陆徐忠¹, 倪金龙¹, 李莉¹, 汪秀峰¹, 马卉¹, 张小娟^1,2, 杨剑波^1,*
1安徽省农业科学院水稻研究所, 安徽合肥 230031

²安徽省农业科学院棉花研究所, 安徽安庆 246003

^* 通讯作者(Corresponding author): 杨剑波, E-mail:yjianbo@263.net, Tel: 0551-62160212
第一作者联系方式: E-mail:luxuzhong100@163.com
收稿日期:2013-12-12 基金:本研究由国家科技支撑计划项目(2012BAD07B01), 国家自然科学基金青年科学基金项目(31101204)和安徽省农业科学院院长青年创新基金项目(11B0106)资助;

摘要为方便水稻种子质量的追溯和管理, 提出基于SSR分子指纹和商品信息构建水稻品种身份证的新思路。在前期研究基础上, 进一步确定了由12个水稻SSR标记构成的核心标记组(每条染色体1个), 对127份安徽省审定(或主推)水稻品种进行荧光标记分析, 构建供试水稻品种分子指纹, 在此基础上, 再与品种基本商品信息相结合, 并进行数字化编码, 构建了127份水稻的品种身份证。该身份证号码组成的第1部分为商品码, 代表品种的基本商品信息, 包括品种类别、品种选育(或审定)的区域和时间等; 第2部分为指纹码, 代表水稻品种的分子指纹信息; 第3部分为补充码(或特异基因识别码), 代表品种的特异基因信息。还对127份水稻品种身份证进行了条码表述(一维码和二维码), 以便水稻品种种子的身份标识和溯源管理。

关键词:水稻; SSR荧光标记; 毛细管电泳; 商品信息; 品种身份证
Construction of Rice Variety Indentity Using SSR Fingerprint and Commo-dity Information
LU Xu-Zhong¹, NI Jin-Long¹, LI Li¹, WANG Xiu-Feng¹, MA Hui¹, ZHANG Xiao-Juan^1,2, YANG Jian-Bo^1,*
1Institute of Rice Research, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China

²Cotton Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Anqing 246003, China

Fund:
AbstractOn the base of the previous research, we selected a set of 12 rice SSR markers (one marker for each chromosome) for increasing convenience of the rice seed quality tracking and management. The fluorescent marker analysis was performed on 127 released and popularized authorized (or main plant) rice varieties in Anhui Province. Then, the rice variety ID was constructed by the SSR fingerprint with corresponded commodity information. The rice variety ID included three components: part 1 was recognized as commodity code, which reflected crop species, cultivar, breeding (or approval) region and year; part 2 was recognized as fingerprint code, which contained the variety DNA fingerprint information; part 3 was recognized as complement code (specific gene identification code), reflecting specific genetic information of cultivars. We also described the rice variety ID in the form of bar code or QR code, which might be favorable for rice seed identification and traceability management.

