郝心愿^1,*, 岳川^1,2,*, 唐湖¹, 钱文俊¹, 王玉春¹, 王璐¹, 王新超^1,*, 杨亚军^1,*
1中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室, 浙江杭州31008

²福建农林大学园艺学院, 福建福州350002

^* 通讯作者(Corresponding authors): 王新超, E-mail: xcw75@tricaas.com, Tel: 0571-86653162; 杨亚军, E-mail: yjyang@tricaas.com 第一作者联系方式: E-mail: haoxy@tricaas.com, Tel: 0571-86653162
收稿日期:2017-02-13 接受日期:2017-05-10网络出版日期:2017-05-23基金:本研究由浙江省自然科学基金项目(LY16C160001), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-19)和中国农业科学院农业科技创新工程(CAAS-ASTIP-2017-TRICAAS)资助

摘要β-淀粉酶(BAM)是植物中参与淀粉水解的关键酶类, 在应对非生物胁迫中发挥重要作用。从前期茶树冷驯化转录组分析中分离到1个参与淀粉代谢的差异表达基因, cDNA全长克隆及序列分析鉴定该基因为拟南芥 BAM3同源基因, 命名为 CsBAM3。该基因编码548个氨基酸残基, 与拟南芥的BAM1和BAM3一起归为第II亚家族, 推测为叶绿体定位、具有淀粉水解活性的β-淀粉酶编码基因。启动子克隆及序列分析显示该基因可能受生理节律、光、低温及多种激素等信号共同调控。 CsBAM3在叶片中表达量最高, 茎和花中表达量较低, 根中基本不表达。 CsBAM3在冷驯化初期被显著上调且一直保持相对较高的水平。成熟叶片及嫩芽(一芽二叶)中的 CsBAM3均可以被4℃及0℃低温显著上调, 且嫩芽中基因的表达量上调幅度明显高于成熟叶。模拟倒春寒低温条件下, 检测不同萌发阶段新梢中 CsBAM3的表达情况表明, CsBAM3在鲜叶初展的嫩芽中即可快速受低温诱导。以上结果表明, CsBAM3是茶树中调控淀粉水解的一个重要β淀粉酶编码基因, 在茶树成熟叶和嫩芽受到不同低温胁迫时其表达可被快速诱导。

关键词:β; 淀粉酶; 茶树; 基因克隆; 低温胁迫; 表达调控
Cloning of β-amylase Gene ( CsBAM3) and Its Expression Model Response to Cold Stress in Tea Plant
HAO Xin-Yuan^1,**, YUE Chuan^1,2,**, TANG Hu¹, QIAN Wen-Jun¹, WANG Yu-Chun¹, WANG Lu¹, WANG Xin-Chao^1,*, YANG Ya-Jun^1,*
1 Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

² College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

Fund:This study was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY16C160001), the China Agriculture Research System (CARS-19), and the Chinese Academy of Agricultural Sciences through an Innovation Project for Agricultural Sciences and Technology (CAAS-ASTIP-2017-TRICAAS).
AbstractA major enzyme of starch breakdown in plant leaf, β-amylase (BAM), plays important roles in response to abiotic stresses. In tea plant, a differentially expressed gene involved in starch metabolism was identified from previous RNA-Seq analysis of cold acclimation. Its full-length cDNA was cloned and sequenced, showing that it is a homolog of BAM3 in Arabidopsis (named CsBAM3). CsBAM3 contains 548 amino acid residues and is grouped into subfamily II together with BAM1 and BAM3 from Arabidopsis. According to protein sequence and 3D structure analyses, CsBAM3 was considered as a chloroplast-targeted protein with β-amylase activity. Promoter cloning and sequence analysis showed a couple of responsive elements related to circadian, light, cold, and phytohormone, indicating its complex regulating mechanism. CsBAM3 showed the expression higher in leaf, relative lower in stem and flower and extremely low in root. The expression of CsBAM3 in mature leaf was significantly up-regulated during the early time courses of winter cold acclimation and maintained at relative high level during the following period. With the treatments of 4°C and 0°C, the transcript levels of CsBAM3 in both mature leaves and young shoots were dramatically increased, interestingly, much higher level was detected in young shoots. The cold environment similar to spring cold spell was created using climate chamber. And the expression changes of CsBAM3 in shoots were determined then after the tea plants were moved into climatic chamber at different sprouting phrases. CsBAM3 was quickly up-regulated by cold once the first leaf unfolded. Our study illuminated that CsBAM3 is a key β-amylase coding gene involved in starch metabolism of tea plant, which can be stimulated in both mature leaves and young shoots by cold stress.

