毛艇^1,2, 李旭², 李振宇^2,*, 徐正进^1,*
1沈阳农业大学水稻研究所, 辽宁沈阳 110866

²辽宁省盐碱地利用研究所, 辽宁盘锦 124010

^*通讯作者(Corresponding authors):李振宇, E-mail:lyskjb@126.com; 徐正进, E-mail:xuzhengjin@126.com 第一作者联系方式:E-mail:chinamaoting1985@163.com
收稿日期:2017-07-23 基金:本研究由辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划(2015035, 2015036)和国家自然科学基金项目(31371587, 31430062)资助

摘要直链淀粉含量是影响稻米食味品质的重要因素, 主要由蜡质基因( Wx)调控, Wx基因座存在 Wx^a、 Wx^b、 Wxⁱⁿ、 Wx^mw等多个复等位基因, 通过分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)培育中低直链淀粉含量的水稻品种是提高稻米适口性的重要途径。 Wx复等位基因的功能由单碱基核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)决定, 其检测依赖于测序或酶切, 存在耗时多、费用昂贵等缺点。为提高选择效率, 本文利用 Wx复等位基因的SNP差异和四引物扩增受阻突变(tetra-primer ARMS-PCR)原理, 进行PCR功能标记的开发。引物设计过程中, 针对扩增效率低和非匹配的延伸2个技术难题, 提出了调整错配位点的解决方案, 成功开发了基于PCR技术的两对功能性标记Waxy^gt-ARMS²和Waxy^ac-ARMS², 可以准确区分上述复等位基因型, 且具有操作简单、耗费较低的特点。利用新开发标记对辽宁省育成的部分水稻品种进行 Wx基因型检测的结果表明, 40份辽宁育成品种均携带 Wx^b基因, 遗传基础单一。上述结果为利用 Wx基因位点的分子标记培育中低直链淀粉含量的水稻品种, 改良辽宁省水稻品种的食味品质提供了技术支撑。

关键词:水稻; 蜡质基因; 四引物扩增受阻突变体系; 直链淀粉含量; 稻米食味品质改良
Development of PCR Functional Markers for Multiple Alleles of Wx and Their Application in Rice
MAO Ting^1,2, LI Xu², LI Zhen-Yu^2,*, XU Zheng-Jin^1,*
1Rice Research Institute, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

²Liaoning Province Saline and Alkaline Land Utilization and Research Institute, Panjin 124010, China

Fund:This study was supported by the Cultivation Plan for Youth Agricultural Science Technology Innovative Talents of Liaoning Province (2015035, 2015036) and the Natural Science Foundation of China (31371587, 31430062)
AbstractAmylose content (AC) is one of the most important factors impacting rice eating quality, which was mainly determined by Wx locus. Multiple alleles, such as Wx^a, Wx^b, Wxⁱⁿ, and Wx^mw contribute to the variation of AC in rice varieties. Selecting rice varieties with low-medium AC through Marker-assisted selection (MAS) is an important way to improve rice eating quality. However, distinguishing the Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) of Wx alleles requires the DNA sequencing or restriction enzyme digestion, which is time consuming and labor-intensive. In this study, we developed effective MAS markers by tetra-primer ARMS-PCR technology utilizing functional SNPs corresponding to the different alleles, moreover we put forward corresponding solving schemes on low amplification efficiency and inaccuracy extension through adjusting the location of deliberate mismatch bases introduced. We easily differentiated the multiple alleles of Wx utilizing the markers Waxy^gt-ARMS² and Waxy^ac-ARMS², showing that these markers have significant application value with the features of rapid operation and low cost. We further analyzed the genotype distribution of Wx allele in Liaoning Province rice varieties, and found all of the forty tested varieties carried the Wx^b allele with a narrow genetic diversity. The results of this study could provide theoretical basis and technical support on both new rice varieties breeding and rice eating quality improvement utilizing Wx alleles corresponding to low-medium AC by MAS in Liaoning Province.

Keyword:Rice; Wx; Tetra-primer ARMS-PCR; Amylose content; Rice eating quality improvement
Show Figures
Show Figures