Keyword:Rice; Fluorescent SSR markers; Capillary Electrophoresis; Commodity Information; Variety ID
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水稻优良品种的推广对保证我国粮食安全、满足人们多元化需求具有重要意义。然而, 随着水稻品种数目急剧增多和种质交流日趋频繁, 以及品种多家繁育、多元经营的既定格局, 种子市场中的“品种雷同”现象较为严重, “套牌”“冒牌”现象屡屡发生, 不仅给水稻品种选育、试验、质量和市场管理以及产权保护带来诸多困难和混乱, 更会给农业生产造成严重损失。因而, 亟需建立一套准确可靠、操作简便的品种区别和鉴定技术体系, 为水稻品种管理提供技术支撑。
随着DNA指纹鉴定技术的发展和日趋完善, 将DNA指纹(特别是SSR指纹)数字化, 构建农作物品种分子身份证, 使品种的区别、鉴定和对比更加方便直观。倪西源等^{[ 1]}首次提出利用SSR标记构建油菜等作物分子身份证和基因身份证; 高运来等^{[ 2]}利用９对SSR引物构建了83份黑龙江大豆品种的分子身份证; 陈昌文等^{[ 3]}等利用SSR标记构建了中国桃主要品种资源及其野生近缘种的16位分子身份证; 王黎明等^{[ 4]}用11对SSR引物组合构建了142份甜高粱品种资源的分子指纹图谱; 丁俊杰等^{[ 5]}利用与大豆灰斑病抗性基因连锁的SSR标记构建大豆品种(系)的分子身份证; 颜静宛等^{[ 6]}、杨剑波^{[ 7]}、辜大川等^{[ 8]}利用SSR标记分别构建了水稻杂交种或亲本材料的分子身份证; 马琳等^{[ 9]}通过逐级筛选, 最终确定7个SSR标记, 构建了130份甘蓝型油菜的品种分子身份证。
上述研究对水稻、油菜、大豆等农作物品种的资源评价、利用和保护等起到了重要作用。然而品种是育种工作的产物, 是农业生产资料, 具有商品属性, 单纯遗传学意义的分子身份证并不能完全反映一个品种包含的商品信息, 也难以区分近等基因系或代换系等。另外, 目前的SSR检测方法主要是PAGE电泳, 其条带大小依靠肉眼估测, 易出现误读, 而毛细管电泳可以得到扩增片段实际大小, 其结果更为精确、灵敏、高效, 非常适用于大批量品种的检测分析。因此, 本研究提出了一种新的水稻品种身份证构建策略, 即利用毛细管电泳SSR荧光标记分析, 获取水稻品种的指纹信息, 将指纹信息与水稻的商品信息等相结合, 构建水稻品种身份证, 为水稻种子质量的追溯和管理提供技术支撑。
1 材料与方法1.1 试验材料安徽省审定(或主推)水稻品种标准样品127份, 由安徽省种子管理站提供, 其中籼型三系杂交稻67份, 籼型两系杂交稻22份, 籼型常规稻19份, 粳型三系杂交稻6份, 粳型常规稻13份, 样品种子及水稻品种的特征特性等资料, 由安徽省种子协会收集整理。
1.2 SSR标记引物用于水稻品种指纹分析的48个SSR标记引物^{[ 10, 11]}, 由Invitrogen生物技术有限公司合成, 并分别用FAM (蓝色)、HEX (绿色)、TAMRA (黄色)、ROX (红色) 4种荧光基团修饰上游引物5¢端。
1.3 DNA提取与检测水稻种子发苗1周后(三叶期)取幼苗, 利用CTAB法提取单株水稻基因组DNA^{[ 11]}。以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 核酸蛋白仪测定浓度, 低温保存备用。
1.4 水稻SSR分析的荧光检测按文献^{[ 11]}进行PCR扩增, 每样品扩增4个单株, 反应总体积为10 μL。参照文献[12-13]进行扩增产物的荧光检测: 将PCR产物稀释40倍, 在96孔板的各孔中分别加入9.05 μL去离子甲酰胺、0.05 μL LIZ-500分子量内标和1 μL稀释后的PCR产物, 95℃变性5 min, 于4℃放置10 min, 4000转 min^-1离心1 min, 于ABI3730 DNA分析仪上进行毛细管电泳。预电泳15 kV, 3 min; 2 kV电进样10 s; 电泳15 kV, 20 min。
1.5 指纹数据收集用Data Collection软件收集原始数据, 用Genemapper软件分析收集的原始数据, 比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标, 获得SSR扩增片段的精确分子量(bp)。
1.6 水稻品种身份证的构建将水稻品种的DNA指纹信息编码, 再结合品种的基本商品信息及可能具有的特异基因信息, 构建127份安徽省审定(或主推)水稻品种的身份证, 并利用在线条码生成器(http://barcode.tecit.com/barcodege-nerator.aspx?LANG=zhcn)和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的水稻品种身份证。

2 结果与分析2.1 SSR标记组合的确定在前期研究^{[ 10, 11]}的基础上, 分析48个SSR荧光标记在供试水稻品种中的扩增情况, 依据扩增产物在毛细管电泳中的可读性、多态性(图1), 并考虑染色体分布, 最终筛选出12个多态性较高、扩增稳定的SSR标记构成1个核心标记组(每条染色体1个标记), 对供试水稻材料进行荧光标记分析。
图1
Fig. 1