Keyword:β; -amylase; Tea plant; Gene clone; Cold stress; Expression regulation
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我国大部分茶区冬季都存在较长时间的低温过程, 茶树品种的抗寒能力是影响其地理分布和安全越冬的重要指标^[1]。近年来随着早生茶树品种的广泛种植和气候变化的不断加剧, 春季“ 倒春寒” 天气也成为威胁茶树生产的不利因素^[2]。研究茶树在不同低温条件下的响应机制, 挖掘参与低温响应的关键基因, 是揭示茶树抗寒机理的重要途径。我们前期以不同冷驯化阶段的茶树叶片为材料, 进行了全面的转录组分析, 果证实糖代谢是参与茶树低温抗性形成的一个关键途径^[3]。
增加胞内可溶性糖含量, 是植物响应低温胁迫提高自身抗寒能力的重要途径^{[4, 5, 6]}。但这一过程相当复杂, 涉及酶活性、基因表达和信号转导等的改变^[7]。糖自身也可以作为一种信号分子, 调控植物的逆境响应和生长发育^{[8, 9]}。植物体内的碳水化合物存在形式多样, 种类繁多。其中淀粉是植物中分布最广、储量最丰富的非结构性碳水化合物, 也是叶绿体光合作用的主要产物。叶绿体中淀粉以6-磷酸果糖为底物, 依次在葡萄糖磷酸异构酶(PGI)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、ADP-Glc焦磷酸化酶(AGPase)和淀粉合酶(SS)的催化作用下合成; 在β -淀粉酶(BAM)作用下水解成麦芽糖, 在麦芽糖转运蛋白MEX1的作用下转运到胞质^[10]。α -淀粉酶同样可以通过作用于α -1, 4-糖苷键水解淀粉, 但在叶绿体中过渡型淀粉的水解中并不发挥主要作用^[11]。茶树叶片透射电镜观察显示, 冬季自然冷驯化前叶绿体内的淀粉粒在冷驯化结束后明显减小甚至消失; 而叶片中麦芽糖的含量逐渐升高^[12]。说明叶片中淀粉的水解是叶片提高胞内可溶性糖含量, 进而增强抗寒能力的重要途径。
BAM不仅是植物中重要的淀粉水解酶, 同时还在逆境胁迫响应中发挥重要的作用。拟南芥中已经鉴定的BAM蛋白有9个, 其中至少4个(BAM1、BAM2、BAM3和BAM4)是定位于叶绿体的^[13]。在已知定位于叶绿体的BAM中, 体外重组蛋白试验显示仅有BAM1、BAM2和BAM3具有催化活性, 而基因沉默试验表明仅有BAM1和BAM3具有水解淀粉的功能。BAM4虽然没有水解活性, 却可以直接与淀粉及α -1, 4-糖苷键结合, 协助淀粉水解^{[13, 14]}。BAM1和BAM3在基因结构和氨基酸组成上都存在差异, 在蛋白特性上体现为BAM1在相对较高的pH和较高的温度下活性高于BAM3^[15]。研究也表明BAM的作用具有一定的节律性, 白天BAM1在淀粉水解中起主导作用, 而在夜晚BAM3则发挥主要作用。BAM3的转录受低温胁迫诱导, 枳中与BAM3归为同一类的PtrBAM1编码基因则受CBF直接诱导, 在应对冷胁迫中发挥重要作用^{[15, 16]}。表达谱分析显示多个BAM家族基因均受低温诱导^{[17, 18]}。除定位于叶绿体外, 部分BAM蛋白定位于细胞核, 可以通过BZR1结构域与油菜素内酯(BR)信号途径互作, 调控植物的生长和发育过程^[19]。
糖代谢在植物低温胁迫中的作用已被广泛关注, 茶树中受低温等逆境胁迫诱导的糖代谢相关基因, 如海藻糖8磷酸合成酶TPS、转化酶INV、己糖激酶HXK等已有相关报道, 丁菲^[20]和岳川^[21]分别对茶树中糖代谢相关基因在茶树低温胁迫或冷驯化中的表达模式进行了研究, 但茶树中受低温直接诱导的糖代谢相关基因鲜有报道。在前期的冷驯化转录组分析中^[3], 我们发掘一条与拟南芥BAM3高度同源的基因片段, 该基因在冷驯化阶段被显著上调, 可能在茶树抗寒中发挥重要作用。本研究对该基因进行了全长克隆及序列分析, 并检测了该基因在冬季冷驯化阶段和早春低温胁迫条件下的表达变化, 获得了有意义的结果。