食味品质改良是提高稻米商品价值的重要途径^{[1, 2, 3]}。水稻胚乳中的直链淀粉含量与食味品质关系密切, 直链淀粉含量高, 米饭黏性小、硬度大、蓬松干燥, 适口性差^{[4, 5, 6]}。调控直链淀粉含量的主效基因为蜡质基因Wx^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]}, 该基因座上存在多个复等位基因^{[11, 13, 16]}, wx存在于糯稻中; Wx^a多存在于籼稻中, 含有该基因的水稻品种直链淀粉含量普遍偏高, 约为20%~28%; Wx^b主要存在于粳稻中, 直链淀粉含量对应为15%~19%; 其他几种复等位基因如Wxⁱⁿ、Wx^mw、Wx^mq、Wx^op、Wx^mp等则存在于特定品种中并导致直链淀粉含量不同程度的降低^{[11, 13, 16]}。利用上述低直链淀粉基因进行稻米品质改良, 已取得了显著成效^{[2, 9, 11, 13, 14, 15, 16]}。
目前, 上述Wx复等位基因的序列差异都已明确。Wx基因座第1内含子+1位G-T的SNP (下称SNP1)多态性形成了Wx^a及Wx^b两种基因型^{[14, 15]}, 蔡秀玲等^{[15, 17]}通过设计酶切引物PCR-AccI来区分相应的基因型。Wx^a基因型材料中第6内含子1132 bp处A-C的SNP多态性(下称SNP2)形成了Wxⁱⁿ基因^[11], Wx^b基因型同样位点的SNP突变被命名为Wx^mw基因^[13]; 倪晖^[13]通过设计2对STS标记并结合酶切标记PCR-AccI对上述基因型实现鉴定。然而, 这些标记的检测方法具有费用昂贵、操作复杂、耗时较长等缺点, 不适合MAS工作中大量材料的筛选。
Tetra-primer ARMS-PCR是近年来建立在普通PCR和ARMS-PCR基础之上开发的一种专用于检测单核苷酸突变的衍生技术^{[18, 19, 20]}, 是一种共显性标记, 由于其操作简便, 耗费较低, 被广泛应用在医学、动植物等领域SNP的多态性检测^{[19, 20, 21]}。Tetra-primer ARMS-PCR类型引物扩增过程中, 由于4条引物存在于同一PCR体系中, 经常出现扩增效率低及非匹配的延伸情况, 降低了检测的准确性^{[18, 19]}。Ye等^[19]提出通过严格控制退火温度来增强检测的准确性, 但该方案仅适合于4条引物的解链温度差异较小的情况。在4条引物的解链温度差异较大状态下, 其引物设计策略及扩增条件尚需进一步探索。
本文利用tetra-primer ARMS-PCR技术开发了鉴定Wx复等位基因的功能性标记, 并对引物设计策略深入探讨。进一步利用新开发标记对辽宁省部分育成水稻品种进行Wx位点基因型分析, 提出针对性的食味品质改良策略。以期为Wx位点的分子辅助选择及Tetra-primer ARMS-PCR类型引物设计提供技术支撑。
1 材料与方法1.1 供试水稻材料供试材料包括Wx基因座上已鉴定携带Wx^a、Wx^b、Wxⁱⁿ、Wx^mw对照材料4份^{[13, 15]}(表1), 辽宁省近20年审定品种40个。上述材料于2014— 2015年连续2个生长季种植于辽宁省盐碱地利用研究所试验田(辽宁盘锦)。随机区组设计, 3次重复, 小区面积10 m², 行株距为30.0 cm × 13.3 cm。2014年4月13日播种, 5月19日移栽; 2015年4月15日播种, 5月21日移栽。施氮225 kg hm^-2、P₂O₅ 105 kg hm^-2、K₂O 45 kg hm^-2。其他栽培管理同当地生产田。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 Wx位点不同复等位基因对照材料 Table 1 Different alleles ofWxin control varieties 编号 Code 品种 Variety 亚种属性 Subspecies 来源 Origin 基因型 Genotype 1 魔王谷 Mowanggu Japonica 中国云南Yunnan, China Wxmw 2 IR64 Indica 菲律宾 Philippines Wxin 3 秋光 Akihikari Japonica 日本 Japan Wxb 4 特青 Teqing Indica 中国广东Guangdong, China Wxa

