e和GmPILS1f主要在根瘤和根毛中表达, GmPILS1h主要在主要在花和果荚中表达, GmPILS5a和GmPILS5b主要在花和根中表达。此外,

GmPILS基因在表达丰度上也存在显著差异, 其中11个基因具有较高丰度的表达, 其余8个基因表达丰度较低。同源基因具有相似的表达趋势, GmPILS1e和GmPILS1f、GmPILS1i和GmPILS1j、GmPILS5a和GmPILS5b这些同源基因在表达丰度和不同组织部位的表达量上趋于一致。

此外, 本研究挑选了GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1i、GmPILS1j和GmPILS5a的表达模式结果进行qPCR验证(图4-B)。结果表明, GmPILS1e和GmPILS1f主要在根瘤中高表达, GmPILS1i和GmPILS1j在根、下胚轴、子叶、茎、叶、花、果荚以及根瘤中均有不同丰度的表达, GmPILS5a在花中有较高丰度的表达。验证结果基本与Phytozome网站所获得数据一致, 部分结果不同可能时由于取样时期不同所导致。在大豆的各个组织器官中, 不同的GmPILS成员在不同的器官中的时空表达差异暗示了GmPILS可能参与多个组织器官的调控, 影响整个植株的生长。尤其是GmPILS1亚家族多个成员, 包括GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1i、GmPILS1j在根瘤中的富集表达, 暗示其可能参与根瘤的发育及生长素的稳态维持。

图4

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图4GmPILS基因组织表达模式

A: GmPILS基因组织表达模式热图, 从Phytozome数据库中获取GmPILS表达量数据(FPKM)。B: GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1i、GmPILS1j和GmPILS5a基因组织表达模式热图, GmPILS表达量数据来自qPCP结果。方框内颜色显示大豆PILS基因表达水平。
Fig. 4Relative expression pattern of GmPILSs genes

A: the heat map of tissue expression pattern of GmPILS genes, and FPKM is obtained from Phytozome database. B: GmPILS1e, GmPILS1f, GmPILS1i, GmPILS1j, and GmPILS5a gene tissue expression pattern in heat map; GmPILSs expression data comes from qPCP results. Colors in square represent the expression levels of GmPILSs.

2.4 GmPILS基因在根瘤中的组织定位

为探究GmPILS在大豆结瘤过程中的功能, 本研究根据以上获得的在根和根瘤中表达水平较高的GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1i、GmPILS1j和GmPILS5a的上游启动子2 kb区域构建了pGmPILS-GUS载体, 并进行毛根转化。获得的阳性毛根组织染色显示, GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤的菌体中的表达水平较高, GmPILS1i和GmPILS1j富集在根瘤菌体外围的皮层区域, GmPILS5a在根瘤中表达量相对较弱。根瘤中的组织染色的结论(图5)与上述的基因表达检测结果均一致性的显示GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤中的高水平富集, 因此我们选择了GmPILS1e和GmPILS1f作为后续主要的研究对象。

图5

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图5GmPILS1e、GmPILS1f、GmPILS1i、GmPILS1j和GmPILS5a在根瘤中的组织化学定位

从左到右分别对应根瘤发育的起始、扩张发育和成熟阶段。标尺为200 µm。
Fig. 5Histochemical localization of GmPILS1e, GmPILS1f, GmPILS1i, GmPILS1j, and GmPILS5a in nodule

The figures from left to right are referred to the initiation, expansion, and maturity stages of nodules development. Bar: 200 µm.

2.5 GmPILS蛋白的亚细胞定位分析

在拟南芥中, 所有的AtPILS蛋白均定位在内质网上。为探究GmPILS蛋白的亚细胞定位, 我们使用烟草叶片进行pro35S:GFP-GmPILS或pro35S: GmPILS-GFP 和pro35S:HDEL-Tdtoamto (作为内质网定位标记)混合菌液的共转化, 之后使用Leica TCS SP8X激光共聚焦显微镜在GFP和HDEL-Tdtoamto的激发和发射波长下检测荧光(图6)。表明GmPILS1e和GmPILS1f均为内质网定位。这也侧面表明了PILS在进化过程中基因功能保守性较高。

图6

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图6GmPILS1e和GmPILS1f的亚细胞定位

A~D: 使用烟草叶片进行pro35S:GFP-GmPILS (绿色)或pro35S:GmPILS-GFP (绿色)和pro35S:HDEL-Tdtoamto (红色, 作为内质网定位标记)混合菌液的共转化。基于白色斜线生成了共定位信号轮廓图。标尺为10 μm。
Fig. 6Subcellular localization of GmPILS1e and GmPILS1f

A-D: tobacco leaves were used for co-transformation of the mixed bacterial broth of pro35S:GFP-GmPILS (green) or pro35S:GmPILS-GFP (green) and pro35S:HDEL-Tdtoamto (red, as an endoplasmic reticulum localization marker). The co-localization signal profile chart is generated based on the white slash. Bar: 10 μm.