1 材料与方法1.1 试验材料及处理供试材料为国家级茶树良种龙井43, 种植于中国农业科学院茶叶研究所试验茶园(30° 10° N, 120° 05° E)。10月份采集田间健康茶树(20年生)根、幼嫩茎、叶(当年生成熟叶)和花(刚展开), 用于组织特异性表达检测。10月至次年3月份, 每2周采集茶树枝条顶端以下第2至第3片完整成熟叶, 统一于上午10:00采样, 记录采样期间每日温度变化。根据气温变化, 选取11月至12月份处于冷驯化阶段的样品用于表达检测。春季一芽二叶期时, 于上午10:00离体剪下健康的茶树枝条, 立即带回实验室, 分别放入20℃、4℃和0℃恒温培养箱中处理4 h, 分别采集嫩芽(一芽二叶)及上部成熟叶(顶端以下第2~3片), 每个处理至少取5片(个)叶或嫩芽, 用于检测基因在低温诱导下的表达。
以自然越冬的萌动期盆栽茶树(8年生)为材料, 首先移入模拟春季萌发条件的人工气候室(12~24℃变温, 13 h光照, 70%湿度)。待茶树进入鱼叶期、一芽一叶期、一芽二叶期时, 依次将茶树直接移入模拟倒春寒低温条件的人工气候室(白天4℃, 夜晚2℃, 13 h光照, 70%湿度), 分别于处理24 h和48 h后采集该时期嫩芽, 用于检测不同发育阶段嫩芽响应低温的表达模式。以上试验均设3个生物学重复。所有处理或采集样品立即投入液氮, 冷冻完全后-80℃保存。
1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成茶树叶片DNA采用NucleoSpin Tissue (MACHEREY-NAGEL, 德国)试剂盒提取。参考Chang等^[22]的方法提取茶树总RNA。提取RNA浓度及质量经NanoDrop 2000c分光光度计(ThermoFisher Scientific, 美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测, 未产生降解的RNA被统一稀释到1000 ng µ L^-1。每个样品取5 µ g RNA经DNase I (Invitrogen, 美国)处理后, 采用SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 美国)试剂盒合成cDNA。
1.3 cDNA全长及启动子克隆依据茶树冷驯化转录组分析中目的基因序列信息^[3], 按照SMARTScribe RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, 中国)试剂盒说明, 设计RACE特异引物(表1)。以获得的不同茶树组织RNA为材料, 进行RACE反应(94℃ 30 s, 68℃/65℃ 30 s, 72℃ 2 min, 25个循环), PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 回收最长片段并进行克隆、测序。所得序列经SeqMan (DNASTAR.Lasergene v7.1)拼接后获得包含全长ORF的cDNA序列。在ORF两端设计引物(表1), 按照PrimeSTAR HS试剂盒(TaKaRa, 中国)的说明扩增全长ORF, 并测序验证。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 引物信息 Table 1 Primer information 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5'-3') 目的 Purpose CsBAM3-RACE1 CGACTCCGTGTTTACTCATCATCTGTGC 5'-RACE扩增 5'-RACE amplification CsBAM3-ORF-F GTCTCCAAGCAAAGAGTTCA 编码区扩增 Amplification of coding region CsBAM3-ORF-R CACAAGAGCAGCCTCCTTAG CsBAM3-GSP1 TCAACCATGACCCCTTCAACTCCTGCG 启动子扩增 Promoter amplification CsBAM3-GSP2 GAATGATGTGAGAATGGATGAAGGCAG CsBAM3-qPCR-F TGGCTTTGACACTCCGTTCT 实时荧光定量PCR扩增 qRT-PCR CsBAM3-qPCR-R CGGCATGATGGCCTGATTTG CsPTB-qPCR-F TGACCAAGCACACTCCACACTATCG 内参基因 Reference gene CsPTB-qPCR-R TGCCCCCTTATCATCATCCACAA