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	图1 水稻SSR标记RM241毛细管电泳荧光检测的特征带型Fig. 1 Capillary electrophoresis feature bands of rice SSR RM241 marker

2.2 水稻品种SSR指纹编码读取127份水稻品种的12个SSR荧光标记的指纹数据, 并对指纹数据进行数字化编码。例如, 杂交水稻“皖稻185”(皖品审06010498)的SSR指纹编码如下, 12个标记在“皖稻185”中的扩增产物, 经由毛细管电泳其直接读取的片段大小(bp)为81/81、153/161、180/180、132/134、70/74、119/125、157/157、158/158、137/139、136/143、93/100、113/113 (按标记所在染色体由小到大排序, 水稻为二倍体, SSR扩增只有1条主带时, 须重复记录一次), 转换成24位的指纹码为3358 2278 3514 6666 4558 1322, 其中第1、2位的“3、3”表示标记RM1在‘皖稻185’中的扩增片段(81/81 bp)在其等位基因梯度(多态性片段)中排第3位, 第3、第4位的“5、8”表示标记RM6的两个扩增片段(153/161 bp)在其等位基因梯度(多态性片段)中分别排第5位和第8位(表1), 其余20位类推。
常规籼稻“早籼788”(皖稻2008001)的SSR指纹编码如下, 12个标记在“早籼788”中的扩增产物, 经由毛细管电泳其直接读取的片段大小(bp)为107/107、159/159、197/197、126/126、74/74、129/129、157/157、147/147、141/141、143/143、101/101、153/153, 转换成24位的指纹码为8877 6644 5566 6644 6688 33DD, 其中第1、第2位的“8、8”表示标记RM1在“早籼788”中的扩增片段(197/107 bp)在其等位基因梯度(多态性片段)中排第8位, 第3、第4位的“7、7”表示标记RM6的两个扩增片段(159/159 bp)在其等位基因梯度(多态性片段)中排第7位(表1), 其余20位类推。
各标记扩增片段按分子量大小排列, 扩增片段(等位基因)从小到大以阿拉伯数字1、2、3、4、……、9标注, 9个以上的等位基因, 以大写英文字母A、B、C、……、Z标注(表1)。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 12对水稻SSR核心标记信息 Table 1 Information of 12 rice core SSR markers 位点 Locus 染色体 Chr. 修饰基团 Modify group 等位基因数 Allele No. 毛细管电泳多态性片段 Capillary electrophoresis polymorphism fragments (bp) RM1 1 FAM (blue) 10 71(1)a, 73(2), 81(3), 83(4), 87(5, 102(6), 105(7), 107(8), 109(9), 122(A) RM6 2 HEX (green) 8 140(1), 142(2), 147(3), 149(4), 153(5), 156(6), 159(7), 161(8) RM16 3 TAMRA (yellow) 8 168(1), 180(2), 182(3), 184(4), 186(5), 197(6), 217(7), 227(8) RM241 4 ROX (red) 11R 119(1), 121(2), 124(3), 126(4), 127(5), 129(6), 132(7), 134(8), 136(9), 138(A), 140(B) RM413 5 FAM (blue) 11 64(1), 66(2), 70(3), 72(4), 74(5), 76(6), 78(7), 84(8), 98(9), 100(A), 102(B) RM3628 6 HEX (green) 8 119(1), 121(2), 123(3), 125(4), 127(5), 129(6), 131(7), 133(8) RM346 7 TAMRA (yellow) 7 133(1), 137(2), 139(3), 141(4), 150(5), 157(6), 173(7) RM152 8 ROX (red) 6 129(1), 135(2), 143(3), 147(4), 153(5), 158(6) RM278 9 FAM (blue) 6 127(1), 133(2), 135(3), 137(4), 139(5), 141(6) RM590 10 HEX (green) 10 126(1), 129(2), 132(3), 134(4), 136(5), 138(6), 140(7), 143(8), 145(9), 147 RM3133 11 TAMRA (yellow) 7 93(1), 97(2), 101(3), 103(4), 108(5), 110(6), 117(7) RM3331 12 ROX (red) 13 109(1), 113(2), 115(3), 121(4), 123(5), 125(6), 127(7), 129(8), 131(9), 133(A), 137(B), 151(C), 153(D) a 表示扩增片段大小(bp)及转换成的指纹码。 a means length of fragment amplified by SSR and its fingerprint code.

