王渭霞^,, 赖凤香, 胡海燕, 何佳春, 魏琪, 万品俊, 傅强^,*中国水稻研究所, 浙江杭州 310006

Effect of 11-year storage of GMO reference material at ultra-low temperature on nucleic acid detection of standard matrix sample of transgenic crop

WANG Wei-Xia^,, LAI Feng-Xiang, HU Hai-Yan, HE Jia-Chun, WEI Qi, WAN Pin-Jun, FU Qiang^,*China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, Zhejiang, China

通讯作者: *傅强, E-mail:fuqiang@caas.cn

收稿日期:2021-01-12接受日期:2021-06-18网络出版日期:2021-07-19

基金资助:

中国农业科学院科技创新工程“水稻病虫草害防控技术科研团队”(CAAS-ASTIP-2016-CNRRI) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2017RG005)

Corresponding authors: *E-mail:fuqiang@caas.cn
Received:2021-01-12Accepted:2021-06-18Published online:2021-07-19

Fund supported:

Rice Pest Management Research Group of the Agricultural Science and Technology Innovation Program of China Academy of Agricultural Science(CAAS-ASTIP-2016-CNRRI) Fundamental Research Funds for Central Public Welfare Research Institute(2017RG005)

作者简介 About authors
E-mail:wangweixia@caas.cn



摘要
标准物质是转基因检测结果可靠性、可比性以及准确性的重要参比, 不可缺少。本文研究了植物转基因成分检测中基体标准物质的长期保存对PCR检出及低含量标准物质量值稳定性的影响。应用普通定性PCR、实时荧光PCR和微滴式数字PCR 3种方法, 对不同含量转基因标准物质和转基因检测样品进行了复现性和量值稳定检测。结果表明, -70~ -75℃保存条件下, 9年保存期的转基因含量为0.1%的单一作物转化体标准物质中依然能得到清晰的转化体目标片段扩增, 且Ct值在36左右。数字PCR定值结果表明, 9年保存期的转基因基体标准物质的量值保持稳定。11年保存期的大豆、玉米、水稻的混合基体样品中各转基因元件均能稳定检出。研究结果表明转基因基体标准物质的长期低温保存不会影响其各转基因元件的检出和作为转基因核酸检测阳性对照的应用。
关键词： 转基因生物;基体标准物质;转基因植物检测;标准物质保存

Abstract
Reference material is indispensable for the reliability, comparability, and accuracy of transgenic detection results. In this paper, the effects of long-term preservation of matrix reference materials on PCR detection and the stability of low content reference materials were studied. The reproducibility and quantity stability of transgenic reference materials and transgenic samples with different contents were detected by three methods (common qualitative PCR, real-time fluorescent PCR, and droplet digital PCR). The result showed that the transgenic reference material with 0.1% GM content could still be clearly amplified after 9 years of storage, and the Ct value was about 36. The digital PCR revealed that the quantity of GM matrix reference materials remained stable for long storage time. There was no effect on the detection of transgenic elements in sample mixed with soybean, corn and rice powder which stored at -70 to -75℃ for 11 years. In summary, the long-term storage of GM matrix reference materials at low temperature would not affect the detection of each transgenic component and its application as a positive control for transgenic nucleic acid detection.
Keywords：genetically modified organism (GMO);matrix reference material;detection of transgenic plants;reference material storage


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王渭霞, 赖凤香, 胡海燕, 何佳春, 魏琪, 万品俊, 傅强. 超低温11年保存期对转基因作物基体标准样品核酸检测的影响. 作物学报, 2022, 48(1): 238-248 DOI:10.3724/SP.J.1006.2022.12001
WANG Wei-Xia, LAI Feng-Xiang, HU Hai-Yan, HE Jia-Chun, WEI Qi, WAN Pin-Jun, FU Qiang. Effect of 11-year storage of GMO reference material at ultra-low temperature on nucleic acid detection of standard matrix sample of transgenic crop. Acta Agronomica Sinica, 2022, 48(1): 238-248 DOI:10.3724/SP.J.1006.2022.12001