表1 引物信息 Table 1 Primer information

启动子采用GenomeWalker 2.0 (Clontech Laboratories, 中国)试剂盒克隆。首先将获得的基因组DNA稀释到100 ng µ L^-1, 经Dra I酶切检验后, 按照试剂盒说明使用DraI、EcoR V、PvuII和StuI酶进行酶切、建库。终产物稀释到40 µ L后用于GenomeWalker PCR试验。依据已知基因序列设计巢式PCR引物(表1), 以构建的4个DNA文库为模板, 进行2轮PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 将大于500 bp的产物条带切胶回收、克隆、测序。利用SeqMan对所得序列进行拼接。
1.4 生物信息学分析在EXPASY (http://expasy.org/tools/)生物信息学分析平台上, 选择Compute pI/Mw、TargetP、ChloroP、SWISS-MODEL等工具对氨基酸序列进行生物信息学分析, PyMol 1.2软件进行蛋白3D结构编辑; WoLF PSORT (http://www.genscript.com/psort/ wolf_psort.html)预测蛋白质亚细胞定位; 利用MEGA5.0软件中ClustalW进行氨基酸序列比对后, 以邻近相连法构建系统进化树; 在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)中对启动子中所含顺式作用元件进行预测。
1.5 以qRT-PCR检测基因表达将cDNA合成终产物稀释40倍后用作模板, CsPTB基因为内参^[23], Primer-Blast (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计目的基因特异性定量引物(表1), 在ABI PRISM 7500实时定量PCR仪上进行qRT-PCR分析。采用SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, 中国)试剂根据要求构建10 µ L定量反应, 其中cDNA模板4 µ L。PCR程序为95℃预变性30 s, 40个扩增反应(94℃ 5 s, 60℃ 34 s), 反应结束添加溶解曲线分析(65~97℃)。

2 结果与分析2.1 CsBAM3基因的cDNA全长克隆及序列分析2.1.1 CsBAM3基因的cDNA全长克隆 _CDNA将茶树转录组数据库中已知序列在NCBI中进行BlastX比对, 结果发现该序列5° 端部分缺失, 不含完整的ORF。依据已知序列设计5° -RACE特异引物进行RACE-PCR扩增, 经产物克隆、测序、拼接, 最终获得了全长cDNA序列。RT-PCR验证序列正确, 且包含完整的ORF (图1)。ORF长度为1647 bp, 编码548个氨基端残基。与NCBI的NR数据库比对显示该基因编码蛋白与拟南芥中的BAM3蛋白(NP_567523.1)序列相似性较高, 故命名为CsBAM3基因(GenBank登录号为KF906412.1)。
图1
Fig. 1

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	图1 CsBAM3编码区PCR扩增产物电泳图 M: DL2000; 1: CsBAM3基因编码区扩增产物。Fig. 1 Electrophoresis of PCR products of CsBAM3 coding region M: DL2000; 1: PCR products of CsBAM3 coding region.

2.1.2 CsBAM3编码蛋白的序列分析 生物信息学分析显示, CsBAM3蛋白分量为61.73 kD, 理论等电点为6.92。亚细胞定位预测CsBAM3含有长度为41氨基酸残基的N端叶绿体定位信号肽(cTP), 可能定位于叶绿体。系统发育树结果显示, CsBAM3与杨树中的PtBAM2和PtBAM3的亲缘关系最近, 与拟南芥中的BAM1、BAM3和枳中的PtrBAM8、PtrBAM1、PtrBAM2一起聚为第II亚家族(图2)。3D结构预测发现, CsBAM3主要包含有10个α -螺旋和8个β -折叠, α -螺旋在外围, β -折叠区位于中心, 相互缠绕包裹形成一个近似圆饼状的高级结构, 底物结合位点和催化位点位于结构的中心(图3)。在81~534氨基酸残基区间的氨基酸序列模拟的结构与数据库中其他BAM蛋白的高级结构高度匹配, 具有典型的BAM蛋白的催化作用功能域结构。
图2
Fig. 2

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	图2 CsBAM3与其他物种中BAMs的系统发育树分析 BAMs被聚为I、II、III、IV亚家族。CsBAM3用红色字体及蓝色实心圆标出, 拟南芥中BAMs用绿色实心方块儿标出。Fig. 2 Phylogeny of CsBAM3 and BAMs from other species Plant BAM proteins fall into four subfamilies (I, II, III, IV). Red and blue filled circle mean CaBAM3; green solid squares for BAMs from Arabidopsis.