2.6 GmPILS1e和GmPILS1f参与大豆根瘤的固氮酶活性调控

为进一步探究GmPILS1e和GmPILS1f是否参与大豆根瘤的发育或是活性调控, 我们构建了同时沉默GmPILS1e和GmPILS1f的amiRNA载体, 试图将菌体中的富集的GmPILS表达水平降低。

根据WMD3-Web MicroRNA Designer预测的amiRNA, 本研究分别设计了2个独立沉默GmPILS1e和GmPILS1f的amiRNA: GmPILS1e-amiRNA1、GmPILS1e-amiRNA2、GmPILS1f-amiRNA1和GmPILS1f- amiRNA2, 并进行毛状根混菌转化。通过阳性毛状根筛选并结瘤21 d后, 基因表达检测结论显示, 我们获得了同时沉默GmPILS1e和GmPILS1f的阳性根瘤GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2。与对照组pEEF1A-dTomato-CaMV35S:GUS载体产生的毛状根结瘤后的PILS基因表达水平相比, GmPILS1e和GmPILS1e在GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi #2中分别下调19.5%、52.2%、22.7%和38.2% (图7-B)。

图7

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图7GmPILS1e和GmPILS1f参与大豆根瘤的固氮酶活性调控

A~G: 在接种根瘤菌21 d 后, 对结瘤的大豆复合植株进行表型分析。A: Mock、GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2毛根根瘤对半横切的拍照结果, 标尺为200 µm。B: 利用荧光定量PCR检测Mock、GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2毛根根瘤的表达, 以GmELF1b基因作为内参基因。C, D: 检测相同重量Mock、GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2毛根根瘤的固氮酶活性。E: 统计Mock, GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2毛根根瘤横切的菌体区域的面积占比。F: 利用荧光定量PCR检测Mock和35S::GmPILS1f 毛根根瘤的表达, 以GmELF1b基因作为内参基因。G: 检测Mock和35S::GmPILS1f 毛根根瘤的固氮酶活性。*、**、***分别表示在0.05、0.01和0.001水平差异显著; ns: 无显著性差异。
Fig. 7GmPILS1e and GmPILS1f were involved in the regulation of nitrogenase activity in soybean nodules

A-G: phenotype analysis was performed on soybean complex plants after inoculation of rhizobia for 21 days. A: mock, GmPILS1e 1f-RNAi#1 and GmPILS1e 1f-RNAi#2 nodules by semi-crosscutting, bar: 200 µm. B: RT-qPCR analysis of GmPILS1e or GmPILS1f in mock, GmPILS1e 1f-RNAi#1 and GmPILS1e 1f-RNAi#2 nodules, with GmELF1b gene as the internal reference gene. C, D: test the nitrogenase activity of mock, GmPILS1e 1f-RNAi#1 and GmPILS1e 1f-RNAi#2 nodules of the same weight. E: statistic mock, GmPILS1e 1f-RNAi#1 and GmPILS1e 1f-RNAi#2. F: RT-qPCR analysis of GmPILS1f in Mock and 35S::GmPILS1f nodules, with GmELF1b gene as the internal reference gene. G: test the nitrogenase activity of mock and 35S::GmPILS1f nodules. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, 0.001 probability levels, respectively. ns: no significant difference.


为确定GmPILS1e和GmPILS1f对根瘤固氮能力的影响, 我们检测了GmPILS1e 1f-RNAi#1、GmPILS1e 1f-RNAi#2以及对照中相同重量根瘤的固氮酶活性和菌体发育形态。结果表明, 下调GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤中的表达并不会对根瘤的菌体区域的体积占比产生影响(图7-E)。然而, 与对照相比, GmPILS1e 1f-RNAi#1和GmPILS1e 1f-RNAi#2根瘤的固氮酶活性分别显著性上调18%和20% (图7-C)。因此, GmPILS1e和GmPILS1f参与了大豆根瘤的固氮酶活性调控。

为进一步明确上述结论, 我们同时构建了过量表达GmPILS1f的载体并进行了毛状根转化。与对照组pEEF1A-dTomato-CaMV35S:GUS载体产生的毛状根结瘤后的GmPILS1f基因表达水平相比, GmPILS1f在35S::GmPILS1f中上调了3倍(图7-F)。表明, 35S::GmPILS1f根瘤的固氮酶活性较对照显著降低41% (图7-G)。