随着全球转基因作物的种植面积不断扩大, 转基因检测也受到越来越多的关注。转基因产品的成分检测是转基因安全管理和标识的重要技术支撑, 而转基因生物标准物质(GMO Reference Material)是获得准确、可靠、具有可比性检测结果的保障。在JJF 1005-2016《标准物质通用术语和定义》中, 标准物质定义为具有足够均匀和稳定的特定特性的物质, 该特性的建立适合于其在测量或标称特性检查中的预期用途, 均一性、稳定性和量值准确性是标准物质的“三性” ^[1]。转基因标准物质属于生物类标准物质, 是在转基因产品检测中用以校准测量装置、评价生物测量方法或给生物测量材料赋值的一种材料或物质^[2]。其特定特性包括含量、序列、活性、结构等。含量以含转基因样品的重量与样品总重量百分比、或含转基因靶序列拷贝数与单倍体基因组拷贝数比表示。目前国内外生产转基因成分检测标准物质的有证机构主要为欧盟委员会联合研究中心及下设的组织欧盟标准物质与测量研究院(IRMM)、美国油脂化学协会、日本国立食品综合研究所和墨西哥国家计量院^[3]。我国在标准物质研究方面也开展了一些工作, 制备了少量用于转基因生物检测的工作标样。

常用的转基因检测方法有核酸检测和蛋白检测2类。核酸在生物细胞中含量相对稳定, 不容易被破坏, 且核酸检测方法灵敏度高、操作简便, 因此成为转基因检测的主流方法^[4]。核酸类转基因检测所涉及的标准物质主要包括3种形式: 基体标准物质(matrix reference material)、基因组DNA标准物质(genomic DNA reference material)、质粒DNA标准物质(plasmid DNA reference material)^[2,5]。其中, 基体标准物质是利用植物种子研磨制备形成的标准物质, 在检测工作中由于具有和待检样品实质等同性, 更接近转基因检测过程中实际样品的状态, 能减少基体效应带来的检测误差, 加之在定量PCR检测中不需要量值转换等优点, 故更易被检测人员所接受^[6]。

基体标准物质原材料获得、复制难度较大, 研制过程复杂, 技术要求高, 主要包括候选物品种纯度鉴定、冷冻干燥、研磨筛分、标准物质均匀性研究、标准物质定值和不确定度评价等研究, 整个过程耗资巨大^[7,8]。目前, 市面上用于制备转基因产品检测基体标准物质的候选物价格为每克粉末800~1000元。关于基体标准物质保存条件和有效期的确定依据, 主要根据为: (1) 基体样品的短期(8周以内)稳定性测试(温度范围为-20~60℃)确认基体标准物质可在常温下运输; (2) 长期(24月以内)稳定性测试(选用温度20℃, 4℃和-20℃)确认样品在4℃或-20℃存放24个月转基因含量未发生显著变化^[9,10,11]。由此将基体标准物质的有效期定为-20℃存放2年。为了应对市场上多种商业化转化体检测方法的研究、监管检测、检测标准方法验证等需求, 检测机构需要储备尽可能多的转化体标准物质。对于一些极少用到的标准物质, 就会出现在标注的有效期内使用量远少于其最少包装量, 造成了标准物质的浪费。超过有效期的长期保存对标准物质稳定性和特性量值的影响尚不清楚。Bainard等^[12]的研究显示对于植物新鲜材料的比较短期(15周)保存, 低于-70℃的保存条件有利于样品DNA的量值稳定。基体标准物质的低温保存是延长有效期的最主要方法。

目前常用的转基因核酸检测方法主要是针对外源通用转基因元件、目的基因和构建载体特异序列以及转化事件特异序列进行的普通PCR定性分析, 实时荧光PCR定性分析, 实时荧光PCR定量分析和数字PCR定量检测^[13]。数字PCR技术(digatal PCR)不需要制作标准曲线, 对低含量样品定值准确度高, 近年来在转基因标准物质的定值等方面的应用快速发展, 主要有微孔板、微流控芯片和微滴式数字PCR技术^[14]。