表1 12对水稻SSR核心标记信息 Table 1 Information of 12 rice core SSR markers

2.3 水稻品种商品码及补充码水稻品种商品码代表品种的基本商品信息, 分为3个部分: (1)作物及品种类别码。由8位数字组成, 用以标识作物及品种类别, 其中, 第1~6位表示水稻种属(含3级分类, 水稻属于粮食作物中的禾谷类作物); 第7位表示水稻籼、粳类型; 第8位表示品种类型(杂交种或常规种等)。例如, 水稻品种‘宁粳3号’的作物及品种类别码为“01010123”, 其中, 第1、第2位的“01”代表大田作物, 第3、第4位的“01”代表禾谷类作物, 第5、第6位的“01”代表水稻, 第7位的“2”代表粳稻, 第8位的“3”代表常规种。(2)区域码。用以表示品种初次育成或审定的区域, 以各省市自治区的标准编码表示, 即北京为11、天津为12、安徽为34等, 国审品种以00表示。(3)时间码。用以表示品种初次育成或审定的年份,书如2000表示2000年审定, 2011表示2011年审定。
水稻补充码(特异基因识别码)表示品种可能携有的特异基因信息, 设计为字母“T”、“S”和“M”等, 加上被导入、渗入或诱变的基因名称, 分别代表通过转基因、分子标记辅助选择和诱变等育成的品种。
2.4 水稻品种身份证的构建将上述的商品码、指纹码、补充码3个部分顺序排列, 就构成了总位数约40位的水稻品种身份证。以“皖稻185”的品种身份证01010111 34 2006 3358 2278 3514 6666 4558 1322 S为例(图2), 其作物类别为水稻(010101, 粮食作物—禾谷类作物—稻), 栽培亚种为籼稻(1), 品种类别为三系杂交种(1), 品种首次审定区域为安徽(34), 品种首次审定时间为2006年(2006); 品种DNA指纹为3358 2278 3514 6666 4558 1322; 该品种为通过分子标记辅助选择选育而成（对受体品种中控制直链淀粉含量的主效Wx基因进行了定向改良）。按上述方法完成了其余126份水稻品种身份证的构建。
图2
Fig. 2

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图2 皖稻185品种身份证示意图Fig. 2 Model of Wandao 185 variety ID

2.5 水稻品种身份证的条码表述按照中国物品编码相关国家技术标准《GB/T 18347-2001 128条码》^{[ 14]}和《GB/T 18284-2000 快速响应矩阵码》^{[ 15]}的规范要求, 利用条形码和二维码生成软件分别生成127份水稻品种身份证的条形码(一维码)和二维码。“皖稻185”的条形码和二维码如图3和图4, 部分水稻标准样品的品种身份证条码信息见表2。
将上述水稻品种身份证, 以条形码或二维码的形式标贴在种子包装上, 就可实现对品种种子质量的科学追溯、快速鉴定和规范管理, 也为品种的知识产权保护提供科学依据。
图3
Fig. 3

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	图3 皖稻185品种身份证条形码Fig. 3 Bar code of “Wandao 185” variety ID

图4
Fig. 4

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图4 皖稻185品种身份证二维码Fig. 4 Quick Response (QR) code of “Wandao 185” variety ID