图3
Fig. 3

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	图3 CsBAM3的3D结构预测 与底物结合的作用位点用红色表示, 蓝色圆球为具有催化功能的Glu186和Glu380残基。Fig. 3 3D structure prediction of CsBAM3 Red sticks indicate substrate binding residues. Blue dots indicate the catalytic residues of Glu186 and Glu380.

2.2 CsBAM3基因的启动子克隆及序列分析经过4种不同的酶切建库, 我们扩增出多条长度大于1 kb的片段, 测序拼接后获得了长度大于2 kb的启动子序列(GenBank登录号为KY564199) (图4)。启动子序列分析显示, 在长度为2 kb的区域内包含多种顺式作用元件, 其中包括可以被生理节律识别的“ circadian” 位点, 以及多个受光信号调控的位点, 如Box1、AT1-motif、Box4、AE-box、Sp1等; 同时启动子还含有茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯、赤霉素、脱落酸等激素的调控元件和α -淀粉酶上游区域的保守序列“ amylase box” ; 还含有3个“ MYCCONSENSUSAT” 位点, 该位点为MYC识别位点, 存在于拟南芥CBF3以及脱水反应相关的rd22等多个基因的启动子区, 同时也是ICE1调控CBF/DREB基因转录的识别位点(表2)。
图4
Fig. 4

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图4 CsBAM3启动子序列及包含的顺式作用元件Fig. 4 Sequence andcis-acting element information of CsBAM3 promoter

表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 CsBAM3启动子区顺式作用元件功能注释 Table 2 Functional annotation of the cis-acting elements in CsBAM3 promoter region 序列 Sequence 位点名称 Site name 功能 Function CAANNNNATC Circadian cis-acting regulatory element involved in circadian control TGACG TGACG-motif cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness CAGAAAAGGA, CCATCTTTTT TCA-element cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness TATATATATATATATATATATA TA-rich region Enhancer AAAAAATTTC, AGAAAATTCG HSE cis-acting element involved in heat stress responsiveness ATTTCAAA ERE Ethylene-responsive element TTTCAAA Box I Light responsive element ATTAATTTTACA AT1-motif Part of a light responsive module ATTAAT Box 4 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness AGAAACAA AE-box Part of a module for light response CC(G/A)CCC Sp1 Light responsive element CCTTTTG P-box Gibberellin-responsive element CACGTG, ACGTGGC ABRE cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness TAACACA Amylase box Conserved sequence found in 5'-upstream region of alpha-amylase gene of rice, wheat, and barley CANNTG MYCCONSENSUSAT MYC recognition site found in the promoters of the dehydration- responsive gene rd22 and many other genes in Arabidopsis; MYC recognition sequence in CBF3 promoter; Binding site of ICE1 (inducer of CBF expression 1) that regulates the transcription of CBF/DREB1 genes in the cold in Arabidopsis

表2 CsBAM3启动子区顺式作用元件功能注释 Table 2 Functional annotation of the cis-acting elements in CsBAM3 promoter region

2.3 CsBAM3基因的组织特异性表达以正常生长的秋季不同茶树组织为材料, 检测了CsBAM3基因的组织特异性表达(图5)。结果显示, CsBAM3在叶片中的表达水平最高, 在幼嫩茎和花中的表达相对较低。叶中的表达水平是其在幼嫩茎和花中的5倍以上。该基因在根中的表达水平最低, 仅有微弱的基因表达。
图5
Fig. 5

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	图5 CsBAM3的组织特异性表达检测Fig. 5 Tissue-specific expression detection of CsBAM3

2.4 CsBAM3基因响应低温的表达模式分析10月份开始采样并记录每日温度变化(图6-A), 检测冷驯化阶段(温度逐渐降低的11、12月份) CsBAM3基因的表达变化(图6-B)。结果显示CsBAM3在冷驯化前期处于相对较低的表达水平, 在冷驯化
阶段表达被显著上调, 是前期的15倍以上。冷驯化后期表达量有所降低。
图6
Fig. 6

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图6 温度变化及CsBAM3在冷驯化阶段的表达模式分析 A: 采样期间10月至第2年3月份每日温度变化, 其中虚线间为11月和12月份冷驯化阶段温度变化。 B: 冷驯化阶段CsBAM3基因的表达变化。Fig. 6 Temperature information and expression level of CsBAM3 during cold acclimation periods A: daily temperature from October to the next March, in which the temperature during cold acclimation (November and December) was marked between dotted lines. B: expression changes of CsBAM3 during cold acclimation.