本文利用普通PCR、实时荧光PCR以及微滴式数字PCR 3种方法, 报告了在低于-70℃的保存条件下基体标准物质的长期保存对其特征量值, 包括转基因元件、转化体身份和转基因含量的影响。研究利用2011年购买的保存9年的单一物种的转基因基体标准物质(其转基因含量最低为0.1%)为研究材料, 研究了长期低温保存对基因组DNA提取质量的影响和对含量0.1%的转基因基体标准物质相应转化体的普通定性和荧光定性PCR检测的影响; 利用微滴式数字PCR方法检测长期保存长达9年的标准物质转基因含量值的变化; 利用2009—2018年期间参加农业农村部组织的转基因检测能力比对测试中留存的混合作物基体样品, 开展了样品长期保存(最长11年)对各转基因元件检出性的影响。研究结果表明长期低温(-70 ~ -75℃)的保存对转基因基体标准物质各转基因元件稳定检出和转基因含量值没有影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因检测验证样品为实验室从2009年起留存的参加农业农村部科技发展中心组织的能力验证样品共计10份(S1~S10), 具体信息见表1; 已知不同含量的转基因基体标准物质为2011年4月购自IRMM的13份(包括转基因含量为0.1%的转基因玉米Bt11、Bt176、MON863、TC1507、MIR604、59122和转基因棉花GBH119, 转基因含量分别为0.1%、0.5%和1.0%的转基因玉米MON810和转基因大豆GTS40-3-2和2012年国家标准物质中心提供验证的2份转基因水稻标准物质G6H1 (0.1%)和科丰6号(5.0%)。玉米、大豆和水稻相应非转基因种子样品作为阴性对照, 来自本实验室2020年收集自备。样品持续存放在-70 ~ -75℃的超低温冰箱内。阳性对照为2018年和2019年购自农业部科技发展发中心的转基因含量为1.0%的基体标准样品提取的DNA溶液, DNA溶液提取于购买当年并分装存放于-20 ~ -25℃冰箱内。由上海尚亚生物技术有限公司合成PCR扩增引物和探针。

Table 1
表1
表1留存的参加能力证的混合作物样品的转基因参数信息和推荐用标准
Table 1Information of transgenic detection parameters and recommended standards of the retained mixed crop samples

样品编号 Sample ID	起存时间 Start date	存期 Storage	阳性转基因元件及检测参考标准 Positive transgenic elements and references
S1	2018/10	2年 2 years	CaMV 35S[15], FMV 35S[15], bar/pat[16]
S2	2018/10	2年 2 years	CaMV 35S, FMV 35S, NOS[15], HPT[17], bar/pat, Bt[18]
S3	2017/10	3年 3 years	CaMV 35S, FMV 35S, NOS, HPT, bar/pat, Bt, CP4-EPSPS[19]
S4	2017/10	3年 3 years	CaMV 35S, FMV 35S, NOS, bar/pat, Bt, HPT, CP4-EPSPS, NK603[20], TT51-1[21]
S5	2015/10	5年 5 years	CaMV 35S, FMV 35S, NOS, CP4-EPSPS
S6	2015/10	5年 5 years	CaMV 35S, NOS, bar/pat, CP4-EPSPS
S7	2014/10	6年 6 years	CaMV 35S, FMV 35S, NOS, bar/pat, TT51-1, GT73[22], MS8[23], Bt11[24], MON810[25]
S8	2014/10	6年 6 years	FMV 35S, T-NOS, bar/pat, MS8, GT73, TT51-1
S9	2009/10	11年 11 years	CaMV 35S, T-NOS, CP4-EPSPS, GTS40-3-2[26], MON863[27]
S10	2009/10	11年 11 years	CaMV 35S, T-NOS, Bt, HPT, T-CaMV 35S, MON863

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1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取和浓度测定 利用植物基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取测试样品基因组DNA, 具体步骤依据试剂盒说明书。用微量分光光度计Nanovue Plus (General Electric Company, 英国)测定DNA质量。当A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7~1.9之间时, 浓度调整为20~60 mg L^-1时用于后续PCR反应检测。以不加任何材料的空白作为DNA提取空白对照。

1.2.2 普通定性PCR检测 每个样品提取DNA一份, PCR检测重复3次。对于转基因含量0.1%的标准物质(包括大豆、玉米、水稻和棉花)每份DNA重复6次PCR扩增。以转基因质量分数为1.0%的样品材料提取的DNA作为阳性对照, 以非转基因的植物材料提取的DNA为阴性对照, 以水作为PCR空白对照。各转化体检测依据相应转化体检测标准^{[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]}。PCR扩增酶为TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (北京全式金生物技术有限公司)。PCR反应结束后, 用2.0%琼脂糖胶电泳、溴化乙锭(EB)染色, 用凝胶成像分析系统GelDoc XR (Bio-Rad Laboratories, Inc., 美国)成像检测并照相。