表1 Wx位点不同复等位基因对照材料 Table 1 Different alleles ofWxin control varieties

1.2 直链淀粉含量测定利用精米样品粉碎后的米粉, 通过0.25 mm孔径的筛, 得到供试样品3 g。按照部颁标准NY147-88进行测定, 每个样品测定3次, 取平均值。
1.3 标记设计策略1.3.1 SNP1功能分子标记设计策略 根据蔡秀玲等^[15]研究的相关信息, 在NCBI查找克隆序列(登录号为AF141954), 利用Tetra-primer ARMS-PCR原理, 构建SNP1两对候选功能性标记Waxy^tg-ARMS¹及Waxy^tg- ARMS²。首先, 利用Ye等^[19]提供的在线引物软件(http:// cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1)进行Waxy^tg-ARMS¹的构建(图1-A):设计1对外引物Waxy^tg-ARMS¹-O-F和Waxy^tg-ARMS¹-O-R扩增包含突变位点的整个片段; 再根据G-T的SNP多态性设计2条内引物Waxy^tg-ARMS¹-I-F和Waxy^tg-ARMS¹-I-R, 其3° 端分别对应于碱基T和G, 于Waxy^tg-ARMS¹-I-F的3′ 末端-3位人为引入1个错配碱基C, 于Waxy^tg-ARMS¹-I-R 的3′ 末端-3位人为引入1个错配碱基G (表2)。
Waxy^tg-ARMS²的构建中(图1-A), 外引物设计与Waxy^tg-ARMS¹相同, 内引物引入错配策略不同, 于Waxy^tg-ARMS²-I-F的3′ 末端-2位人为引入一个错配碱基T, Waxy^tg-ARMS²-I-R中未引入错配碱基(表2)。
1.3.2 SNP2功能分子标记设计策略 根据倪晖等^[13]研究的相关信息, 在NCBI查找克隆序列(登录号为AF141954), 根据Tetra-primer ARMS-PCR原理, 构建SNP2两对候选功能性标记Waxy^ac-ARMS¹及Waxy^ac- ARMS²。首先, 利用Ye等^[19]提供的在线引物软件(http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1)进行Waxy^ac-ARMS¹的构建(图1-B):设计1对外引物Waxy^ac-ARMS¹-O-F和Waxy^ac-ARMS¹-O-R扩增包含突变位点的整个片段; 再根据A-C的SNP多态性设计2条内引物Waxy^ac-ARMS¹-I-F和Waxy^ac-ARMS¹-I-R, 其3° 端分别对应于碱基A和C, 于Waxy^ac-ARMS¹-I-F的3′ 末端-3位人为引入1个错配碱基C, 于Waxy^ac-ARMS¹-I-R 的3′ 末端-3位人为引入1个错配碱基T (表2)。
Waxy^ac-ARMS²的构建中(图1-B), 外引物设计与Waxy^ac-ARMS¹相同, 内引物引入错配策略不同, 于Waxy^ac-ARMS²-I-F的3′ 末端-2位人为引入1个错配碱基G, 于Waxy^ac-ARMS²-I-R的3′ 末端-2位人为引入1个错配碱基C (表2)。
图1
Fig. 1

Figure OptionViewDownloadNew Window

图1 引物设计策略 A为SNP1引物设计策略, B为SNP2引物设计策略, 功能性SNP多态性位点用红色表示, 添加底纹背景的碱基表示引物结合位点, 绿色实线箭头表示引物扩增方向, 红色虚线箭头表示不能有效扩增。Fig. 1 Strategy of primer design A:design strategies for SNP1; B:design strategies for SNP2, functional SNPs are shown in red, gray background shows primers’ binding site, the green full arrows indicate the primers’ amplification direction, the red short dash arrows indicate the primer could not amplify effectively.

1.4 DNA提取、PCR扩增及电泳检测全基因组DNA选用全式金生物技术有限公司的植物DNA提取试剂盒提取(具体操作按照产品说明)。
20 μ L PCR体系包括:DNA 0.5 μ L (50 ng μ L^-1), Primer 2.0 μ L (4 pmol μ L^-1, 内外引物浓度比为1.5∶ 1.0), 2 × PCR Master Mix 10.0 μ L (带染料, 北京康为世纪生物科技有限公司), ddH₂O 7.5 μ L。
反应程序为:95℃预变性5 min; 然后95℃变性30 s、56℃复性30 s (表2)、72℃延伸30 s, 30次循环; 72℃延伸10 min; 4℃冷却10 min后, 反应产物在3%或5%琼脂糖凝胶上100 V电泳1 h; 经溴化乙锭(ethidium bromide, EB)染色后于凝胶成像系统下观察, 记录。
表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 设计引物基本信息 Table 2 Molecular markers desigaed in this study