以春季萌发阶段的自然生长的成熟叶和嫩梢(一芽二叶)为材料, 分别给予4 h的4℃和0℃低温处理, 以20℃的处理为对照, 检测CsBAM3在不同发育状态的叶片中的表达变化(图7)。结果显示CsBAM3无论在成熟叶还是新梢中, 低温诱导后其表达均被显著上调, 而且0℃处理较4℃处理作用更加明显。另外, 在新梢中CsBAM3受低温诱导表达的反应比成熟叶明显。
图7
Fig. 7

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	图7 低温诱导条件下CsBAM3在不同组织中的表达水平Fig. 7 Expression levels of CsBAM3 in different organs with the treatment of cold

为进一步鉴定CsBAM3在新梢抗寒中的表达变化, 利用人工气候室模拟倒春寒低温条件, 分别在茶树春季萌发的鱼叶期、一芽一叶和一芽二叶期给予不同时间的低温胁迫, 检测CsBAM3基因的表达变化(图8)。以0 h低温处理为对照, 在3个检测时期CsBAM3基因均在低温胁迫24 h和48 h后显著上调, 而且随着茶树新梢成熟度提高, 其上调幅度更加明显。
图8
Fig. 8

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	图8 低温诱导条件下CsBAM3在不同萌发阶段嫩芽中的表达Fig. 8 Expression levels of CsBAM3 in young shoots at different sprouting stages after cold treatment