3 讨论

生长素(吲哚-3-乙酸)是植物中发现的最为重要的植物激素之一, 在植物生长调节中具有关键的作用^[41,42,43]。具体来说, 生长素通过在特定细胞中的积累、消耗以及极性运输, 参与器官的极性建立和发育^[44]。生长素在植物中的相互作用和协调运输依赖于其精细的调控网络, 这些网络协助植物响应多种环境和发育变化^[45,46]。生长素的分布及其在不同植物组织中的差异积累是根据细胞内源性信号传导级联反应以及细胞间极性运输而产生的^[43,47-48]。其中多种转运蛋白包括生长素的输入和输出载体蛋白协同维持不同器官和组织内部及其之间的定向生长素流动。因此, 植物通过容纳最大数量的植物生长素转运蛋白来扩大其最佳功能^[49,50]。PILS蛋白是在蛋白序列上与生长素输出PIN蛋白具有一定的相似性^[32]。然而, PILS蛋白定位于内质网上, 协助调节的细胞内生长素稳态, 并随后影响细胞核内的生长素信号传导^[35]。目前, PILS的研究尚浅, 主要集中在拟南芥和水稻中^[1,44], 大豆GmPILS的研究尚属空白。本研究对大豆GmPILS进行了全基因组鉴定, 共鉴定到19个PILS家族成员基因, 并对GmPILS基因结构和染色体定位信息进行了分析。染色体定位数据揭示了串联复制和染色体片段复制事件在GmPILS家族基因进化过程中发挥了重要功能。此外, 与拟南芥的AtPILS一致, GmPILS蛋白定位于内质网中, 很可能参与了类似拟南芥中AtPILS蛋白的功能。

针对于大豆独特的根瘤器官, 我们鉴定获得了在根瘤菌体中高丰度的GmPILS1e和GmPILS1f。使用amiRNAi降低GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤中的表达水平会导致根瘤的固氮酶活性上升, 过量表达GmPILS1f会导致根瘤的固氮酶活性降低。因此我们提出GmPILS1e和GmPILS1f可能参与了大豆根瘤共生固氮的调控。之前的研究表明, 吲哚-3-乙酸(IAA)可通过增加与根瘤中类菌体活性直接相关的酶和代谢物的活性来增强N₂固定^[51]。与未处理的植物相比, 用1×10^-8 mol L^-1外源IAA处理的绿豆在播种后45 d, 固氮酶和豆血红蛋白含量增加了32%和45% ^[52]。测定接种野生型根瘤菌和能够产生过量IAA根瘤菌的大豆根瘤的乙炔还原活性结果表明, 根瘤产生的固氮酶和豆血红蛋白越多, 根瘤的固氮能力就越强^[53]。同样, 植物接种能产生IAA的根瘤菌时, 根瘤中的固氮酶活性和豆血红蛋白合成会增加^[54,55]。此外, IAA能够通过增加根瘤内类菌体的活力来促进有效根瘤的形成并延缓根瘤的衰老^[51]。使用产生IAA的根瘤菌接种木豆、大豆和黄羽扇豆, 能够增加有效根瘤的数目^[56,57,58]。产生IAA的根瘤菌诱导的有效根瘤拥有类菌体具有更高IAA浓度、根瘤更大、固氮酶活性更高和衰老延缓的特点^[51,59]。再者, 在豆科植物与根瘤菌的相互作用中, 根瘤菌产生的IAA会触发与共生密切相关的基因的表达^[51]。与野生型菌株相比, 能够过量生产IAA的菌株诱导的有效根瘤中, N₂固定相关基因的表达和固氮酶的活性显着增加^[60,61]。因此, GmPILS1e和GmPILS1f蛋白有可能参与调控菌体发育过程中类菌体的生长素含量和生长素核信号的传导, 进而调控与共生密切相关的基因的表达、与类菌体活性直接相关的酶和代谢物的活性以及类菌体的活力, 但这些还需要进一步的验证。

4 结论

本研究中共在大豆基因组中鉴定获得了19个PILS同源基因(GmPILS), 由于基因进化和染色体复制事件, GmPILS不均匀的分布于大豆的10条染色体上, 不同的GmPILS在大豆的不同组织部位表现出组织表达特异性。其中GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤菌体区域的富集水平较高的, 使用amiRNAi下调了GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤中的表达导致根瘤的固氮酶活性上升, 而过量表达GmPILS1f导致根瘤的固氮酶活性下降。本研究初步鉴定了GmPILS家族的同源基因, 并提出了根瘤中富集表达的GmPILS1e和GmPILS1f有可能参与大豆固氮酶活性的调节, 为进一步解析生长素稳态参与共生固氮的机制奠定了基础, 并为结瘤固氮在农业育种中的应用提供了有价值的基因资源。

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