表2 设计引物基本信息 Table 2 Molecular markers desigaed in this study

2 结果与分析2.1 候选标记PCR体系的优化Tetra-primer ARMS-PCR技术由于4条引物于同一PCR体系中扩增, 扩增条件较为苛刻^{[18, 19, 20]}, 需要由退火温度及内外引物浓度比进行体系优化。
在利用标记Waxy^gt-ARMS¹进行对照品种检测过程中, 不同退火温度下均不能得到正确检测结果(图2-A):当测试品种为特青时, 对应的产物条带不仅非常模糊, 而且还会出现对应为秋光的产物带型, 不能正确区分两种等位基因型; 这可能是扩增效率较低及非完全匹配的延伸造成的。在利用标记Waxy^ac-ARMS¹进行对照品种检测过程中(图2-B), 对照材料的条带未体现出差异; 推测为非完全匹配的延伸造成的。
针对引物Waxy^gt-ARMS², 首先利用梯度PCR仪于55~72℃进行退火温度筛选, 在退火温度大于61℃时基本无扩增产物。缩小温度范围, 在55.1~59.1℃间进行温度筛选, 在55.8℃时条带最为清晰(图2-C), 重复3次, 得到同样的结果。针对引物Waxy^ac-ARMS², 同样利用梯度PCR仪于55~72℃进行退火温度筛选, 在退火温度大于60℃时基本无扩增产物。缩小温度范围, 在55.1~ 59.1℃间进行温度筛选, 在56.3℃时条带最为清晰(图2-D), 重复3次, 得到同样的结果。可以看出两对引物最佳退火温度差异较小, 我们将退火温度设置在56℃, 以便于进一步的试验操作。
Tetra-primer ARMS-PCR中, 引物的相对浓度对结果也可能产生影响^[19], 前人研究中内外引物浓度比多为1∶ 1, 也有人提出10∶ 1为最优浓度比^{[18, 19, 20]}。本文设置了一系列内外引物浓度比(10∶ 1, 5∶ 1, 1.5∶ 1, 1∶ 1, 1∶ 1.5, 1∶ 5, 1∶ 10), 发现除引物二聚体多少不同外, 带型结果基本无差异(图略), 内外引物比为1.5∶ 1时较少引物二聚体出现, 确定为最适内外引物比例。
2.2 候选标记的准确性验证由于Waxy^gt-ARMS²及Waxy^ac-ARMS²通过PCR体系优化后可扩增出清晰条带, 下文进一步通过对比序列信息及直链淀粉含量验证标记的准确性。
利用Waxy^gt-ARMS²-O-F及Waxy^gt-ARMS²-O-R作为1对引物进行序列测定时发现, 对照品种Teqing/IR64与Akihikari/Mowanggu除了G-T的SNP 多态性外, 另有10 bp的InDel差异(图1-A), 但不是功能性差异。当SNP1位点为G时(Wx^a或Wxⁱⁿ基因型), 扩增出287 bp/143 bp条带。当SNP1位点为T时(Wx^b或Wx^mw基因型), 扩增出297 bp/198 bp条带(图3-A)。因此, 利用Waxy^gt-ARMS²标记可以对Wx^a/Wxⁱⁿ和Wx^b/Wx^mw等位基因型进行有效区分。
利用Waxy^ac-ARMS²标记可以对Wx^a/Wx^b与Wxⁱⁿ/Wx^mw基因型进行区分, 当SNP2位点为A时(Wx^a/Wx^b基因型), 扩增出185 bp/113 bp条带; 当SNP2位点为C时(Wxⁱⁿ/Wx^mw基因型), 扩增出185 bp/126 bp条带(图3-B)。利用Waxy^ac-ARMS²-O-F和Waxy^ac-ARMS²- O-R作为一对引物进行序列测定, 验证了标记的准确性(图1-B)。
结合Waxy^gt-ARMS²和Waxy^ac-ARMS²两对引物可以完全鉴定出Wx^a、Wx^b、Wxⁱⁿ和Wx^mw四种等位基因(图3):利用Waxy^gt-ARMS²和Waxy^ac-ARMS²同时检测, 如果先后出现287 bp/143 bp、185 bp/113 bp为Wx^a基因型; 而出现297 bp/198 bp、185 bp/113 bp条带为Wx^b基因型; 如果先后出现287 bp/143 bp、185 bp/126 bp条带, 为Wxⁱⁿ基因型; 而出现297 bp/198 bp、185 bp/126 bp条带, 则为Wx^mw基因型; 这与对照品种直链淀粉含量的测定结果也是完全吻合的(表3)。
图2
Fig. 2

Figure OptionViewDownloadNew Window

图2 候选标记在不同退火温度下的表现 M为marker 2000。A为Waxygt-ARMS1在不同退火温度下的表现, 在每一退火温度组, 前泳道为秋光, 后泳道为特青, B为Waxyac-ARMS1在不同退火温度下的表现, 在每一退火温度组, 前泳道为魔王谷, 后泳道为秋光, C为Waxygt-ARMS2在不同退火温度下的表现, 在每一退火温度组, 前泳道为秋光, 后泳道为特青, D为Waxyac-ARMS2在不同退火温度下的表现, 在每一退火温度组, 前泳道为魔王谷, 后泳道为秋光。Fig. 2 Molecular detections on the control varieties between different annealing temperatures M indicates marker 2000. A:PCR product on different annealing temperature (° C) using the Waxygt-ARMS1 marker, on every groups of annealing temperatures, the former lane is ‘ Akihikari’ , later lane is ‘ Teqing’ . B:PCR product on different annealing temperature (° C) using the Waxyac-ARMS1 marker, on every groups of annealing temperatures, the former lane is ‘ Mowanggu’ , later lane is ‘ Akihikari’ . C:PCR product on different annealing temperature (° C) using the Waxygt-ARMS2 marker, on every groups of annealing temperatures, the former lane is ‘ Akihikari’ , later lane is ‘ Teqing’ . D:PCR product on different annealing temperature (° C) using the Waxyac-ARMS2 marker, on every groups of annealing temperatures, the former lane is ‘ Mowanggu’ , later lane is ‘ Akihikari’ .