表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 部分水稻标准样品的品种身份证条码信息 Table 2 Variety ID information of some rice standard samples 序号 No. 品种名称 Name 品种审定编号 Identify number 栽培亚种 Cultivar 品种类别 Category 条形码及水稻品种身份证 Bar code and rice variety ID 二维码 QR code 1 协优63 Xieyou 63 川审稻22/皖品审94010136 Chuanshendao 22/ Wanpinshen 94010136 籼 Indica 三系杂交种 Three-line hybrid 2 华安3号/皖稻79 Hua’an 3/Wandao 79 皖品审00010288 Wanpinshen00010288 籼 Indica 三系杂交种 Three-line hybrid 3 III优98 III You 98 皖品审02010333/ 国审稻2006061 Wanpinshen02010333/ Guoshendao006061 籼 Indica 三系杂交种 Two-line hybrid 4 开优10号 Kaiyou 10 皖稻2010020 Wandao2010020 籼 Indica 三系杂交种 Three-line hybrid 5 II优08/LY-8 II You 08/LY-8 皖稻2010022 Wandao2010022 籼 Indica 三系杂交种 Three-line hybrid 6 皖稻93/皖两优16 Wandao 93/Wanliangyou 16 皖品审03010372/ 湘审稻2012008 Wanpinshen03010372/ Xiangshendao2012008 籼 Indica 两系杂交种 Two-line hybrid 7 培两优98/皖稻129 Peiliangyou 98/Wandao 129 皖品审04010418 Wanpinshen04010418 籼 Indica 两系杂交种 Two-line hybrid 8 1892S×RH003/皖稻153 1892S×RH003/Wandao 153 皖品审05010463/ 国审稻2008013 Wanpinshen05010463/ Guoshendao2008013 籼 Indica 两系杂交种 Two-line hybrid 9 两优036 Liangyou 036 赣审稻2006070/ 皖品审2008007 Ganshendao2006070/ Wanpinshen2008007 籼 Indica 两系杂交种 Two-line hybrid 10 新两优香4号 Xinliangyouxiang 4 皖品审07010601 Wanpinshen07010601 籼 Indica 两系杂交种 Two-line hybrid rice 11 9优418/天协1号 9 You 418/Tianxie 1 国审稻20000009/ 皖品审02010330 Guoshendao20000009/ Wanpinshen02010330 粳 Japonica 三系杂交种 Three-line hybrid 12 金奉19 Jinfeng 19 皖品审03010385 Wanpinshen03010385 粳 Japonica 三系杂交种 Three-line hybrid 13 爱优18/爱优518/皖稻76 Aiyou 18/Aiyou 518/Wandao 76 皖品审04010415 Wanpinshen04010415 粳 Japonica 三系杂交种 Three-line hybrid 14 9201A×R-18/皖稻88 9201A×R-18/Wandao 88 皖品审06010509 Wanpinshen06010509 粳 Japonica 三系杂交种 Three-line hybrid 15 天协13 Tianxie 13 皖品审07010629 Wanpinshen07010629 粳 Japonica 三系杂交种 Three-line hybrid 16 早籼65 Zaoxian 65 皖品审03010368 Wanpinshen03010368 籼 Indica 常规种 Inbred 17 皖稻141/早籼276 Wandao 141/Zaoxian 276 皖品审05010457 Wanpinshen05010457 籼 Indica 常规种 Inbred 18 早籼788 Zaoxian 788 皖稻2008001 Wandao2008001 籼 Indica 常规种 Inbred 19 86120-5/皖稻68 86120-5/Wandao 68 皖品审03010384 Wanpinshen03010384 粳 Japonica 常规种 Inbred 20 W262/宁粳2号 W262/Ningjing 2 皖品审05010476 Wanpinshen05010476 粳 Japonica 常规种 Inbred

表2 部分水稻标准样品的品种身份证条码信息 Table 2 Variety ID information of some rice standard samples

