, 陈代杰3 1. 上海师范大学 生命科学学院，上海 200234;
2. 华东理工大学 生物工程学院，上海 200237;
3. 上海交通大学 药学院，上海 200240
收稿日期：2019-01-21；接收日期：2019-05-28；网络出版时间：2019-06-10
摘要：随着基因工程抗体的快速发展，双特异性抗体技术也日趋成熟。双特异性抗体能够同时结合两个以上不同的抗原表位，在免疫治疗中具有独特的优势。双特异性抗体已经广泛应用于癌症治疗如黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤以及肝癌、胃癌等，以及炎症方面的治疗如类风湿性关节炎、牛皮癣与克罗恩病等。双特异性抗体在病毒免疫治疗方面则刚刚起步。文中对双特异性抗体用于病毒免疫治疗的研究进展进行了综述，特别是在体内外效果较好的产品，为用于病毒免疫治疗的双特异性抗体药物开发与研究提供一定的参考。
关键词：抗体工程抗体治疗双特异性抗体抗病毒免疫治疗
Advances in research of bispecific antibodies for antivirus therapy
Guanxing Zhai1, Lu Lu2, Huili Lu3
, Daijie Chen3 1. College of Life Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;
2. School of Biological Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
3. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Received: January 21, 2019; Accepted: May 28, 2019; Published: June 10, 2019
Corresponding author: Huili Lu. Tel: +86-21-34204631; E-mail: roadeer@sjtu.edu.cn;
Daijie Chen. Tel: +86-21-34204528; E-mail: hccb001@163.com.
Abstract: With the rapid development of antibody genetic engineering, bispecific antibody technology has been advanced. They are capable of binding two or more different epitopes simultaneously, thus offering specific advantages over natural monoclonal antibodies in immunotherapy. Bispecific antibodies have been successfully used in cancer therapy (e.g. melanoma, Hodgkin's lymphoma, liver cancer, and stomach cancer) and inflammation therapy (e.g. rheumatoid arthritis, psoriasis and Crohn's disease), but are still in their early stage for viral immunotherapy. In this study, we reviewed the research progress of bispecific antibodies for immunotherapy of virus infections, especially those with good effects in vivo and in vitro, to provide references for the research and development of bispecific antibodies for antivirus treatment.
Keywords: antibody engineeringantibody therapybispecific antibodyantivirusimmunotherapy
病毒是引起多种人类疾病的根源，包括常见疾病如普通感冒、流感、水痘和唇疱疹，以及许多严重的疾病，如埃博拉(Ebola)、艾滋病、禽流感和SARS等[1]。此外，病毒也是引发癌症的重要因素，例如肝炎病毒可以发展成慢性病毒感染，导致肝癌[2]。抗生素能够有效治疗细菌感染，但设计类似抗生素的安全有效的抗病毒药物比较困难，原因之一是病毒会利用宿主细胞的物质进行复制[3]，使得寻找不伤害宿主并且作用于病毒的药物靶点很困难。再者，病毒极易出现变异，从而为靶向药物的设计造成了巨大困难。因此用于抗病毒的药物较少[4]。与抗生素不同，现有的大多数抗病毒药物旨在帮助治疗病毒感染，应用的抗病毒药物主要作用是干扰病毒，而不是杀灭病毒，能够作用于病毒复制的各个阶段，并不能完全清除体内的病毒[5]。同样，病毒也会产生耐药性，一个关键因素是病毒的基因组不稳定，能够不断变异[6]，从而使病毒对于以往有效的治疗方式产生耐药性[7]。
抗体药物具有特异性高、安全性好、血清半衰期长等优势，在多个领域，包括抗病毒领域已经显示了较好的应用前景[8]。多个候选单克隆抗体药物正处于临床前或临床开发阶段用于慢性病毒(如HIV-1)以及急性感染(如埃博拉病毒)的治疗[9-10]。在抗体特异性针对非宿主(即病毒)表位的情况下，安全性甚至可以比其他针对人体成分的单克隆抗体更好。
