,1,*Use of Bar Gene for the Stable Transformation of Herbicide-resistant Foxtail Millet Plants
CHEN Qian-Nan1,2, WANG Ke1, TANG Sha1, DU Li-Pu1, ZHI Hui1, JIA Guan-Qing1, ZHAO Bao-Hua2, YE Xing-Guo1, DIAO Xian-Min,1,*通讯作者:
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收稿日期:2017-11-23接受日期:2018-07-20网络出版日期:2018-08-01
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Received:2017-11-23Accepted:2018-07-20Online:2018-08-01
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Abstract
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陈倩楠, 王轲, 汤沙, 杜丽璞, 智慧, 贾冠清, 赵宝华, 叶兴国, 刁现民. 以抗除草剂Bar基因稳定转化谷子技术研究[J]. 作物学报, 2018, 44(10): 1423-1432. doi:10.3724/SP.J.1006.2018.01423
CHEN Qian-Nan, WANG Ke, TANG Sha, DU Li-Pu, ZHI Hui, JIA Guan-Qing, ZHAO Bao-Hua, YE Xing-Guo, DIAO Xian-Min.
谷子(Setaria italica (L.) Beauv.)在植物分类系统中处于禾本科(Gramineae)黍亚科(Panicoideae)狗尾草属(Setaria), 其野生祖先种是青狗尾草(Setaria viridis)[1]。我国黄河流域是谷子的发源地, 谷子在我国有着极其悠久的栽培历史。谷子籽粒脱皮后俗称“小米”, 营养价值均衡, 蛋白质、脂肪酸含量高, 富含丰富的维生素和微量元素[2]。我国也是谷子种植面积最大的国家, 占世界谷子种植总面积的88%。谷子作为抗旱节水作物, 在应对未来干旱环境和全球气候变暖导致的粮食减产风险中有着战略储备作物的意义。谷子是C4植物, 二倍体自花授粉, 基因组小, 生育周期短, 耐旱耐贫瘠, 抗逆性强, 适应性广, 正在逐渐发展成为研究C4植物光合作用和抗旱耐贫瘠的模式作物[3,4]。
目前, 有关谷子遗传转化的报道相对较少, 最早的谷子转基因研究报道是董云州等[5,6]利用基因枪法轰击谷子花粉。之后, 刁现民等[7]利用基因枪法轰击谷子胚性愈伤组织, 成功建立了谷子的转化体系, 但该方法的转化效率依然偏低。王永芳等[8]最先利用根癌农杆菌介导法进行谷子的遗传转化研究, 谷子的基因转化验证研究处于起步阶段。过表达SiPf40基因的冀谷11转基因植株会导致其分蘖数增加[9]; Si401基因转化冀谷11胚性愈伤组织, 转基因植株会出现多种异常发育的花药[10]; 李丛[11]在冀谷11中超表达SiARDP基因提高了转基因谷子的耐旱性。青狗尾草作为谷子的野生近缘种, 近年来其转化效率有了重大突破, 美国康奈尔大学Boyce Thompson植物研究所, 以青狗尾草A10作为材料, 成功建立了其农杆菌遗传转化技术体系, 转化效率接近20%[4]; 近几年相继有2篇文章报道通过花粉管通道与农杆菌介导相结合的方法成功获得可稳定遗传的转基因植株, Martins等[12,13]与Saha等[14]将外源基因通过载体构建的方式转入农杆菌中, 制成农杆菌悬浮液, 通过蘸花法也获得了转基因阳性植株, 但这种蘸花法在国际上多个实验室难以重复。目前国内外谷子的转基因研究均处于转基因体系构建和优化过程中, 尚无具有应用价值的谷子转基因成型材料。随着谷子研究价值的不断提高, 谷子的遗传转化技术也越来越重要。
在植物转基因研究中, 抗性标记基因的使用可以有效地从非转化细胞中筛选获得转化体。目前经常使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因, 如潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)[15]、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)[16]、草丁膦抗性基因(bar)[17]、草甘膦抗性基因(epsps)[18]等。随着转基因植物的大量推广, 人们越来越关注抗性标记滞留植物体内并表达是否对植物体本身或其他有利性状基因的表达产生影响, 因此, 提高转基因植物选择标记基因的安全性成为研究热点。Bar基因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂基因, 其编码的PPT乙酰转移酶可有效水解培养基中PPT及其类似物Basta、Bialaphos等, 使植物体内谷氨酰胺合成途径能够正常进行, 免除体内氨离子积累对植物细胞的毒害作用[19], 作为选择标记基因也成功被用于不同物种的遗传转化[20]。张晓东等[21]将小麦中编码HMW谷蛋白5和10亚基的基因和Bar基因重组, 用基因枪法转化小麦幼胚、幼穗和花药, 获得了Basta抗性植株。傅荣昭等[22]将抗除草剂基因Bar与雄性不育基因TA29-barnase紧密连接, 创造了新的雄性不育转基因材料。黄大年等[23]将Bar基因导入杂交水稻的恢复系, 也成功获得了可用于生产的抗除草剂杂交水稻。
由于大规模地、连续性地使用除草剂, 农田杂草已对除草剂产生抗性, 若单纯提高除草剂的使用浓度以达到杀死杂草的目的, 则容易对农作物产生毒害作用。因此, 育成抗除草剂的作物新品种已成为育种工作者的一个重要课题。谷子生产一直采用大量播种、人工间苗的栽培方式, 普通谷子品种缺乏适宜的除草剂, 所以谷田除草一直靠人工作业, 体力劳动繁重[24]。谷子本身又不具备抗除草剂或耐除草剂基因, 经育种工作者的长期研究, 在谷子的近缘野生种狗尾草中发现多个抗除草剂基因[25,26,27]。王天宇等[24,28]将源于狗尾草的多个不同类型的抗除草剂基因转移到栽培种上, 获得了抗三类实用有效除草剂(阿特拉津、氟乐灵、拿扑净)的新种质。
本试验以谷子幼穗为外植体, 利用Bar基因作为选择标记基因, 旨在构建谷子稳定的遗传转化体系, 并创制谷子抗除草剂新材料, 为利用组织培养和基因工程技术开展谷子功能基因组学的研究和谷子抗除草剂育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选用冀谷 11, 种植于中国农业科学院作物科学研究所北京顺义试验站(夏季)和海南三亚试验站(冬季)。植物表达载体pWMB111、农杆菌C58C1由中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦转化组提供。pWMB111载体是由Ubi启动子同时调控的GUS基因和Bar基因。
1.2 培养基成分
遗传转化所用的基本培养基为MS培养基, 添加不同添加物后构成不同培养阶段所用培养基(表1)。Table 1
表1
表1农杆菌介导谷子愈伤组织转化培养基配方
Table 1
| 组分 Composition | 诱导培养基 IM | 侵染液 IL | 共培养基 CM | 恢复培养基RM | 筛选培养基 SM | 分化培养基DM | 壮苗培养基 SSM |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MS | 4.43 | 0.443 | 0.443 | 4.43 | 4.43 | 4.43 | 2.215 |
| L-Glu | 0.5 | — | — | 0.5 | 0.5 | — | — |
| CEH | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | — | — |
| MES | 1.95 | 0.5 | 0.5 | 1.95 | 1.95 | — | — |
| inositol | 0.1 | — | — | 0.1 | 0.1 | 0.1 | — |