1.2.3 实时荧光定性PCR检测 对转基因含量0.1%的标准物质同时利用实时荧光PCR的方法, 进行转化体特异性扩增检测。重复9次。荧光定量PCR扩增用预混液为FastStart Universal Probe Master (Roche Diagnostics GmbH, 德国)。转基因水稻G6H1转化体的实时荧光定性PCR检测参照缪青梅等^[34], 其余各转化体检测依据标准GB/T19495.4-2018 ^[35]。

1.2.4 微滴式数字PCR检测 标准物质转基因水稻科丰6号的定量检测依据数字PCR检测标准SN/T 4853.3- 2017 ^[36], 转基因棉花GBH119、转基因玉米MON810和转基因大豆GTS40-3-2的定量检测依据标准GB/T 38132- 2019 ^[37]。其中, 科丰6号和GHB119的检测采用单重微滴式数字PCR扩增, GTS40-3-2和MON810采用双重微滴式数字PCR进行扩增。转基因标准物质转化体的百分含量(%) = 转化体拷贝数/内源基因拷贝数×100。检测结果的精确性以定量误差(Bias)表示, 定量误差为测定值与理论值的偏差, 在偏差和检测相对标准差(RSD%)不超过25%范围则判定样品保存符合量值检测要求。

2 结果与分析

2.1 长期低温保存对单一作物基体标准物质的影响

2.1.1 对基因组DNA提取率和完整度的影响 利用植物基因组DNA提取试剂盒, 提取低温保存8~9年的转基因基体标准物质和实验室2020年当年保存的非转基因玉米、大豆和水稻种子样品的DNA。所有样品DNA的A₂₆₀/A₂₈₀均在1.7~2.0之间, 存放8年和当年的水稻基因组得率分别为82.3 mg g^-1和79.4 mg g^-1, 存放9年和当年的玉米基因组得率分别为36.0~43.2 mg g^-1和41.8 mg g^-1, 存放8年的和当年的大豆基因组得率分别为126.9 mg g^-1和107.4 mg g^-1。总基因组电泳结果显示, DNA条带紧密, 未表现弥散的降解条带(图1)。低温多年的保存对提取的植物基因组DNA质量没有影响。

图1

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图1单一作物基体标准物质中提取的基因组DNA琼脂糖胶电泳

M: Trans2K plus DNA ladder; 1~13: 为利用植物基因组DNA提取试剂盒提取的DNA, 各泳道相应样品编号见表3。上样量4.0 μL。
Fig. 1Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from a single crop reference material

M: Trans2K plus DNA ladder; Lanes 1-13 are the corresponding DNA sample number shown in Table 3. Loading amount was 4.0 μL.


2.1.2 对含量0.1%的标准物质转化体特异定性PCR检测结果的影响 对含量0.1%的标准物质以能否扩增出清晰可见的转化体特异的目标条带或出现典型扩增曲线作为判定标准样品检测有效的依据。结果表明, 普通定性PCR的6次重复均能得到明显的目标大小的扩增带(图2)。实时荧光PCR的9次重复均获得良好扩增曲线(图3), Ct值为31.6~36.9 (表2)。

图2

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图2转基因含量0.1%的标准物质转化体特异性普通PCR扩增电泳图

测试样品为低温保存9年的转基因含量0.1%的基体标准物质; M: 100 bp DNA ladder; 1~6: 转基因含量0.1%的标准物质; 7~9: 转基因含量1.0%的阳性对照; 10~12: 非转基因混合物; 13~15: 样品DNA提取空白对照; 16~18: PCR空白水对照。
Fig. 2Electrophoretic image of GMO reference material with content 0.1% detected by event-specific qualitative PCR

The events with 0.1% content were matrix reference materials stored nine years at low temperature; M: 100 bp DNA ladder; 1-6: GMO reference material with 0.1% content; 7-9: positive control with content 1.0% (w/w); 10-12: non-transgenic negative control; 13-15: blank control; 16-18: PCR blank H₂O control.

图3

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图3转化体含量0.1%的标准物质实时荧光PCR扩增曲线图

测试样品为低温保存9年的转基因含量0.1%的基体标准物质; CK⁺: 转基因含量1.0%的阳性对照。
Fig. 3Amplification curves of GMO reference material with GM content 0.1% detected by qRT-PCR

The events with 0.1% content were matrix reference materials stored nine years at low temperature; CK⁺: positive control with content 1.0% (w/w).