图3
Fig. 3

Figure OptionViewDownloadNew Window

图3 利用Waxygt-ARMS2和Waxyac-ARMS2对对照品种进行基因型分析 M为marker 2000。A为利用Waxygt-ARMS标记分析结果, B为利用Waxyac-ARMS标记分析结果; 5条泳道由左至右分别为marker 2000、魔王谷、IR 64、秋光和特青。Fig. 3 Genotype analysis on control varieties utilizing Waxygt-ARMS2and Waxyac-ARMS2 M indicates marker 2000. A:PCR product of Waxygt-ARMS2 marker. B:PCR product of Waxyac-ARMS2 marker. Lanes from left to right are marker 2000, Mowanggu, IR64, Akihikari, and Teqing.

2.3 辽宁育成品种的等位基因型检测利用Waxy^gt-ARMS²和Waxy^ac-ARMS²对辽宁省40份审定水稻品种进行Wx位点复等位基因Wx^a、Wx^b、Wxⁱⁿ、Wx^mw基因型分析, 这些品种均为Wx^b基因型(表3)。直链淀粉含量为15.3%~19.1%, 均值17.1%, 为中等直链淀粉含量水稻品种, 表明Wx位点遗传基础单一。
表3
Table 3
表3(Table 3)

表3 供试品种Wx基因型及直链淀粉含量 Table 3 Wx genotype and amylose content in tested varieties 编号 Code 品种(系) Variety (line) 等位基因型 Alleles Waxy genotype 直链淀粉含量 Amylose content (%) 1 魔王谷 Mowanggu Wxmw 14.1 2 IR 64 Wxin 18.9 3 秋光 Akihikari Wxb 17.9 4 特青 Teqing Wxa 24.3 5 沈农265 Shennong 265 Wxb 16.2 6 辽粳294 Liaojing 294 Wxb 17.8 7 盐粳68 Yanjing 68 Wxb 16.8 8 盐粳933 Yanjing 933 Wxb 18.2 9 盐粳98 Yanjing 98 Wxb 17.3 10 盐粳188 Yanjing 188 Wxb 19.0 11 盐粳48 Yanjing 48 Wxb 16.3 12 盐粳218 Yanjing 218 Wxb 17.3 13 盐粳228 Yanjing 228 Wxb 16.5 14 盐粳927 Yanjing 927 Wxb 16.9 15 盐粳939 Yanjing 939 Wxb 18.2 16 辽盐166 Liaoyan 166 Wxb 19.1 17 桥科951 Qiaoke 951 Wxb 16.9 18 盐丰47 Yanfeng 47 Wxb 15.3 19 龙盘5号 Longpan 5 Wxb 15.6 20 辽星1号 Liaoxing 1 Wxb 17.1 21 辽星21 Liaoxing 21 Wxb 17.2 22 辽粳9号 Liaojing 9 Wxb 16.5 23 辽粳371 Liaojing 371 Wxb 16.9 24 盐粳50 Yanjing 50 Wxb 16.9 25 盐粳16 Yanjing 16 Wxb 17.2 26 辽盐2号 Liaoyan 2 Wxb 16.2 27 盐粳456 Yanjing 456 Wxb 15.4 28 沈农9816 Shennong 9816 Wxb 17.7 29 沈农9903 Shennong 9903 Wxb 16.6 30 港源8号 Gangyuan 8 Wxb 16.9 31 铁粳11 Tiejing 11 Wxb 16.6 32 铁粳7号 Tiejing 7 Wxb 16.5 33 辽粳5号 Liaojing 5 Wxb 16.9 34 辽粳326 Liaojing 326 Wxb 17.1 35 LDC 119 Wxb 18.8 36 抗盐100 Kangyan 100 Wxb 17.5 37 辽盐241 Liaoyan 241 Wxb 17.2 38 铁粳12 Tiejing 12 Wxb 17.0 39 铁粳9号 Tiejing 9 Wxb 17.5 40 富禾90 Fuhe 90 Wxb 17.6 41 美锋9号Meifeng 9 Wxb 18.5 42 美锋1号Meifeng 1 Wxb 18.7 43 铁粳6号Tiejing 6 Wxb 16.1 44 沈农606 Shennong 606 Wxb 17.5