| VCa | — | — | — | — | — | 0.01 | 0.01 |
| Glucose | — | 36 | 10 | — | — | — | — |
| Sucrose | — | 68.5 | — | — | — | 20 | 30 |
| Maltose | 40 | — | — | 40 | 40 | — | — |
| CuSO4a | — | 0.0006 | — | — | — | — | — |
| AgNO3a | 0.005 | — | 0.005 | 0.005 | 0.005 | — | — |
| 2,4-Da | 0.002 | — | 0.002 | 0.002 | 0.002 | — | — |
| KTa | 0.0005 | — | 0.005 | 0.0005 | 0.0005 | 0.002 | — |
| NAAa | — | — | — | — | — | — | 0.0005 |
| ASa | — | — | 0.1962, L-1 | — | — | — | — |
| Cefa | — | — | — | 0.1 | — | — | — |
| Carba | — | — | — | 0.25 | 0.25 | — | — |
| Tima | — | — | — | — | — | 0.15 | 0.15 |
| PPTa | — | — | — | — | 0.005/0.01 | — | 0.001 |
| Agar | 5 | — | 8 | 5 | 5 | — | — |
| Phytagel | — | — | — | — | — | 2.5 | 2 |
VC: vitamin C; 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; KT: kinetin; NAA: 1-naphthaleneacetic acid; AS: acetosyringone; Cef: cefetamet pivoxil; Carb: carbenicillin; Tim: timentin; PPT: phosphinothricin; IM: induction medium; IL: infection liquid; CM: co-culture medium; RM: recovery medium; SM: screening media; DM: differentiation medium; SSM: strong seedling medium.
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1.3 试验方法
1.3.1 取样和幼穗愈伤组织培养 种植谷子材料, 当其进入孕穗期后每2天取一次样, 获得不同大小的幼穗, 至幼穗大于等于2.0 cm后停止取样。剥去苞叶, 用75%的酒精喷拭叶鞘表面, 于超净台内用无菌手术刀及镊子将叶鞘内的幼穗小心取出, 切成0.5 cm左右的小段, 接种于诱导培养基上, 28°C暗培养以诱导愈伤组织。分别设置7、15、30 d诱导时间, 保证每个处理均包含不同生长长度的幼穗材料。将诱导7、15、30 d的幼穗进行农杆菌侵染转化, 恢复培养3 d后, 检测GUS基因的瞬时表达效率。1.3.2 农杆菌介导的遗传转化 将胚性愈伤组织作为受体, 进行遗传转化热激处理(表2), 保证每个处理均包含不同生长长度的幼穗材料。然后4°C 6457×g低温离心10 min; 加入无菌IL侵染液(含有100 μmol L-1的AS)重悬, 获得OD600=1.0的农杆菌悬浮液, 室温静置侵染10 min, 吸干愈伤组织表面的菌液, 在AS培养基上共培养2 d, 恢复培养3 d后, 再将其转移到含有PPT的筛选培养基, 培养4周完成筛选。将筛选后得到的抗性愈伤组织转移至分化培养基中培养, 待分化芽长至2~4 cm时转移至生根培养基中。再生苗长到约8 cm根系较健壮时, 开盖炼苗3~4 d, 最后将去除培养基的再生苗移入试验地或进行盆栽。
Table 2
表2
表2遗传转化热激处理方式
Table 2
| 热激温度 Heat temperature (°C) | 热激时间 Heat time (min) | 冰浴时间 Ice bath time (min) |
|---|---|---|
| 25(CK) | — | — |
| 37 | 3 | 1 |
| 45 | 3 | 1 |
| 47 | 3 | 1 |
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1.3.3 转基因植株的PCR鉴定 利用SDS法分别提取T0代转基因植株和未转化植株全基因组DNA。PCR扩增Bar基因片段的引物F: 5′-GCA CCATCGTCAACCACTAC-3′; R: 5′-TGAAGTCCAG CTGCCAAAA-3′; rTaq酶(TaKaRa, 日本)检测PCR扩增体系为20 μL。反应程序为95°C变性5 min; 95°C变性40 s, 55°C退火40 s, 72°C延伸30 s, 30个循环; 72°C延伸10 min。取PCR产物10 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.4 Southern杂交 利用SDS法提取的高质量总DNA 20~30 μg, 经Sac I和Hind III限制性内切酶完全消化后, 在0.8%琼脂糖凝胶电泳上分离。参照Sambrook等[29]的方法将DNA转至带正电荷的尼龙膜上。探针为以pWMB111质粒为模板经PCR扩增的Bar基因片段, 探针的标记以及杂交过程参考DIG High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit II (Roche, 美国)的说明书。利用化学发光检测体系(UVP, 美国)进行免疫检测。
1.3.5 谷子转基因植株后代的检测 通过常规PCR法及Bar蛋白抗体试纸条法(取2 cm左右的叶片, 液氮速冻破碎; 加入0.3 mL的Extractin buffer, 将试纸条标有指示箭头的一端浸入buffer内, 静待2 min, 观察Bar蛋白抗体表达结果), 调查T1代转基因植株中Bar基因分离比例, 同时又对处于5~6叶期野生型及T3代转基因植株进行PPT抗性分析, 即分别用0、2.5、5 g L-1 PPT溶液涂抹野生型及T3代转基因植株新叶, 生长1周后, 观察统计植株存活率。
1.3.6 数据处理公式
愈伤组织出愈率(%)=(形成愈伤组织数/接种幼穗数)×100%
愈伤组织分化率(%)=(分化苗愈伤组织数/愈伤组织数)×100%
瞬时转化效率(%)=(GUS染色后蓝斑的愈伤组织数/愈伤组织总数)×100%
2 结果与分析
2.1 幼穗大小及诱导培养时间对于愈伤组织状态的影响
本研究人为的将谷子幼穗长度分为5个级别, 试验发现在其他试验条件相同时, 不同长度的幼穗愈伤组织诱导率不同(图1-D和表3)。当幼穗长度在0.5~1.0 cm时, 愈伤组织的诱导效率最高, 可达到92.74%, 此时的愈伤组织为淡黄色, 质地紧密, 状态最佳。在相同培养条件下, 愈伤组织诱导培养时间影响胚性愈伤组织的形成。诱导培养时间为7 d时, 幼穗细胞未经脱分化形成愈伤组织, 不具有全能性(图1-A); 愈伤组织诱导时间为15 d时, 多为淡黄色、质地紧密的胚性愈伤组织(图1-B); 诱导培养时间为30 d时, 愈伤组织状态会急剧下降, 并出现大量白色芽状体, 丧失分化能力(图1-C)。图1
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图1幼穗大小及愈伤组织状态
A: 诱导7 d后愈伤组织; B: 诱导20 d后愈伤组织; C: 诱导40 d后愈伤组织; D: 不同长度幼穗。
Fig. 1Panicle and calli status at different induction periods (bar = 0.5 cm)
A: calli after induction for 7 d; B: calli after induction for 20 d; C: calli after induction for 40 d; D: young panicles in different sizes.