Table 2
表2
表2转化体实时荧光PCR对保存9年的转基因含量0.1%的标准物质的检测
Table 2Detection of reference materials with GM content 0.1% stored for nine years by event-specific qRT-PCR

样品名称 Sample	模板浓度 DNA concentration (mg L-1)	Ct值 Ct value	相对标准差 RSD (%)	结论 Result	阳性对照Ct值 Ct value of CK+
Bt11	36.0	36.89±0.53	1.43	阳性Positive	29.32±0.40
Bt176	24.5	34.17±0.09	1.30	阳性Positive	25.39±0.10
MON863	34.5	35.60±0.34	0.95	阳性Positive	30.60±0.19
MON810	28.5	35.05±0.41	1.18	阳性Positive	27.12±0.16
GTS40-3-2	40.0	36.23±0.40	1.11	阳性Positive	30.43±0.44
G6H1	77.5	33.70±0.38	1.12	阳性Positive	27.49±0.52
TC1507	24.5	35.06±0.88	2.52	阳性Positive	30.34±0.49
59122	36.0	36.11±0.42	1.18	阳性Positive	30.25±0.15
MIR604	27.5	35.82±0.77	2.16	阳性Positive	30.31±0.13
GBH119	67.0	31.56±0.15	0.48	阳性Positive	26.98±0.23

RSD: relative standard deviation.

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2.1.3 对不同浓度单一作物基体标准物质定值的分析

单重微滴式数字PCR结果显示有效微滴生成总数均达到13,000个以上, 满足微滴式数字PCR中泊松分布统计学的要求^[38]。标准物质为含量5.0%的转基因水稻科丰6号其数字PCR四次重复测定平均值为5.83%, 1.0%的转基因棉花GBH119四次重复的测定平均值为0.83%。2份样品定值的含量偏差均没有超过25% (表3), 结果表明样品的长期保存对转基因含量为5.0%的水稻和1.0%的棉花的量值结果没有造成影响。

Table 3
表3
表3单重微滴式数字PCR对G6H1和GBH119标准物质的定量结果
Table 3Quantitative results of G6H1 and GBH119 with simplex droplet dPCR

样品含量 Sample content (%)	靶标 Target	拷贝数Copies (20 μL-1)				平均值 Average	转基因含量 GM content (%)	相对标准差RSD (%)	偏差 Bias (%)
		重复1 Repeat 1	重复2 Repeat 2	重复3 Repeat 3	重复4 Repeat 4
Kefeng 6 5.0	SPS	175,80.0	180,00.0	183,20.0	191,00.0	182,50.0
	Kefeng 6	105,8.0	103,2.0	102,7.0	114,2.0	106,4.8	5.83	5.49	16.60
GBH119 1.0	Adhc	109,000.0	114,000.0	119,400.0	113,800.0	114,050.0
	GHB119	952.0	946.0	984.0	916.0	949.5	0.83	3.47	-17.00

RSD: relative standard deviation.

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双重微滴式数字PCR检测中内标基因以VIC标记, 转化体以FAM标记。转基因大豆GTS40-3-2含量为0.1%、0.5%和1.0%的标准物质数字PCR定值检测4次重复的结果分别为0.11%、0.47%和1.12%。转基因玉米MON810含量为0.1%、0.5%和1.0%的标准物质4次重复定值结果分别为0.10%、0.52%和1.07%。定值结果与原始含量值偏差均没有超过25% (表4), 表明低于-70℃保存9年未能影响基体标准物质转基因的含量, 即便是浓度低至0.1%的基体标准物质其转基因含量依然保持不变。

Table 4
表4
表4双重微滴式数字PCR对不同含量的转基因玉米和大豆的定量结果
Table 4Quantitative results of MON810 and GTS40-3-2 with duplex droplet dPCR