3 讨论BAM是介导植物叶片中淀粉水解的关键酶^[10]。拟南芥中已经鉴定的9个BAM蛋白被归为4个亚家族, BAM5和BAM6为第I亚家族, BAM1和BAM3为第II亚家族, BAM4和BAM9为第III亚家族, BAM2、BAM7和BAM8为第IV亚家族^[13]。已知BAM1-4是叶绿体定位的淀粉水解酶, 但其中只有BAM1和BAM3具有显著的生理活性, 2个酶均由4个外显子组成, 在系统发育树中被归为同一类^{[7, 25]}。系统发育树分析将茶树中的CsBAM3与拟南芥中的BAM3和BAM1归为同一亚家族, 与BAM3的序列相似性较高(图2)。一同被归为该亚家族的还有常绿植物枳、落叶植物杨树以及单子叶植物水稻中的BAM蛋白等。已知在枳中共鉴定8个BAM基因, 其中只有PtrBAM1和PtrBAM8与拟南芥的BAM3关系最近, 氨基酸序列分析显示只有PtrBAM1含有拟南芥BAM3蛋白中所有重要的氨基酸位点^[16]。其他植物中与CsBAM3关系较近的BAM蛋白的功能目前还不清楚。BAM1、BAM3以及PtrBAM1均为叶绿体定位蛋白^{[13, 16]}, CsBAM3同样含有叶绿体定位的信号肽, 推测该蛋白为叶绿体定位。3D结构分析显示CsBAM3有着与数据库中其他BAM蛋白高度匹配的高级结构^[13]。与BAM3相似, 在结构中心包含典型的底物结合位点和催化位点(图3), 说明茶树CsBAM3是一个具有淀粉催化功能的蛋白。
在植物冷驯化研究中发现, 多数BAMs基因受低温诱导后表达快速上调, 其中BAM3的表达变化最为显著^{[18, 26]}。Peng等^[16]对枳中PtrBAM1的启动子序列分析发现, 存在CBF结合顺式作用元件、干旱响应元件、淀粉酶保守序列及响应调节因子(ARR1)结合元件等。利用酵母单杂交试验结合表达分析证实, PtrBAM1受CBF直接诱导。CsBAM3启动子序列分析显示, 除了包含与低温相关的“ MYCCONS ENSUSAT” 位点以及淀粉酶保守序列外, 还包含生理节律识别的“ circadian” 位点、多个光信号调控位点和多种激素识别位点。Ingkasuwan等^[27]在拟南芥中发现受日变化节律调控的基因有1480个, 其中21个来自淀粉代谢途径中不同酶类的编码基因; 而且调控网络分析显示, BAM3是与所有受节律调控基因关系最为密切的信号节点。CsBAM3启动子中的“ circadian” 位点进一步证实BAM3可能是受日变化节律调控的关键基因。与激素反应相关的识别位点有多种(图4), 包括与抗逆相关的茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸调控元件, 以及与生长发育相关的乙烯、赤霉素调控元件等^[28]。前人研究表明, ABA处理能够引起BAMs基因表达的显著变化^{[24, 29]}。但其他激素在BAMs基因调控中的作用还需要进一步研究。淀粉代谢具有明显的日变化规律, 可能与每日的光照和黑暗交替变化密切相关^[30]。除了每日不同时间光照会发生变化外, 一年不同时间的日长和光照强度都会发生显著, 有时甚至是剧烈的变化。BAMs作为叶绿体光合产物水解的关键调控基因, 要能够适应外界光照的变化。CsBAM3基因启动子区存在的多个光信号作用位点, 表明该基因可能受光信号直接调控。
冬季低温和春季倒春寒是威胁茶树生产的重要气候因素^{[2, 3]}。为明确CsBAM3在茶树应对低温胁迫中的作用, 我们检测了CsBAM3基因在不同条件下的表达变化(图5~图8)。组织特异性分析显示, CsBAM3在叶片中的表达水平最高, 在根中几乎不表达, 这与该蛋白的叶绿体定位和具有淀粉催化功能的结果相一致。在冬季自然冷驯化早期CsBAM3在茶树成熟叶中的表达被显著上调。拟南芥中, 4℃低温处理6 h后可以显著增强BAM3的表达信号; 而且在一定的温度区间(0~20℃), 温度越低BAM3的表达被上调的越明显^{[17, 26]}。BAM3被沉默后, 植株的抗寒能力则明显减弱^[26]。在枳中同样发现, 8个PtrBAMs基因中有6个受低温诱导, 在烟草中过表达PtrBAM1基因可以明显增强其抗低温能力, 减少受冻叶片中活性氧的积累^{[16, 24]}。当同时给予成熟叶片和嫩芽(一芽二叶)以4℃和0℃低温时, CsBAM3在2种不同组织中均被上调表达。特别是嫩芽中的CsBAM3, 在2种温度处理下其表达量均明显高于成熟叶片。Shin等^[31]发现碧桃中的BAM基因表达量高低与碧桃新梢的抗寒能力强弱成正相关。我们进一步利用人工气候室模拟倒春寒条件, 检测了CsBAM3及CsCBF在茶树越冬芽萌发不同阶段的表达变化(图8)。在越冬芽萌发到一芽一叶时, 虽然此时的叶片还未完全展开, CsBAM3的表达就被明显上调。在鱼叶期时萌动的越冬芽还未长出叶片, 此时CsBAM3的表达虽有上调, 但不明显。说明CsBAM3主要在新梢长出叶片后才发挥作用。因此, 对CsBAM3的深入研究将为揭示茶树新梢低温响应机制, 应对倒春寒危害提供重要理论依据。
4 结论克隆获得的CsBAM3为β 淀粉酶(BAM)编码基因。CsBAM3蛋白与拟南芥的BAM1和BAM3一起归为第II亚家族, 推测具有叶绿体定位特性和淀粉水解活性。启动子克隆及序列分析显示, 该基因启动子包含生理节律调控元件、低温响应元件, 多个光信号响应元件和多种激素信号识别位点, 可能受生理节律、光、低温及多种激素等信号共同调控。CsBAM3在叶片中表达量最高, 根中基本不表达, 在冷驯化初期被显著上调且一直保持相对较高的水平。成熟叶片及嫩芽(一芽二叶)中的CsBAM3均可以被4℃及0℃低温显著上调, 且嫩芽中基因的表达量上调幅度明显高于成熟叶中。人工模拟倒春寒低温条件显示该基因在鲜叶初展的嫩芽中即可快速受低温诱导。表明CsBAM3是茶树中调控淀粉水解的一个重要β -淀粉酶编码基因, 在茶树成熟叶和嫩芽中的表达受低温快速诱导。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


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