表3 供试品种Wx基因型及直链淀粉含量 Table 3 Wx genotype and amylose content in tested varieties

3 讨论Andersen等^[22]于2003年提出功能性标记(Functional marker)的概念, 将其定义为可完全体现基因功能性碱基差异的标记。与连锁标记相比, 由于较少假阳性的产生, 被广泛应用于MAS工作中^{[23, 24]}。目前, 被证明为SNP多态性的基因越来越多, 功能性SNP引物构建成为研究热点^[22]。由于SNP差异无法基于片段缺失的InDel标记体现, 测序或酶切价格昂贵, 耗时较长, 不适合MAS工作大量试验材料的检测。Tetra-primer ARMS-PCR技术的提出较好地解决了上述问题, 但在该类型引物扩增过程中, 由于内引物的位置相对固定, 引物间解链温度值差异很难消除。由此经常出现扩增效率低及非匹配的延伸的问题, 限制了其进一步的应用^{[18, 19, 20]}。
文中2个SNP位点两端GC含量差异均较大, 造成了其内引物解链温度的显著差异(11℃)。利用Ye等^[19]提供的引物设计软件, 我们开发了Waxy^gt-ARMS¹及Waxy^ac-ARMS¹两对候选引物。但出现了扩增效率较低以及非完全匹配延伸问题, 我们试图通过退火温度的筛选加以解决, 但未能成功。通过调整错配位点, 我们继续开发了2对候选引物Waxy^gt-ARMS²及Waxy^ac-ARMS², 可以对Wx位点4种复等位基因准确鉴定。综合分析, 在扩增效率较低情况下, 应不引入错配, 或远离3′ 端引入错配; 非完全匹配的延伸情况下, 应更靠近3′ 端引入错配。错配位点设计合理情况下优化扩增条件为上佳选择。上述结果对Tetra-primer ARMS-PCR类型引物设计具有重要指导意义。
通过开发2对引物对Wx位点4种复等位基因进行鉴定, 略显繁琐。但在实际MAS应用中, 我们仅需要利用这2对引物进行亲本基因型的准确鉴定, 而后仅1对引物就可以对试验材料进行追踪。如需改良亲本携带Wx^a基因, 供体亲本分别携带Wxⁱⁿ、Wx^b、Wx^mw基因, 我们可以分别利用Waxy^ac-ARMS²、Waxy^gt-ARMS²和Waxy^ac-ARMS²鉴定, 相比于酶切或测序, 大大降低了鉴定成本, 提高了选择效率。
江苏省农业科学院通过引入源于关东194的低直链淀粉基因Wx^mq, 育成南粳46、南粳5055、南粳9108等一系列品种^{[4, 16]}, 直链淀粉含量在10%左右, 食味品质极佳。倪晖^[13]通过将来源于魔王谷的低直链淀粉基因Wx^mw引入到日本晴中, 获得一批直链淀粉含量14%左右材料, 食味品质相比日本晴显著提升。辽宁稻区历来为我国优质粳稻产区^{[25, 26]}, 中等直链淀粉含量为该稻区的优异适口性贡献较大。文中显示辽宁育成品种均为Wx^b基因型, 遗传基础单一, 且相比于适口性更优的品种如越光、关东194、南粳46等仍存在一定差距。亟待通过引入低直链淀粉含量基因进一步改良其适口性。由于Wx^mq基因材料直链淀粉含量普遍偏低, 具有暗胚乳特性, 对稻米的透明度存在一定的影响。且由于饮食习惯的差异, 相比于长江中下游粳稻区特别是江苏、上海及浙江等地居民, 东北稻区人们可能更偏爱吃直链淀粉含量相对Wx^mq基因较高的优质粳米^[26]。因此, 辽宁稻区可以考虑通过杂交和回交的方式将魔王谷中的Wx^mw基因导入辽宁粳稻品种中, 通过适当降低稻米胚乳直链淀粉含量来改良稻米品质, 我们将就此问题继续开展研究。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