抗病毒单克隆抗体(mAb)只能靶向单个病毒表面表位，在许多病毒中，同一族不同种或不同株的糖蛋白具有高度的序列可变性，因此单克隆抗体可能对于所有株并不都有效[11]。此外，靶向单个表位的单一疗法更容易受到病毒突变的影响，从而产生抗性，并且病毒广泛存在突变逃逸能力，如流感、HIV、埃博拉等的突变[12-14]，因此，单一靶标的抗病毒单克隆抗体治疗效果并不令人满意，而由2种或更多种单克隆抗体组成的组合治疗方式正在快速发展。在肿瘤治疗等领域，具有“双靶”或“多靶”功能的双特异性抗体可同时靶向与癌症、增殖或炎症过程相关的多种表面受体或配体[15]。这种多重特异性开启了广泛的应用，包括将T细胞重定向到肿瘤细胞，同时阻断两种以上不同的信号传导途径，同时靶向不同的疾病介质，并将有效载荷传送到目标位点等。理论上，双特异性抗体同样可应用于抗病毒领域，从多个方面发挥协同或加强的治疗作用。
1 双特异性抗体的设计方案双特异性抗体可大致分为两类：免疫球蛋白G (IgG)分子和非IgG分子[16]。IgG形式双特异性抗体保留Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)[17]、补体依赖性细胞毒性(CDC)[18]和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)[19]。大部分双特异性抗体包含Fc区的免疫球蛋白，由于其较大的尺寸和Fc受体介导的循环而通常具有较长的血清半衰期，并且具有Fc介导的抗病毒作用，而非IgG形式的双特异性抗体的尺寸较小，相应地组织穿透能力增强[20]。病毒免疫治疗中，双特异性抗体与2个或多个传统单抗的组合治疗不同，具有单个分子靶向多个表位的优势。此外，双特异性抗体为设计多功能及多价抗体提供了基础与平台，目前处于研发阶段的双特异性抗体大多为IgG形式，一些非IgG的抗体也正在研发中(图 1)。
 |
| 图 1 一些常见的IgG型双特异性抗体设计方案(A：具有两个不同可变区的非对称IgG；B：同时具有Kappa-lambda轻链形式的抗体κλ-body IgG；C：具有纽扣结构Knobs-into-holes (KIH)的IgG；D：CH1与CL进行互换形成CrossMab (CH1-CL) IgG；E：CH1/CL进行正交互补突变设计降低错配形成Ortho-Fab IgG；F：具有双可变区的Dual variable domain IgG (DVD-IgG)；G：双亲和力重定向技术连接形成Dual-affinity re-targeting antibody (DART-IgG)；H：单链可变区Single-chain variable fragment (ScFv)融合于IgG形成ScFv-IgG；I：双特异性单域抗体Bispecific SdAb；J：双特异性T细胞衔接器BiTE；K：双亲和力重定向形成的DART；L：四价双特异性串联双特异性抗体TandAb[21-22]) Fig. 1 Schematic representation of some common bispecific antibody formats. (A) Asymmetric IgG with each arm engages a different epitope. (B) Fuse two antibodies with light chains (one kappa and one lambda) to form κλ-body IgG. (C) Complementary mutations are made in the CH3 domain to form Knobs-into-holes (KIH) IgG. (D) Exchange CH1 and CL to construct CrossMab (CH1-CL) IgG. (E) Cross-complementary mutation design of CH1/CL reduces mismatch formation of Ortho-Fab IgG. (F) A dual-variable domain is fused to HC and LC to form Dual variable domain IgG (DVD-IgG). (G) Dual-affinity re-targeting technique to generate Dual-affinity re-targeting antibody (DART-Ig). (H) A single chain variable fragment (ScFv) can be fused to HC to form scFv-IgG. (I) Bispeific single domain antibody. (J) Bi-specific T-cell engager antibody. (K) Dual-affinity re-targeting antibody. (L) Bispecific tetravalent TandAb antibody[21-22]. |
| 图选项 |
2 双特异性抗体双特异性抗体的靶点主要为病毒或宿主的抗原表位[23-25]。本文总结了公开发表的各种用于病毒免疫治疗的双特异性抗体的研究，如表 1所示。根据抗体发挥作用的方式，可分为3种主要的类型：1)靶向病毒抗原表位；2)同时靶向病毒与宿主表位；3)靶向宿主细胞表位。以下将进行详细探讨。
表 1 处于研发阶段的抗病毒双特异性抗体Table 1 In development of antiviral bispecific antibody