Table 3
表3
表3幼穗诱导培养15 d后愈伤组织诱导效率的比较
Table 3
| 幼穗大小 Panicle size (cm) | 愈伤组织数量 Calli number | 幼穗数量 Panicle number | 愈伤组织诱导率 Calli induction rate (%)a |
|---|---|---|---|
| ≤ 0.5 | 23 | 30 | 74.35±2.35 |
| 18 | 25 | ||
| 20 | 27 | ||
| 0.5-1.0 | 181 | 198 | 92.74±1.13 |
| 190 | 204 | ||
| 207 | 221 | ||
| 1.1-1.5 | 104 | 137 | 75.14±4.11 |
| 97 | 123 | ||
| 77 | 109 | ||
| 1.6-2.0 | 43 | 96 | 39.16±4.98 |
| 39 | 103 | ||
| 31 | 89 | ||
| ≥ 2.0 | 17 | 75 | 21.54±1.85 |
| 13 | 68 | ||
| 21 | 92 |
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2.2 愈伤组织诱导培养时间对于谷子遗传转化效率的影响
当愈伤组织诱导时间为15 d时, 形成的愈伤组织较多(图2-B), GUS染色检测表明瞬时转化效率在52%左右(图2-D, E), 且后期经过两轮筛选后, 愈伤组织还能保持较高的分化能力。愈伤组织诱导培养时间为7 d时(图2-A), 愈伤组织的转化效率在50%左右, 与诱导培养15 d的愈伤组织转化效率无显著性差异, 但后期经过转化筛选, 分化能力差; 愈伤组织诱导培养时间为30 d时(图2-C), 愈伤组织的转化效率显著降低, 仅在30%左右(图2-D, F), 此时的胚性愈伤组织数量急剧减少, 且在筛选过程中出现大量白色芽体, 分化能力降低。图2
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图2愈伤组织诱导培养时间对转化效率的影响
A: 诱导7 d后愈伤组织; B: 诱导15 d后愈伤组织; C: 诱导30 d后愈伤组织; D: GUS瞬时转化效率; E: 诱导15 d愈伤组织GUS染色; F: 诱导30 d愈伤组织GUS染色。*, **分别表示在P ≤ 0.05和P ≤ 0.01水平上的显著差异。
Fig. 2Effect of calli induction time on transformation efficiency
A: calli after induction for 7 d; B: calli after induction for 15 d; C: calli after induction for 30 d; D: GUS transient conversion efficiency; E: GUS staining of calli after induction for 15 d; F: GUS staining of calli after induction for 30 d. * and ** indicates a significant difference at P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01 levels, respectively.
2.3 热激处理对谷子遗传转化效率的影响
热激可以提高质粒的转化效率, 本试验设计了25°C (CK)、37°C、45°C、47°C共4个预处理温度, 以3 min为热激预处理时间进行试验。GUS染色数据表明, 适当的热激有利于提高谷子愈伤组织的GUS基因瞬时表达率。37°C 3 min热激后愈伤组织的GUS基因染色效率与对照无显著差异; 45°C 3 min热激处理可以提高愈伤组织中GUS基因瞬时表达效率, 比对照组平均提高了26.1%的GUS瞬时转化效率; 47°C热激预处理对于农杆菌介导的愈伤组织瞬时表达有着抑制作用, 比对照组平均降低了8.4% (图3-A)。图3
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图3谷子愈伤组织热激处理GUS瞬时转化
A: 不同温度下热激3 min的GUS瞬时表达率; B: 25°C (CK) GUS染色; C: 45°C热激下GUS染色; D: 45°C热激温度下不同热激时间的GUS瞬时表达率; E: 45°C热激1.5 min GUS染色; F: 45°C热激3 min GUS染色。*和**分别表示在P ≤ 0.05和P ≤ 0.01水平上显著差异。
Fig. 3Transient expression of GUS after heat shock treatment of foxtail millet calli
A: GUS transient expression rate at different temperatures of 3 min; B: GUS staining under CK (25°C); C: GUS staining at 45°C heat shock; D: GUS transient expression rate at different time under 45°C heat shock; E: 45°C heat shock 1.5 min GUS staining; F: 45°C heat shock 3 min GUS staining. * and ** indicates a significant difference at P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01 levels, respectively.