3 讨论3.1 水稻等农作物品种身份证的设计所谓身份证, 顾名思义就是证实和区别身份的有效证明, 具有唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性等特点, 并可将反映身份的基本信息以数字、条码、图像等进行科学表述和系统规范, 从而被社会接受和通用。但农作物品种并不能像人类那样具有自我识别和相互识别能力, 不具备典型和突出的社会学特性。因此, 水稻等农作物品种身份证的构建, 需既借鉴人类身份证的编码模式, 又要结合农作物自身的特点。
3.2 水稻商品码和补充码设定品种从本质上讲是一个商品概念, 它主要满足商品一般价值和农艺学基本要求, 而对遗传学纯一性要求往往不是很严格。有时为了增加适应性和对抗某些病害的需要, 还特别要求在品种内保留一定的遗传多样性; 也可在不影响其商品性和外观整体一致性前提下, 允许品种内个体间保留一定的变异度或变异残留。因此, 品种身份证设定了作物及品种类别码、区域码、时间码等商品码以反映品种的基本商品信息。同时, 为使品种身份证设计思路能够应用推广到其他农作物, 我们将作物类别设为6位代码, 如小麦为010102 (粮食作物—禾谷类作物—小麦), 油菜为144 (大田作物—油料作物—油菜)。
对于转基因育种、辐射(诱变)育种、分子标记辅助育种等选育的单一性状改良品种, 相对于原品种可以看作1个近等基因品种, 只有很少基因差异(甚至是SNP差异)。为此, 我们设定了补充码排在主体号码的后边, 用于标定这些特定类型品种。
3.3 适于荧光检测的核心引物的筛选核心引物的筛选和确定是DNA指纹图谱^{[ 16]}和品种身份证构建^{[ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}的重要步骤。本研究从出入境行业标准(SN/T 3402-2012)^{[ 10]}推荐的用于水稻指纹鉴定的48个SSR标记中, 依据扩增产物在毛细管电泳中的可读性、多态性, 确定12个核心标记的组合(每条染色体1个)。按标记组合能够区分最大品种数的理论值计算^{[ 16, 17]}, 12个核心标记能够区分最大水稻品种数为1.93×10¹⁹, 再结合品种基本商品信息等, 完全能够满足现有水稻品种的区分要求。本研究构建的127份水稻的品种身份证, 其号码是唯一的, 表明所选用标记组合的可靠性、有效性。这样既保证了染色体的平衡性, 又达到了以最少标记区分品种的目的, 同时减少了指纹分析的工作量。本研究确定的12个标记能够完全区分安徽省近20年的主要水稻审定品种, 但对于来自其他审定区域的品种, 或水稻品种数量较大时, 12个核心标记未必能完全区分, 甚至出现2个品种的身份证完全相同的极端情况, 这时需用标准推荐的其余36个标记区别鉴定。
3.4 SSR标记分析方法的确定已有的品种分子身份证构建研究中, SSR扩增产物主要经PAGE电泳检测^{[ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}, 整合不同批次、不同胶板的DNA指纹数据是个难题, 且容易出现误读、错读。本研究采用的SSR荧光标记毛细管电泳检测方法, 依据PCR扩增产物与同一泳道的内标比对, 直接读出目标DNA片段的准确大小, 其检测数据更为精确可靠^{[ 18, 19, 20, 21]}, 建立的分子指纹更为科学客观。
3.5 水稻品种身份证在农业物联网中的应用本研究构建的水稻品种身份证, 通过条形码或二维码表述, 并标识于商品种子包装上, 可以用于水稻优良品种种子的防伪和溯源。但其科学使用, 还需在农业物联网^{[ 22]}的基础上组建种子物联网, 即利用传感器、射频识别、品种身份证信息、全球定位系统等现代物联网技术, 将水稻种子选育单位、种子产地、种子生产单位、包装种子、种子库、种子销售商、种植农户等相关元素通过互联网连接起来, 形成一个水稻品种种子“选育—保护—审定—繁殖—生产—流通—销售”的信息可追溯链条和全程的多功能服务网络体系, 将水稻种子的品种身份证以条行码(或二维码、芯片等)的形式, 对种子包装进行标识, 达到包装种子的可追溯性, 进而实现水稻品种和种子管理的科学化、规范化。

4 结论构建了127份水稻的品种身份证, 并进行了条码表述。该品种身份证既借鉴了人类身份证的编码模式, 又结合了农作物自身的特点, 为水稻种子质量追溯与管理提供便利, 也为其他农作物品种身份证的构建提供了新的思路。
致谢: 127份水稻品种标准样品, 由安徽省种子管理站提供, 样品种子及水稻品种的特征特性等资料, 由安徽省种子协会李爱青、叶飞、方艳收集整理, 毛细管电泳分析得到北京农林科学院玉米中心王风格、易红梅的无私帮助, 在此一并致谢。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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被引期刊影响因子

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