参考文献View Option
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1]	Li Y B, Fan C C, Xing Y Z, Yun P, Luo L J, Yan B, Peng B, Xie W B, Wang G W, Li X H, Xiao J H, Xu C G, He Y Q. Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphatase influencing grain chalkiness in rice. Nat Genet, 2014, 46:398-404[本文引用:1]
[2]	Zeng D L, Tian Z X, Rao Y C, Dong G J, Yang Y L, Huang L C, Leng Y J, Xu J, Sun C, Zhang G H, Hu J, Zhu L, Gao Z Y, Hu X M, Guo L B, Xiong G S, Wang Y H, Li J Y, Qian Q. Rational design of high-yield and superior-quality rice. Nat Plants, 2017, 3:17031[本文引用:2]
[3]	吴长明, 孙传清, 付秀林, 王象坤, 李自超, 张强. 稻米品质性状与产量性状及籼粳分化度的相互关系研究. 作物学报, 2003, 29:822-828 Wu C M, Sun C Q, Fu X L, Wang X K, Li Z C, Zhang Q. Study on the relationship between quality, yield characters or indica- japonica differentiation in rice (Oryza sativa L. ). Acta Agron Sin, 2003, 29:822-828 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[4]	王才林, 陈涛, 张亚东, 朱镇, 赵凌, 林静. 通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种. 中国水稻科学, 2009, 23:25-30 Wang C L, Chen T, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao L, Lin J. Breeding of a new rice variety with good eating quality by marker assisted selection. Chin J Rice Sci, 2009, 23:25-30 (in Chinese with English abstract)[本文引用:2]
[5]	隋炯明, 李欣, 严松, 严长杰, 张蓉, 汤述翥, 陆驹飞, 陈宗祥, 顾铭洪. 稻米淀粉 RVA 谱特征与品质性状相关性研究. 中国农业科学, 2005, 38:657-663 Sui J M, Li X, Yan S, Yan C J, Zhang R, Tang S Z, Lu J F, Chen Z X, Gu M H. Studies on the rice RVA profile characteristics and its correlation with the quality. Sci Agric Sin, 2005, 38:657-663 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[6]	Sano Y. Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm. Theor Appl Genet, 1984, 68:467-473[本文引用:1]
[7]	Ayres N M, McClung A M, Larkin P D, Bligh H F J, Jones C A, Park W D. Microsatellites and a single-nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germ plasm. Theor Appl Genet, 1997, 94:773-781[本文引用:1]
[8]	Mikami I, Aikawa M, Hirano H Y, Sano Y. Altered tissue-specific expression at the Wx gene of the opaque mutants in rice. Euphytica, 1999, 105:91-97[本文引用:1]
[9]	Wang Z Y, Zheng F Q, Shen G Z, Gao J P, Snustad D P, Li M G, Zhang J L, Hong M M. The amylose content in rice endosperm is related to the post-transcriptional regulation of the waxy gene. Plant J, 1995, 7:613-622[本文引用:2]
[10]	Yamanaka S, Nakamura I, Watanabe K N, Sato Y I. Identification of SNPs in the waxy gene among glutinous rice cultivars and their evolutionary significance during the domestication process of rice. Theor Appl Genet, 2004, 108:1200-1204[本文引用:1]
[11]	朱霁晖, 张昌泉, 顾铭洪, 刘巧泉. 水稻Wx基因的等位变异及育种利用研究进展. 中国水稻科学, 2015, 29:431-438 Zhu J H, Zhang C Q, Gu M H, Liu Q Q. Progress in the allelic variation of Wx gene and its application in rice breeding. Chin J Rice Sci, 2015, 29:431-438 (in Chinese with English abstract)[本文引用:5]
[12]	Mikami I, Uwatoko N, Ikeda Y, Yamaguchi J, Hirano H Y, Suzuki Y, Sano Y. Allelic diversification at the wx locus in land races of Asian rice. Theor Appl Genet, 2008, 116:979-989[本文引用:1]
[13]	倪晖. 水稻Wx基因不同等位变异的效应及其育种应用的初步研究. 扬州大学硕士学位论文, 江苏扬州, 2013 Ni H. A Preliminary Analysis of the Effect of different Wx Alleles on Rice Grain Quality. MS Thesis of Yangzhou University, Yangzhou, China, 2013 (in Chinese with English abstract)[本文引用:9]
[14]	刘巧泉, 蔡秀玲, 李钱锋, 汤述翥, 龚志云, 于恒秀, 严长杰, 王宗阳, 顾铭洪. 分子标记辅助选择改良特青及其杂交稻米的蒸煮与食味品质. 作物学报, 2006, 32:64-69 Liu Q Q, Cai X L, Li Q F, Tang S Z, Gong Z Y, Yu H X, Yan C J, Wang Z Y, Gu M H. Molecular marker-assisted selection for improving cooking and eating quality in Teqing and its hybrid rice. Acta Agron Sin, 2006, 32:64-69 (in Chinese with English abstract)[本文引用:3]