对45°C热激温度设计了4组热激时间的试验, 恢复培养3 d后, GUS染色数据统计显示, 热激温度为45°C, 热激时间为3 min有利于瞬时转化效率的提高, 差异极显著(图3-D~F)。热激时间为1.5 min时, GUS表达效率与对照无显著差异, 热激时间为5 min时, GUS瞬时转化效率低于对照组。试验结果表明, 45°C 3 min的热激时间能显著提高瞬时转化效率, 而45°C 5 min的热激处理对其瞬时遗传转化有抑制作用。
2.4 谷子转基因T0代阳性植株的获得和检测
冀谷11谷子幼穗小段经15 d诱导, 共得到有效愈伤组织3120块, 农杆菌侵染转化、筛选后得到513块抗性愈伤组织, 抗性愈伤组织诱导率为16.4%。抗性愈伤组织经分化、壮苗培养后获得7棵抗性再生植株, 经炼苗后移栽温室花盆生长(图4-A~D)。提取PPT抗性植株的DNA, 进行Bar基因的PCR分析, 结果表明, 7株植株中有6株为阳性植株, 阳性植株率约为85.7% (图4-E), PCR检测结果初步证明Bar基因已经整合进谷子基因组中。阳性的转化植株进一步做Southern杂交分析, 由图4-F可看出, 未转化植株未显示任何杂交信号, 而检测的4个转化植株中都显示了有Bar基因的杂交信号, 证明该基因已经整合进谷子基因组中, 同时也证明了经农杆菌转化的外源基因拷贝数低的优点。图4
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图4T0代转基因植株鉴定
A: 愈伤组织分化; B: 再生植株; C: 壮苗; D: 再生植株移栽; E: Bar基因PCR检测, 1~7为T0代转化单株; F: T0代转化株Southern blot, 1~5: 经Sac I酶切, 7~11: 经Hind III酶切, 6: 野生型。M: marker DL2000; H: 水对照; WT: 野生型; P: 质粒。
Fig. 4Identification of T0 generation transgenic lines
A: calli differentiation; B: regenerated plant; C: strong seedling; D: transplanting of regenerated plants; E: bar PCR detection, 1-7 are T0 generation transformed plants; F: Southern blot of T0 generation of transgenic lines, 1-5: digested with Sac I, 7-11: digested with Hind III, 6: wild type. M: marker DL2000; H: water control; WT: wild type; P: plasmid.
2.5 谷子转基因植株抗PPT除草剂鉴定和遗传分析
播种T0代转基因阳性植株, 获得T1代转基因植株, 待植株长至四叶期, 用常规PCR法及Bar蛋白抗体试纸法检测T1阳性株, 经统计112棵T1代植株, 阳性株与阴性株的分离比符合3︰1, 证实该基因是单拷贝插入。随后又对T3代转基因植株叶片进行PPT抗性分析, 用棉棒将浓度为0、2.5、5.0 g L-1的PPT溶液涂抹未转化植株叶片, 当PPT溶液浓度为2.5 g L-1以上时, 所有经过涂抹的谷子叶片均在1周内开始黄化, 脱水萎蔫, 直至枯死。而PCR检测呈阳性的转化植株经PPT溶液涂抹叶片后, 均表现出抗性, 结合Bar蛋白抗体试纸条结果确定了最适的PPT筛选浓度为2.5 g L-1 (图5)。该结果也证实了Bar基因可以在谷子转基因后代中稳定表达。图5
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图5T3代转基因株bar基因抗性试验
A: 2.5 g L-1 PPT溶液涂抹叶片; B: 2.5 g L-1 PPT 溶液喷洒叶片, 左侧转化株, 右侧未转化株; C: Bar蛋白抗体试纸条鉴定结果。CK: 未转化阴性对照; Vegative: 转基因阴性株; Positive: 转基因阳性株。
Fig. 5 Bar gene resistance test of T3 generation transgenic lines
A: 2.5 g L-1 PPT solution coated leaves; B: 2.5 g L-1 PPT solution sprayed leaves in transgenic lines (left) and in CK (right); C: Bar protein test results. CK: wild type control; Negative: negative transgenic lines; Positive: positive transgenic line.
3 讨论
3.1 影响谷子组培特征及瞬时转化效率的主要因素
影响谷子组织培养的因素较多, 而合适外植体诱导出的胚性愈伤组织是高效转化率的基础。柳琳[30]探究了不同生长状态的谷子幼穗诱导出的愈伤组织状态, 发现枝梗分化期的谷子幼穗诱导的胚性愈伤组织率较高; 小穗分化期的谷子幼穗产生的胚性愈伤组织少, 多数变褐逐渐死亡; 小花分化期、雌雄蕊分化期和幼穗打包期的谷子幼穗诱导出的胚性愈伤组织极低。董云洲等[6]将处于小花分化期的幼穗在改良后的MS培养基上诱导20 d, 可分化的胚性愈伤组织获得率仅为0.55%, 与本研究的结果趋势相同。本试验又对枝梗分化期的幼穗细分, 发现长度为0.5~1.0 cm的幼穗胚性愈伤组织诱导效率最高, 可达到92.74%。本研究表明, 热激对农杆菌介导的谷子愈伤组织瞬时遗传转化效率的提高有显著作用。结合Hiei等[31]的试验结果, 农杆菌介导的侵染受体的遗传转化效率的提高需要一定的温度条件, 在受体材料存活所需的其他条件都可以满足的情况下, 在一定的温度范围内, 温度和遗传转化效率正相关, 并且要积累到一定的温度总量。徐游[32]采用42°C 3 min和38°C 5 min的处理方式处理玉米幼胚, GUS染色结果表明, 瞬时转化效率分别提高9.43%和8.80%, 也证实了热激温度高, 需要的热激时间短, 热激温度低, 需要的热激时间长的推论。本试验中45°C 3 min的热激处理就可以显著提高谷子愈伤组织瞬时转化效率, 而37°C 3 min的热激时间未能提高转化效率, 延长37°C下的热激时间是否可以提高愈伤组织的瞬时转化效率需要进一步的试验验证。
3.2 谷子愈伤组织稳定遗传转化效率需进一步提高
董云洲等[6]用基因枪法轰击豫谷2号谷子幼穗, GUS基因瞬时转化效率为0.15%, 最终只获得了0.05%的转基因频率。刘颖慧等[33]通过农杆菌介导法将带有GUS基因的pBI121载体转化到谷子愈伤组织中, 经50 mg L-1卡那霉素筛选得到了转基因阳性株, 但转基因株后代不育。Lambe等[34]在谷子转化过程中使用潮霉素作为选择标记, 结果不能形成再生植株, 随后又选用潮霉素B作为选择标记, 获得了可再生植株。Martins等[12]利用农杆菌介导法进行青狗尾草的转化, 成功将其遗传转化效率提高到了29%。Martins等[13]和Saha等[14]通过蘸花法浸染孕穗期的青狗尾草, 转化效率可达到0.6%~0.8%。本研究中, 我们将Bar基因转化谷子并成功获得了转基因植株, 通过分析验证, 表明该基因已经整合到谷子基因组中, 且在后代中表现单基因分离。利用优化后的方法开展谷子遗传转化, 稳定的遗传转化效率可达到1.2%~1.5%, 较前人的研究有显著提升, 但与模式作物水稻的遗传转化效率相比仍然存在较大差距。农杆菌介导的谷子遗传转化体系是多因素综合效应, 不同的方法对转基因效率影响不同, 其原因有待进一步探讨, 谷子瞬时转化效率高, 但是难以高效率整合到基因组中, 是我们后续待解决的问题。3.3 抗除草剂转基因谷子培育对生产实践的意义
利用或者培育抗除草剂品种是目前控制作物田间杂草的重要措施之一, 也是提高作物产量、减少农药施用量、保护环境的重要举措。育种工作者用抗拿捕净谷子材料“WRl”与综合性状优良的常规谷子品种杂交, 在杂种自交后代中选育分离的抗除草剂单株, 已获得性状优良的抗除草剂品种[24]。但是, 若同时筛选多个不同抗性品种或一个抗多种除草剂的品种, 工作量繁重, 耗时较长, 急需一种快速简便的选育方法。目前, 在谷子中也克隆出抗除草剂基因, 如抗拿捕净除草剂基因Srf, 并开发了相应的分子标记[35], 由于除草剂拿扑净对单子叶作物不具有选择性, 目前在单子叶植物上的应用并不广泛。草丁膦是农业生产中广泛使用的高效低残留除草剂, 获得草丁膦的抗性基因, 并通过基因工程手段在其他单子叶作物中表达, 将对农业生产具有重要意义。本研究通过优化的遗传转化体系, 将外源抗草丁磷Bar基因转入谷子植株, 得到稳定持久的谷子抗除草剂品系, 将该品系与其他品种配制杂交组合, 秧苗期喷草丁膦药剂可有效清除田间杂草, 而不影响谷子的生长, 从而减轻人工除草的投入, 做到轻简栽培。本研究对于丰富目前缺乏的抗除草剂谷子品种和提高谷子生产效率具有重要意义。4 结论