| Virus | Target | Format | Result | Reference |
| 1) Targeting 2 distinct viral epitopes | ||||
| Influenza | HA proteins | Full-sized IgG antibodies fused via their C termini | Retains the activity and stability of the two fusion antibodies | [26] |
| Head of HA protein | DART-IgG | Retained activity and ef?cacy of original antibodies in mice and ferret models | [27] | |
| HIV-1 | Various neutralizing epitopes on Env | Asymmetric IgG (CrossMAb) | Retained binding activity of original antibodies; enhanced neutralization of HIV-1 strains; better pharmacokinetic parameters compared to original antibodies | [35] |
| Two subunits of Env | scFv-Fc | Preserved the binding specificities of original antibodies; enhanced neutralization compared to original antibodies | [28] | |
| Different epitopes on adjacent GPs | Asymmetric IgG1 molecule with IgG3 hinge domain | Enhanced therapeutic activity in infected humanized mice compared to original antibodies and bispeci?c antibody without IgG3 hinge domain | [29] | |
| Hepatitis B | Different epitopes on surface antigen | DVD IgG | Enhanced neutralization activity and inhibition of hepatitis B surface-antigen secretion compared to original antibodies | [30] |
| Dengue | DII and DIII of E protein | DVD with mutated Fc-domain | Retained antigen binding activity of original antibodies; enhanced neutralization and protection in mouse model; eliminated ADE effect in vitro | [31] |
| DII and DIII of surface protein | DART-IgG with mutated Fc-domain | Retained neutralizing activity and therapeutic capacity in mice as original antibodies; enhanced affinity for isolated recombinant DENV surface protein | [32] | |
| Ebola | SUDV and EBOV GP | scFvs of EBOV antibody fused to SUDV-IgG | Exhibit neutralizing activity of original antibodies; high degree post exposure protection of mice from both viruses | [33] |
| Zika | DIII and DII of E protein | scFv of anti-DIII antibodies fused to anti-DII IgG | Retained high in vitro and in vivo potencies; robustly prevented viral escape | [34] |
| 2) Targeting host and viral epitopes | ||||
| HIV-1 | Env and CD4 | scFv of anti-Env antibodies fused to anti-CD4 IgG | Exhibited exceptional breadth and potency compared to original antibodies; neutralization of strains resistant to original antibodies | [24] |
| CD4 and CD4 induced epitope | Anti-CD4i single domain antibody fused to CD4 IgG | Enhanced neutralizing activity and potency compared to original antibodies; neutralization of strains resistant to original antibodies | [36] | |