样品含量 Sample content	靶标 Target	拷贝数Copies (20 μL-1)				转基因含量GM content (%)				平均值 Average (%)	相对标 准差 RSD (%)	偏差 Bias (%)
		重复1 Repeat 1	重复2 Repeat 2	重复3 Repeat 3	重复4 Repeat 4	重复1 Repeat 1	重复2 Repeat 2	重复3 Repeat 3	重复4 Repeat 4
GTS40-3-2 0.1%	GTS	5.5	4.8	7.4	7.8	0.09	0.08	0.12	0.13	0.11	23.80	10.00
	Lectin	626,0.0	602,0.0	602,0.0	600,0.0
GTS40-3-2 0.5%	GTS	58.0	64.0	76.0	46.0	0.44	0.49	0.60	0.35	0.47	22.57	6.00
	Lectin	131,40.0	129,80.0	126,00.0	132,20.0
GTS40-3-2 1.0%	GTS	110.0	106.0	108.0	108.0	1.12	1.10	1.13	1.13	1.12	1.42	12.00
	Lectin	986,0.0	966,0.0	952,0.0	960,0.0
MON810 0.1%	MON810	6.8	6.8	8.8	10.0	0.08	0.08	0.11	0.13	0.10	21.73	0.00
	Adh-1	808,0.0	836,0.0	800,0.0	802,0.0
MON810 0.5%	MON810	55.0	54.0	62.0	56.0	0.51	0.49	0.57	0.52	0.52	6.14	4.00
	Adh-1	108,40.0	109,80.0	109,60.0	108,60.0
MON810 1.0%	MON810	196.0	202.0	124.0	166.0	1.21	1.24	0.78	1.04	1.07	19.75	7.00
	Adh-1	161,80.0	162,80.0	158,80.0	159,40.0

RSD: relative standard deviation.

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2.2 长期低温保存对多作物混合样品定性PCR检测的影响

对历年农业农村部科技发展中心组织的能力验证中提供样品的余样进行低温保存, 本研究应用该样品进行转基因成分的定性检测分析。检测的标准和参数依据当年能力验证的要求, 各参数检测参照标准见表1。通过普通PCR检测评价各年度样品检测结果是否与预期检测结果一致, 以判定留存的样品是否满足再现检测需求。由于基体标准物质通常推荐的有效期为2年, 故试验选择留存2年在有效期内的和超过有效期1年、3年、4年和9年的样品进行复核检测, 每一年度任选2个样品。

检测结果显示在有效期内和超过有效期1年、3年的样品扩增结果与预期结果(表1)完全一致(电泳图谱省略)。图4、图5分别显示了超过有效期4年和9年的能力比对样品的定性PCR检测电泳图谱。转基因阳性元件的扩增条带清晰可判, 检测结果与当年比对结果一致。其中样品S7含有的5种转化体(3种转基因玉米NK603、MON810、Bt11、1种转基因水稻TT51-1和2种转基因油菜GT73、MS8)均能得到有效扩增。经查阅能力比对测试结果档案获悉2009年编号S9的样品为含量0.5%的转基因大豆GTS40-3-2和0.5%的转基因玉米MON863的混合粉末, S10为含量0.5%的转基因水稻科丰6号和0.5%的转基因玉米MON863混合而成。由此可见, 转基因含量为0.5%的混合基体样品, 在低于-70℃的条件下保存11年不会影响其转基因各参数的检出。

图4

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图4存期6年的样品S7和S8中转基因成分的定性PCR检测

M: 100 bp DNA ladder; 1~3: 样品S7; 4~6: 样品S8; 7~9: 转基因含量1.0%的阳性对照; 10~12: 非转基因阴性对照; 13~15: 样品DNA提取空白对照; 16~18: PCR空白水对照; S7和S8为2014年留存的能力验证样品, 存期6年。
Fig. 4Qualitative PCR detection of transgenic components in S7 and S8 samples stored for six years

M: 100 bp DNA ladder; 1-3: sample S7; 4-6: sample S8; 7-9: positive control with GM content 1.0% (w/w); 10-12: non-transgenic negative control; 13-15: extract blank control; 16-18: blank H₂O control; S7 and S8 are the capability verification samples retained in 2014 with a shelf life of six years.

图5

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图5存期11年的样品S9和S10中转基因成分的定性PCR检测

M: 100 bp DNA ladder; 1~3: 样品S9; 4~6: 样品S10; 7~9: 转基因含量1.0%的阳性对照; 10~12: 非转基因阴性对照; 13~15: 样品DNA提取空白对照; 16~18: PCR空白水对照; S9和S10为2009年留存的能力验证样品, 存期11年。
Fig. 5Qualitative PCR detection of transgenic components in S9 and S10 samples stored for 11 year

M: 100 bp DNA ladder; 1-3: sample S9; 4-6: sample S10; 7-9: positive control with GM content 1.0% (w/w); 10-12: non-transgenic negative control; 13-15: extract blank control; 16-18: PCR blank H₂O control; S9 and S10 are the capability verification samples retained in 2009 with a shelf life of 11 years.