本研究探讨了幼穗大小、幼穗愈伤组织的诱导培养时间等对于愈伤组织状态及再生的影响。并通过热激处理的方式显著提高了谷子瞬时遗传转化效率, 确定了谷子抗除草剂Bar基因的筛选浓度。通过已建立的转化体系获得了稳定遗传的抗草丁膦除草剂的谷子转基因材料。为以后谷子功能基因的验证奠定了坚实的基础, 并为谷子基因工程育种提供了良好的资源。参考文献 原文顺序
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文中引用次数倒序
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Millet plants widely in north China for its balance nutrition,flexibility,anti-drought and well-storage properties.Millet also can be converted into yellow pigments,dietary fiber,etc.as byproducts.In this article,the nutrition and function of millet is introduced,and the application in food,medicine,and chemistry industries are summarized.In the end,the future research direction is put forward.
DOI:10.1104/pp.108.129627URLPMID:19126705 [本文引用: 1]
Foxtail millet (Setaria italica) is a small diploid C4 panicoid crop species, whose genome is being sequenced by the Joint Genome Institute (JGI) of the Department of Energy. The rationale for sequencing foxtail millet is that it is closely related to the bioenergy grasses switchgrass (Panicum virgatum), napiergrass (Pennisetum purpureum), and pearl millet (Pennisetum glaucum), yet is a more tractable experimental model because of its small diploid genome (1C genome size = 490 Mb) and inbreeding nature. This compares to the larger genomes of the outbreeding species pearl millet (diploid, 1C = 2,352 Mb), napiergrass (tetraploid, 1C = 2,254 Mb), and switchgrass (tetraploid, 1C =1,372 1,666 Mb, octaploid 1C = 2,352 3,136 Mb; Bennett et al., 2000). Switchgrass is largely self-incompatible, which significantly complicates forward or reverse genetics, trait mapping, genetic engineering, and genome sequencing. Foxtail millet is self-compatible and has a highly conserved genome structure relative to the ancestral grass lineage (Devos et al., 1998). Some genetic resources such as genetic maps (Devos et al., 1998; Wang et al., 1998) and a small collection of ESTs (Zhang et al., 2007) are already available for foxtail millet, but most of the tool development and genetic research in foxtail millet will be sequence driven.
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Inflorescence of millet crop,Yugu No.2,was bombarded by JQ 700 particle gun.The plasmid of pBI121,which containing GUS reporter gene and npt Ⅱ selective marker gene,was used in this study.Totally 908 kanamycin resistance (Kan R) calli was produced in selective medium with 150 mg/L Kanamycin.Five of Kan R calli were characterized out with green shoots which differenciated 16 green plantlets.GUS histochemical assay demonstrated that three of them is positive.Southern blot confirmed that one plant is transgenic.The transgenic frequency is 0.05%.
DOI:10.3321/j.issn:1000-7091.1999.03.007URL [本文引用: 1]
Factors influencing foxtail millet (Setaria italica Beauv.)embryogenic calli transformation by particle bombardments were studied using the method of Gus transient expression with JQ 700 gene gun.Relatively high numbes of Gus transient expression unites were obtained when the quantity of plasmid DNA added to microprojectles was 4 g/mg tungsten powder and the concentration of CaCl 2 and spermidine used to absorb DNA to microprojectles were 1.5 mol and 40 mmol respectively.The velocity of the microprojectles and the distance between the calli being bombarded and the stopping plate of JQ 700 gene gun optimized in this report were 400-450 m/s and 7 cm.The quantity of calli used per treatment was also a factor influencing gene delivery and 1 2 g of calli per treatment gave higher Gus transient expression.The promoter derived from maize ubiquitin produced significantly more Gus foci compared to the CaMV35 s Promoter.