| Various neutralizing epitopes on Env and CD4 or CCR5 | Asymmetric IgG (CrossMAb) | Enhanced neutralizing activity compared to original antibodies; reduction of virus load in infected humanized mice; provided complete protection when administered prior to virus challenge | [37] | |
| Ebola | Receptor binding site of GP and NPC1 | DVD IgG | Neutralized all known ebolaviruses and conferred postexposure protection against multiple ebolaviruses in mice | [38] |
| 3) Recruiting host cell machinery | ||||
| Dengue | Primate CR1 and DENV GP | Thioester Cross-linked IgGs | Facilitated speci?c and rapid binding of DENV to human and monkey erythrocytes; clearance of DENV viremia in cynomolgus macaques | [39] |
| Marburg | Primate CR1 and Marburg GP | Thioester Cross-linked IgGs | Facilitated speci?c and rapid binding of Marburg GP to monkey and human erythrocytes | [40] |
| CMV | CD3 and CMV | Thioester Cross-linked IgGs | Redirected specific cytotoxicity to CMV infected cells | [41] |
| HIV | CD3 and CD4 induced Env | DART-IgG | Mediated CD8+ T-cell clearance infected cells; reduction of latently infected CD4+ T cells in vitro; in vivo safety in ART-treated HIV-infected patients | [42] |
表选项
2.1 靶向病毒抗原表位的双特异性抗体靶向2种不同病毒表位的双特异性抗体可能具有更好的效力和作用广谱性。Wagner等设计出将2个抗流感病毒不同抗原的IgG抗体通过分选酶与点击化学进行C末端连接融合，所得到的C-C融合的抗体不需要在抗体结构上改变，具有较好的稳定性与Fc受体结合能力，该抗体二聚体在小鼠模型中保留了两个亲本抗体的活性，在体外实验中对H3N2与H1N1流感病毒均有较好的结合能力。然而，C-C融合可能具有免疫原性，需进一步研究[26]。Zalin等开发出2个针对不同H5N1流感病毒株的中和单克隆抗体，并将2个单克隆抗体的可变区与Fc融合为双特异性DART-IgG抗体。DART-IgG抗体是由包含2个Fc融合蛋白链通过聚合作用形成，一个多肽链通过Gly-Ser接头连接第一抗体的轻链可变区(VL)和第二抗体的重链可变区(VH)，并且第二个多肽含有互补可变区。通过2个链的异二聚化引起DART的组装，并产生双特异性和四价的单一抗体。在小鼠感染模型中，抗流感病毒DART-IgG具有两种亲本单克隆抗体的广谱活性和保护效力。另外，DART-IgG在受感染的雪貂模型中表现出100%的保护。因此，DART-IgG疗法是针对H5N1禽流感病毒有效的治疗方法[27]。
与流感病毒相似，对于靶向HIV-1的包膜蛋白(Env)的双特异性抗体，也具有增强的活性。Asokan等通过CrossMab技术构建非对称双特异性IgG，其中每个臂可以单独结合不同的Env，这些双特异性抗体在一些情况下显示出比亲本抗体更广的作用范围，平均能够中和94%–97%具有抗原多样性的206株HIV-1，将具有最高中和活性的双特异性抗体静脉注入恒河猴内，显示出与其亲本抗体组合相似的药代动力学特性。为了验证增加亲本抗体的亲和力可以增强抗体的中和活性这一想法，Mouquet等将工程化的scFv-Fc IgG分子，与HIV-1 Env的2个不同亚基结合。结果表明，与亲本抗体相比，异型结合的抗体增强了中和作用[28]。通过设计包含IgG3铰链结构域的不对称双特异性IgG1分子，Bournazos等也报道了靶向不同的HIV-1 Env的双特异性抗体，IgG3铰链结构域的长度和灵活性允许抗体进行异二价结合HIV-1的2个相邻糖蛋白上的表位，从而增加抗体亲和力，同时促进靶点失活。与未修饰的不对称双特异性分子相比，具有修饰的铰链结构域分子在病毒中和以及HIV-1感染的人源化小鼠的保护中更具有协同活性，更具有优越性[29]。