3 讨论

在校准、质量控制、能力验证、方法验证和样品赋值等测试分析工作中, 通常会使用标准物质使测量更具精确性与准确性, 使测量结果在不同实验室间甚至国际间能够互认, 结果的计量具有可追溯性。因此, 标准物质的量值的稳定性与检测结果的准确性密切相关。

转基因核酸检测中常用的标准物质, 主要有DNA和基体粉末2种形式, DNA也有溶液和干粉2种。DNA溶液形式的标准物质其稳定性受到保存温度、溶解缓冲液、DNA纯度、保存容器、DNA长度、组成和光照等因素的影响。研究表明, 在-20°C或-80°C下冷冻保存的DNA溶液的浓度, 尤其是低浓度的DNA溶液, 会随着时间的推移而降低^[39]。虽然干粉DNA的完整性比溶解的DNA溶液完整性在-80°C保存时间长, 但在3年保存期内同样存在降解从而影响其量值的稳定^[40]。关于基体标准物质稳定性的研究, 目前仅有标准物质在研制中提供的短期(少于2年)的稳定性测试, 未见长期保存(大于3年)对稳定性影响的报道, 本文研究了基体标准物质的长期低温保存对依赖于PCR技术的转基因植物检测结果可靠性和准确性的影响。

PCR的效率取决于DNA的质量和纯度。DNA质量由其片段长度(或平均分子量)和损伤程度决定^[41], 可通过琼脂糖凝胶电泳DNA快速检测, 当观察到清晰可见的紧密的高分子量条带, 而没有小分子量的DNA弥散条带时则可判定DNA未发生降解, 质量完整^[42]。DNA纯度可用分光光度计测定的A₂₆₀/A₂₈₀来评价, 当260 nm/280 nm吸收比在1.5~2.0之间时, 提取的DNA适合后续PCR分析^[43]。本研究结果表明: (1) 首先分析了长期低温保存对单一作物的基体标准物质基因组DNA提取效果的影响, 结果证明在低温保存9年样品中提取的DNA, 其A₂₆₀/A₂₈₀均在1.7~2.0之间, 电泳显示条带紧密, 没有弥散。在质量和纯度两方面, 长期的低温保存对提取基因组DNA没有明显影响; (2) 在此基础上, 利用普通PCR和实时荧光PCR两种检测方法对转基因含量为0.1%的单一作物基体标准物质进行转化体复核检测, 样品种类包括玉米、大豆、水稻和棉花。证明低含量转基因基体标准物质在长期低温保存后2种方法均能保证检出, 长期的保存并不影响其作为转基因检测中阳性对照的应用; (3) 长期低温保存对基体标准物质的转基因含量是否会有影响?试验选用微滴式数字PCR的方法, 对实验室留存9年的转基因含量为0.1%~5.0%的标准物质, 包括转基因水稻科丰6号、棉花GBH119、玉米MON810和大豆GTS40-3-2进行了定量复核检测, 试验4次重复之间RSD小于25%, 结果满足转基因定量检测的要求^[44]。各含量水平的基体标准物质测定的量值与标准物质初始量值偏差均在25%以内, 说明长期保存后标准物质转基因含量也没有发生明显变化; (4) 长期低温保存对混合作物的基体样品各转基因元件的检测结果是否有影响?试验利用普通PCR方法对历年参加能力验证留存的混合作物的样品进行了转基因元件的复现性检测, 检测参数覆盖16个转基因元件, 样品最复杂的S7由3种不同作物(水稻、玉米和油菜)、5种转化体(3种转基因玉米NK603、MON810、Bt11、1种转基因水稻TT51-1和2种转基因油菜GT73、MS8)的粉末混合而成。结果表明低温保存长达11年对混合作物样品中各转基因元件的检出均没有影响。

本试验选取的样品包括混合作物的基体样品和单一作物的基体标准物质, 整个存放期间样品未发生结块、受潮和霉变等现象, 期间有1~2次的取出称量使用。研究结果证实, 低于-70℃ (最低至-75℃)存放9~11年的基体标准样品, 不论是混合作物, 还是单一作物, 对转基因定性和定量检测的准确性都没有影响。对于基体标准物质的保存建议低于-70℃保存, 有效期可达至少10年。此外, 样品包装最好以最小包装, 尽量避免反复解冻、受潮、结块和霉变等。

致谢:

本论文数字PCR部分的数据校对和分析承蒙中国农业科学院生物技术研究所李亮博士的指导修改, 在此表示感谢。

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