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干旱胁迫严重影响植物生长,是限制农作物产量的主要环境因素之一。植物进化出了多种分子机制来适应和抵抗干旱胁迫。在植物中,响应干旱胁迫的信号途径主要有两个：一个是脱落酸(abscisic acid, ABA)依赖信号途径,另一个是非ABA依赖信号途径。两条信号通路之间并不是孤立的,它们彼此相互联系,形成了一个复杂的调控网络。 谷子是原产于我国的一种古老的粮食作物,具有营养丰富和抵抗干旱环境等特点,是我国重要的战略粮食作物。目前对谷子抗旱的分子机理还知之甚少。在本研究中,我们以干旱响应元件(dehydration responsive element, DRE)为诱饵,通过酵母单杂交技术从谷子cDNA文库中克隆到一个响应ABA信号的DRE元件结合蛋白基因。我们将该基因命名为SiARDP (Setaria italica ABA-responsive DRE-binding protein)。 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)和Northern blot结果显示SiARDP受干旱、高盐、ABA和低温诱导表达。SiARDP在谷子的根、茎、叶和花序中都有表达,并且在叶中表达量较高。谷子原生质体亚细胞定位显示SiARDP蛋白定位于细胞核；凝胶阻滞(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验表明原核表达的SiARDP-His融合蛋白能与DRE元件结合；酵母转录激活实验证明SiARDP蛋白具有转录激活活性。在拟南芥中异源表达SiARDP能够提高植物对干旱和高盐的耐受力,干旱胁迫下转基因植株比野生型植株积累更多的脯氨酸,高盐胁迫下转基因植株的离子渗透率低于野生型植株。在谷子中超表达SiARDP提高了转基因谷子的耐旱性,并且干旱胁迫下转基因谷子比野生型谷子积累了更多的脯氨酸。超表达转基因谷子中多个启动子区存在DRE元件与干旱胁迫相关基因的表达量升高,说明超表达谷子植株中SiARDP通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。 分析显示SiARDP启动子区存在两个ABA响应元件(ABA-responsive element, ABRE)。我们从谷子中克隆了两个ABRE结合蛋白(ABRE-binding protein, AREB)基因分别命名为SiAREBl和SIAREB2。 SiAREBl和SiAREB2受干旱、高盐和ABA诱导,但不受低温胁迫诱导。谷子原生质体亚细胞定位显示SiAREB1和SiAREB2定位于细胞核,酵母转录激活实验证明SiAREB1和SiAREB2具有转录激活活性。EMSA,酵母单杂和ChIP分析证明SiAREB1和SiAREB2在体内和体外都能够与SiARDP启动子区的ABRE元件直接结合。在拟南芥中异源表达SiAREBl和SiAREB2同样能够提高转基因拟南芥对干旱和高盐的耐受力。点突变和蛋白磷酸化实验表明SiAREB2蛋白活性受磷酸化修饰调控。 综上所述,SiARDP作为DREB类转录因子参与谷子非生物胁迫应答,在干旱和高盐胁迫下受AREB转录因子调控,参与ABA信号通路,在低温胁迫下可能受其它因子调控参与非ABA信号通路。
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干旱胁迫严重影响植物生长,是限制农作物产量的主要环境因素之一。植物进化出了多种分子机制来适应和抵抗干旱胁迫。在植物中,响应干旱胁迫的信号途径主要有两个：一个是脱落酸(abscisic acid, ABA)依赖信号途径,另一个是非ABA依赖信号途径。两条信号通路之间并不是孤立的,它们彼此相互联系,形成了一个复杂的调控网络。 谷子是原产于我国的一种古老的粮食作物,具有营养丰富和抵抗干旱环境等特点,是我国重要的战略粮食作物。目前对谷子抗旱的分子机理还知之甚少。在本研究中,我们以干旱响应元件(dehydration responsive element, DRE)为诱饵,通过酵母单杂交技术从谷子cDNA文库中克隆到一个响应ABA信号的DRE元件结合蛋白基因。我们将该基因命名为SiARDP (Setaria italica ABA-responsive DRE-binding protein)。 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)和Northern blot结果显示SiARDP受干旱、高盐、ABA和低温诱导表达。SiARDP在谷子的根、茎、叶和花序中都有表达,并且在叶中表达量较高。谷子原生质体亚细胞定位显示SiARDP蛋白定位于细胞核；凝胶阻滞(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验表明原核表达的SiARDP-His融合蛋白能与DRE元件结合；酵母转录激活实验证明SiARDP蛋白具有转录激活活性。在拟南芥中异源表达SiARDP能够提高植物对干旱和高盐的耐受力,干旱胁迫下转基因植株比野生型植株积累更多的脯氨酸,高盐胁迫下转基因植株的离子渗透率低于野生型植株。在谷子中超表达SiARDP提高了转基因谷子的耐旱性,并且干旱胁迫下转基因谷子比野生型谷子积累了更多的脯氨酸。超表达转基因谷子中多个启动子区存在DRE元件与干旱胁迫相关基因的表达量升高,说明超表达谷子植株中SiARDP通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。 分析显示SiARDP启动子区存在两个ABA响应元件(ABA-responsive element, ABRE)。我们从谷子中克隆了两个ABRE结合蛋白(ABRE-binding protein, AREB)基因分别命名为SiAREBl和SIAREB2。 SiAREBl和SiAREB2受干旱、高盐和ABA诱导,但不受低温胁迫诱导。谷子原生质体亚细胞定位显示SiAREB1和SiAREB2定位于细胞核,酵母转录激活实验证明SiAREB1和SiAREB2具有转录激活活性。EMSA,酵母单杂和ChIP分析证明SiAREB1和SiAREB2在体内和体外都能够与SiARDP启动子区的ABRE元件直接结合。在拟南芥中异源表达SiAREBl和SiAREB2同样能够提高转基因拟南芥对干旱和高盐的耐受力。点突变和蛋白磷酸化实验表明SiAREB2蛋白活性受磷酸化修饰调控。 综上所述,SiARDP作为DREB类转录因子参与谷子非生物胁迫应答,在干旱和高盐胁迫下受AREB转录因子调控,参与ABA信号通路,在低温胁迫下可能受其它因子调控参与非ABA信号通路。
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DOI:10.1007/BF00231579URLPMID:24178266 [本文引用: 1]
A highly efficient method for stable wheat transformation using hygromycin resistance as a selectable marker is described. Young embryogenic calli growing from immature wheat embryos were transformed using a gunpowder-driven microparticle accelerator. Transgenic wheat plants were determined by PCR amplification of transgene fragments and confirmed by Southern hybridization, activity of the transgene expression and by analysis of the progeny. The hpt gene was as good as or a better selectable marker than the bar gene with an average efficiency (number of transgenic plants relative to the number of bombarded calli) of 5.5% compared with 2.6% for the bar gene.