[15]	蔡秀玲, 刘巧泉, 汤述翥, 顾铭洪, 王宗阳. 用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记. 植物生理与分子生物学报, 2002, 28:137-144 Cai X L, Liu Q Q, Tang S Z, Gu M H, Wang Z Y. Development of a molecular marker for screening the rice cultivars with intermediate amylose content in Oryza sativa subsp. indica. J Plant Physiol Mol Biol, 2002, 28:137-144 (in Chinese with English abstract)[本文引用:6]
[16]	姚姝, 陈涛, 张亚东, 朱镇, 赵凌, 赵庆勇, 周丽慧, 王才林. 分子标记辅助选择聚合水稻暗胚乳突变基因Wx-mq和抗条纹叶枯病基因Stv-bi. 中国水稻科学, 2010, 24:341-347 Yao S, Chen T, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao L, Zhao Q Y, Zhou L H, Wang C L. Pyramiding of translucent endosperm mutant gene Wx-mq and rice stripe disease resistance gene Stv-bi by marker-assisted selection in rice (Oryza sativa). Chin J Rice Sci, 2010, 24:341-347 (in Chinese with English abstract)[本文引用:4]
[17]	田志喜, 严长杰, 钱前, 严松, 谢会兰, 王芳, 徐洁芬, 刘贵富, 王永红, 刘巧泉, 汤述翥, 李家洋, 顾铭洪. 水稻淀粉合成相关基因分子标记的建立. 科学通报, 2010, 55:2591-2601 Tian Z X, Yan C J, Qian Q, Yan S, Xie H L, Wang F, Xu J F, Liu F G, Wang Y H, Liu Q Q, Tang S Z, Li J Y, Gu M H. Development of gene-tagged molecular markers for starch synthesis-related genes in rice. Chin Sci Bull, 2010, 55:2591-2601 (in Chinese)[本文引用:1]
[18]	刘兴顺, 程牛亮, 梁小波, 赵彩虹. 四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应在SNP基因分型中的研究. 山西医科大学学报, 2008, 39:483-485 Liu X S, Cheng N L, Liang X B, Zhao C H. Study on tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction in SNP genotyping. J Shanxi Med Univ, 2008, 39:483-485 (in Chinese with English abstract)[本文引用:5]
[19]	Ye S, Dhillon S, Ke X, Collins A R, Day I N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucl Acids Res, 29:E88[本文引用:11]
[20]	陈涛, 骆名瑞, 张亚东, 朱镇, 赵凌, 赵庆勇, 周丽慧, 姚姝, 于新, 王才林. 利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq. 中国水稻科学, 2013, 27:529-534 Chen T, Luo M R, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao L, Zhao Q Y, Zhou L H, Yao S, Yu X, Wang C L. Detection of Wx-mq gene for low-amylose content by tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in rice. Chin J Rice Sci, 2013, 27:529-534 (in Chinese with English abstract)[本文引用:5]
[21]	Kim S R, Ramos J, Ashikari M, Virk P S, Torres E A, Nissila E, Hechanova S L, Mauleon R, Jena K K. Development and validation of allele-specific SNP/indel markers for eight yield-enhancing genes using whole-genome sequencing strategy to increase yield potential of rice, Oryza sativa L. Rice, 2016, 9:12[本文引用:1]
[22]	Andersen J R, Lübberstedt T. Functional markers in plants. Trends Plant Sci, 2003, 11:554-560[本文引用:2]
[23]	Hu B, Wang W, Ou S J, Tang J Y, Li H, Che R H, Zhang Z H, Chai X Y, Wang H R, Wang Y Q, Liang C Z, Liu L C, Piao Z Z, Deng Q Y, Deng K, Xu C, Liang Y, Zhang L H, Li L G, Chu C C. Variation in NRT1. 1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies. Nat Genet, 2015, 47:834-838[本文引用:1]
[24]	潘存红, 王子斌, 马玉银, 殷跃军, 张亚芳, 左示敏, 陈宗祥, 潘学彪. InDel和SNP标记在水稻图位克隆中的应用. 中国水稻科学, 2007, 21:447-453 Pan C H, Wang Z B, Ma Y Y, Yin Y J, Zhang Y F, Zuo S M, Chen Z X, Pan X B. InDel and SNP markers and their application in map-based cloning of rice genes. Chin J Rice Sci, 2007, 21:447-453 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[25]	Sun J, Liu D, Wang J Y, Ma D R, Tang L, Gao H, Xu Z J, Chen W F. The contribution of intersubspecific hybridization to the breeding of super-high-yielding japonica rice in northeast China. Theor Appl Genet, 2012, 125:1149-1157[本文引用:1]
[26]	陈温福, 徐正进, 张龙步, 张文忠, 马殿荣. 北方粳型稻超高产育种理论与实践. 中国农业科学, 2007, 40:869-874 Chen W F, Xu Z J, Zhang L B, Zhang W Z, Ma D R. Theories and practices of breeding japonica rice for super high yield. Sci Agric Sin, 2007, 40:869-874 (in Chinese with English abstract)[本文引用:2]