DOI:10.1038/304184a0URL [本文引用: 1]
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DOI:10.1007/BF02951625URL [本文引用: 1]
利用ＰＤＳ１０００／氦气基因枪将人工构建的雄性不育基因导和小麦栽培品种豫麦１８号的幼胚细胞，然后在含有１０－２０ｍｇ／Ｌ除草剂Ｂａｓｔａ的培养基因上筛选与分化。从１７０个幼胚中获得６株绿苗，对照的７０个幼胚中未得绿苗，对其中３株已生根且长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析，结果表明，这３株绿苗皆为转基因植株，转化效率达１．８％
DOI:10.1007/BF02951625URL [本文引用: 1]
利用ＰＤＳ１０００／氦气基因枪将人工构建的雄性不育基因导和小麦栽培品种豫麦１８号的幼胚细胞，然后在含有１０－２０ｍｇ／Ｌ除草剂Ｂａｓｔａ的培养基因上筛选与分化。从１７０个幼胚中获得６株绿苗，对照的７０个幼胚中未得绿苗，对其中３株已生根且长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析，结果表明，这３株绿苗皆为转基因植株，转化效率达１．８％
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谷子(foxtail millet, Setaria Italica)属禾本科、狗尾草属,是世界上最古老的农作物之一,也是一种重要的粮食作物和饲草作物,在我国北方农业和牧业生产中具有重要地位。相对于其它禾本科作物,如水稻、小麦、玉米等,谷子属于区域性小杂粮作物,其影响力较小,生物技术研究相对较少,但是谷子营养价值丰富,有许多优越于其它作物的有益性状如抗旱性、耐盐性、耐贫瘠性等。加强谷子生物技术研究对改良谷子及研究禾谷类作物遗传和进化具有重要意义。 本试验首先研究了谷子的组织培养和植株再生,并通过农杆菌介导法进行了谷子的遗传转化研究,现已成功获得具有卡那霉素抗性的谷子植株。 (1)通过筛选易于谷子组织培养的外植体和基因型,建立高效稳定的组织培养再生体系。实验结果表明,谷子幼穗与幼胚、成熟胚相比,其实验操作简单,诱导愈伤容易,胚性愈伤率最高,且愈伤组织状态最佳,是谷子组织培养和农杆菌转化的理想外植体。枝梗分化后期的谷子幼穗为愈伤组织诱导的最佳时期,长约1-1.5cm左右,胚性愈伤率高达97.52%。通过对26份谷子品种进行筛选,发现冀谷11号、金谷米、朝谷12号、高39和豫谷1号诱导出来的愈伤组织状态最好,为硬颗粒状的胚性愈伤组织,颜色鲜亮,且其愈伤组织的绿原基分化和出苗情况也良好,可作为谷子组织培养和转基因受体材料的优良基因型。 (2)研究谷子农杆菌转化的各种影响因素,并优化转化条件：以继代1到2次的胚性愈伤组织作为转化的受体材料,转化前挑取颜色鲜亮、硬质颗粒状的胚性愈伤组织,对其进行4-5天的预培养和6-8小时的干燥培养,利用根癌农杆菌菌株LBA4404(-pBI2300,-pSgt,-pRac,-pRar)转化,愈伤组织在添加乙酰丁香酮和滤纸的共培养基上进行农杆菌与材料的共培养,3天后转移到500mg／L的羧苄青霉素的恢复培养基上进行恢复培养,之后在25-60mg／L的卡那霉素和200-500mg／L的羧苄青霉素的筛选培养基上培养6-7周,筛选出新的抗性愈伤组织再进行分化培养,最后成功获得抗性植株281棵。 (3)初步确定了谷子苗期筛选转基因植株的抗生素的临界浓度：卡那霉素(200mg／L)或G418(50mg／L)。经PCR检测的转化植株有200棵,35S启动子转化率为9.50%,NPTⅡ基因的转化率为11.50%,两者共阳性率为8.50%。T0代转基因植株的结实率能达到90%以上,且表现了多种异常现象。
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谷子(foxtail millet, Setaria Italica)属禾本科、狗尾草属,是世界上最古老的农作物之一,也是一种重要的粮食作物和饲草作物,在我国北方农业和牧业生产中具有重要地位。相对于其它禾本科作物,如水稻、小麦、玉米等,谷子属于区域性小杂粮作物,其影响力较小,生物技术研究相对较少,但是谷子营养价值丰富,有许多优越于其它作物的有益性状如抗旱性、耐盐性、耐贫瘠性等。加强谷子生物技术研究对改良谷子及研究禾谷类作物遗传和进化具有重要意义。 本试验首先研究了谷子的组织培养和植株再生,并通过农杆菌介导法进行了谷子的遗传转化研究,现已成功获得具有卡那霉素抗性的谷子植株。 (1)通过筛选易于谷子组织培养的外植体和基因型,建立高效稳定的组织培养再生体系。实验结果表明,谷子幼穗与幼胚、成熟胚相比,其实验操作简单,诱导愈伤容易,胚性愈伤率最高,且愈伤组织状态最佳,是谷子组织培养和农杆菌转化的理想外植体。枝梗分化后期的谷子幼穗为愈伤组织诱导的最佳时期,长约1-1.5cm左右,胚性愈伤率高达97.52%。通过对26份谷子品种进行筛选,发现冀谷11号、金谷米、朝谷12号、高39和豫谷1号诱导出来的愈伤组织状态最好,为硬颗粒状的胚性愈伤组织,颜色鲜亮,且其愈伤组织的绿原基分化和出苗情况也良好,可作为谷子组织培养和转基因受体材料的优良基因型。 (2)研究谷子农杆菌转化的各种影响因素,并优化转化条件：以继代1到2次的胚性愈伤组织作为转化的受体材料,转化前挑取颜色鲜亮、硬质颗粒状的胚性愈伤组织,对其进行4-5天的预培养和6-8小时的干燥培养,利用根癌农杆菌菌株LBA4404(-pBI2300,-pSgt,-pRac,-pRar)转化,愈伤组织在添加乙酰丁香酮和滤纸的共培养基上进行农杆菌与材料的共培养,3天后转移到500mg／L的羧苄青霉素的恢复培养基上进行恢复培养,之后在25-60mg／L的卡那霉素和200-500mg／L的羧苄青霉素的筛选培养基上培养6-7周,筛选出新的抗性愈伤组织再进行分化培养,最后成功获得抗性植株281棵。 (3)初步确定了谷子苗期筛选转基因植株的抗生素的临界浓度：卡那霉素(200mg／L)或G418(50mg／L)。经PCR检测的转化植株有200棵,35S启动子转化率为9.50%,NPTⅡ基因的转化率为11.50%,两者共阳性率为8.50%。T0代转基因植株的结实率能达到90%以上,且表现了多种异常现象。
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农杆菌介导玉米幼胚的遗传转化效率和愈伤组织的再生率一直是制约玉米转基因育种效率的主要原因。本文不仅探索了温度对农杆菌介导Hi-Ⅱ玉米幼胚遗传转化效率的影响，还对愈伤组织的再生体系进行了优化。获得结果如下： （1）发现在农杆菌侵染前，42℃热激幼胚3分钟和38℃热激幼胚9分钟都可以有效提高遗传转化效率，并且可以利用新定义的有效积温理论来解释该现象； （2）发现体细胞诱导养基中，60-90g/L的蔗糖浓度、500mg/L的CH浓度可以促进愈伤组织再分化形成体细胞胚； （3）发现生根培养基中，0.5mg/L的NAA浓度促进不定根的发生，2mg/L的MET浓度促进侧根的发生和不定根的快速伸长，此外，MET还有壮苗的功能； （4）利用优化的再生体系，成功把12个转基因事件的愈伤组织培育成植株，并自交得到全部12个事件的T1代种子，并利用荧光实时定量PCR，成功筛选到一个表达相对较高的转基因事件。
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农杆菌介导玉米幼胚的遗传转化效率和愈伤组织的再生率一直是制约玉米转基因育种效率的主要原因。本文不仅探索了温度对农杆菌介导Hi-Ⅱ玉米幼胚遗传转化效率的影响，还对愈伤组织的再生体系进行了优化。获得结果如下： （1）发现在农杆菌侵染前，42℃热激幼胚3分钟和38℃热激幼胚9分钟都可以有效提高遗传转化效率，并且可以利用新定义的有效积温理论来解释该现象； （2）发现体细胞诱导养基中，60-90g/L的蔗糖浓度、500mg/L的CH浓度可以促进愈伤组织再分化形成体细胞胚； （3）发现生根培养基中，0.5mg/L的NAA浓度促进不定根的发生，2mg/L的MET浓度促进侧根的发生和不定根的快速伸长，此外，MET还有壮苗的功能； （4）利用优化的再生体系，成功把12个转基因事件的愈伤组织培育成植株，并自交得到全部12个事件的T1代种子，并利用荧光实时定量PCR，成功筛选到一个表达相对较高的转基因事件。
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DOI:10.7666/d.y385779URL [本文引用: 1]
培育和利用抗除草剂品种是当前控制杂草危害和提高作物产量的有效措 施之一。而对现有的谷子抗除草剂基因Srf进行分子标记研究将极大地促进谷 子抗除草剂育种的进程。 本研究对谷子F_2代分离群体进行了特异PCR和AFLP标记研究。研究目 的包括：1．筛选与抗除草剂基因Srf紧密连锁的分子标记，为进一步图位克隆 该基因做准备；2．建立一套适合于谷子应用的特异PCR和AFLP技术体系， 为同类研究提供参考。研究取得了以下结果： 1．利用AFLP银染检测方法，采用4碱基切点的MseI和6碱基切点的 EcoRI双酶切，对谷子F_2代群体进行AFLP分析。随机选择330对AFLP引物 组合对F_2群体的抗除草剂基因池和感除草剂基因池进行分析，发现有22对引 物组合的扩增产物在两池间揭示出多态性。随后对这22对引物组合的多次重 复性验证结果显示，只有引物M55/E15和M55/E14能够在亲本及抗、感基因 池间扩增出稳定的多态性带。引物组合M55/E15在抗除草剂基因池中扩增出 分子量为284bp的条带（AP1_(284)），而感除草剂基因池中没有此标记。引物组 合M55/E14在抗除草剂基因池中扩增出一条分子量为350bp的条带（AP2_(350)）， 而感除草剂基因池中没有此标记。群体分析表明，AP1_(284)和AP2_(350)与抗除草 剂基因Srf连锁，但连锁的程度不同。标记AP1_(284)和标记AP2_(350)均位于抗除草 剂基因Srf的一侧，标记AP1_(284)与基因Srf的连锁关系较远，遗传距离为 7.350cM；标记AP2_(350)与基因Srf的连锁关系较近，遗传距离为3.593cM；两 个标记之间的遗传距离为3.757cM。此外，建立了一套适合于谷子AFLP分析 的反应体系及程序。 2．选用10对特异引物，对F_2代分离群体进行PCR扩增。在抗、感亲本 和抗、感DNA池间均扩增出1kb左右的带，但未发现与抗除草剂基因连锁的 PCR标记。建立了一套适合于谷子特异PCR分析的反应体系及程序，为以后 进行相关的研究打下了良好的基础。
DOI:10.7666/d.y385779URL [本文引用: 1]
培育和利用抗除草剂品种是当前控制杂草危害和提高作物产量的有效措 施之一。而对现有的谷子抗除草剂基因Srf进行分子标记研究将极大地促进谷 子抗除草剂育种的进程。 本研究对谷子F_2代分离群体进行了特异PCR和AFLP标记研究。研究目 的包括：1．筛选与抗除草剂基因Srf紧密连锁的分子标记，为进一步图位克隆 该基因做准备；2．建立一套适合于谷子应用的特异PCR和AFLP技术体系， 为同类研究提供参考。研究取得了以下结果： 1．利用AFLP银染检测方法，采用4碱基切点的MseI和6碱基切点的 EcoRI双酶切，对谷子F_2代群体进行AFLP分析。随机选择330对AFLP引物 组合对F_2群体的抗除草剂基因池和感除草剂基因池进行分析，发现有22对引 物组合的扩增产物在两池间揭示出多态性。随后对这22对引物组合的多次重 复性验证结果显示，只有引物M55/E15和M55/E14能够在亲本及抗、感基因 池间扩增出稳定的多态性带。引物组合M55/E15在抗除草剂基因池中扩增出 分子量为284bp的条带（AP1_(284)），而感除草剂基因池中没有此标记。引物组 合M55/E14在抗除草剂基因池中扩增出一条分子量为350bp的条带（AP2_(350)）， 而感除草剂基因池中没有此标记。群体分析表明，AP1_(284)和AP2_(350)与抗除草 剂基因Srf连锁，但连锁的程度不同。标记AP1_(284)和标记AP2_(350)均位于抗除草 剂基因Srf的一侧，标记AP1_(284)与基因Srf的连锁关系较远，遗传距离为 7.350cM；标记AP2_(350)与基因Srf的连锁关系较近，遗传距离为3.593cM；两 个标记之间的遗传距离为3.757cM。此外，建立了一套适合于谷子AFLP分析 的反应体系及程序。 2．选用10对特异引物，对F_2代分离群体进行PCR扩增。在抗、感亲本 和抗、感DNA池间均扩增出1kb左右的带，但未发现与抗除草剂基因连锁的 PCR标记。建立了一套适合于谷子特异PCR分析的反应体系及程序，为以后 进行相关的研究打下了良好的基础。