Tan等利用来自抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的两种具有协同中和活性的单克隆抗体，重组获得DVD形式的双特异性抗体C4D2-BsAb。第一个抗体的VH和VL分别通过短肽接头与第二抗体的重链和轻链的N末端基因融合，从而保留IgG分子的Y形。这样的结构使得其相对于亲本抗体来说具有更加优异的HBV中和活性，这种活性可能是通过空间位阻或诱导HBsAg构象改变来实现的[30]。Shi等基于2个抗DENV的单克隆抗体1A1D-2 (1A1D)与2A10G6 (2A10)设计出DVD形式的双特异性抗体DVD-1A1D-2A10，其中，1A1D1抗体能够与E-DIII结合从而阻止病毒附着在细胞表面，同时2A10抗体能与E-DII结合进而能够阻止病毒与内体膜融合。双特异性抗体DVD-1A1D-2A1同时保留了两个亲本抗体的抗原结合活性，更重要的是，此双特异性抗体无论在体外还是在体内，与亲本抗体相比具有更好的DENV中和效果。为了消除抗体依赖性感染增强作用(ADE)，DVD-1A1D-2A10经过设计能够防止其与FcγR (Fc-gamma receptors)的相互作用。综合分析，DVD-1A1D-2A10抗体能够同时针对病毒入侵宿主细胞的附着和融合阶段，广泛中和所有4种血清型的DENV而没有ADE的风险，因此其作为针对DENV的新型抗病毒策略具有巨大潜力[31]。此外，Brien等报道了IgG融合的DART蛋白，也将其改造使之缺乏Fc-γ-R结合能力并且能同时结合DENV病毒粒子表面2个不同的空间表位DII和DIII。改造过的分子在体外具有中和活性及小鼠ADE疾病模型中的治疗作用，并且观察到四价DART-Ig对DENV E蛋白亲合力的改善并未在体外和体内转化为更好的病毒抑制活性，这可能是由于DENV病毒体的类似二十面体结构，排除了同时识别相邻表位所必需的结合几何结构[32]。2015年，Frei等用抗体工程的方法开发出针对埃博拉病毒新型的双特异性抗体，其中萨伊伊波拉病毒(Zaire, Ebola亚种)的特异性抗体的scFv与苏丹病毒(SUDV，Ebola亚种)特异性抗体的N末端和C末端融合。这两个病毒虽然差异较大，但从1976年至2014年共同占了埃博拉病毒相关死亡人数的95%。双特异性分子表现出有效的中和作用，这些双特异性抗体对两种埃博拉糖蛋白假型病毒以及真正的病原体都表现出了有效的中和作用，并且对两种病毒感染的小鼠具有高度(在一种情况下为100%)暴露后的保护[33]。2017年，Wang等开发了一种抗寨卡病毒(ZIKA)的双特异性抗体FIT-1，其由ZKA190单克隆抗体和针对E蛋白DII抗原的第二种抗体组成。除了保持高的体外和体内效力外，FIT-1还能有效地阻止病毒逃逸，因此可以将其开发为ZIKV的免疫疗法[34]。
2.2 同时靶向病毒与宿主表位的双特异性抗体靶向病毒与宿主表位的双特异性抗体分别靶向病毒的表位与免疫细胞的表位，有利于细胞毒性T细胞等锚定病毒并进行杀灭。机体抗病毒反应主要依赖于T细胞，包括细胞毒性T细胞(CD8+)能够杀死被病毒感染的细胞，诱导型T细胞(CD4+)能够释放细胞因子如肿瘤坏死因子与γ干扰素(IFN-γ)等。Pace等开发了一种针对HIV的双特异性抗体，是由广泛中和抗Env抗体的scFv通过Gly-Ser接头与人源化抗CD4抗体的N末端融合而成[24]。与此相似，Sun等设计了另一种特异性抗体，是由2个拷贝的CD4诱导的Env表位的单域抗体通过Gly-Ser接头与抗CD4抗体的C末端融合而成，两种双特异性分子均显示出改善的抗病毒活性，能够中和在体外表现出对亲本抗体耐药的病毒株[36]。为了设计保持正常IgG结构的协同双特异性抗体，Huang等应用CrossMab技术开发了不对称IgG，其中Fab采用抗CD4或抗CCR5抗体，其中两种分子在一组HIV-1分离株中显示出增加的中和活性，并且一种抗体显著降低了HIV感染的人源化小鼠的病毒载量[37]。
与HIV不同，Ebola的保守丝状病毒糖蛋白GP (Glycoprotein)与其宿主细胞表面受体Niemann-Pick C1 (NPC1)之间的必需相互作用作为mAb靶标。但是，由于其形成胞内体的原因，这种作用受到影响。Wec等描述了靶向这种相互作用的双特异性抗体策略，其中对NPC1特异性的mAb或GP受体结合位点与针对保守的表面暴露的GP表位的mAb偶联。此双特异性抗体为DVD形式的IgG。双特异性抗体通过将所有已知的埃博拉病毒结合，将其传递至内膜并中和，能够对小鼠多种埃博拉病毒暴露后起到保护作用。Wec形象地将这种双特异性抗体比作“特洛伊木马”，具有广泛的抗丝状病毒免疫治疗潜力[38]。
2.3 招募宿主细胞的双特异性抗体双特异性抗体分子也可用于招募宿主细胞免疫系统。基于此点，Hahn等开发了针对登革热病毒的双特异性复合物HPs (Heteropolymers)，灵长类E补体受体1特异性的单克隆抗体与另一种对靶抗原具有特异性的单克隆抗体通过硫醚键交联，该HP显示了与登革热糖蛋白和灭活马尔堡病毒结合的病毒免疫治疗潜力，并能在体外特异性结合猴和人红细胞及各自抗原。此外，当登革热特异性HP用于受感染的食蟹猴时，证实了对登革热病毒血症的治疗效果[39-40]。
设计能够激活和引导细胞毒性T细胞对靶点作用的双特异性分子是一大趋势。包含抗原特异性臂和抗CD3臂的抗体，其激活并将细胞毒性CD8+ T细胞重定向至抗原特异性细胞[43]。T细胞在癌症免疫疗法中取得了巨大成功，因而采用类似策略清除病毒本身或感染细胞的可能性很大。因此，在针对巨细胞病毒(CMV)的治疗中，Lum等将抗CD3激活的T细胞(ATCs)通过化学异源偶联与抗CD3×CMV双特异性抗体(CMVBi)结合并靶向清除CMV感染的细胞。极低剂量的CMVBi，低至0.01 ng/106 ATCs能够介导针对CMV感染的靶细胞的特异性细胞毒性(SC)。在特定的效应物-靶标比例下，能够显著增强对CMV感染靶标的杀伤。这种非主要组织相容性复合物(MHC)限制性靶向CMV的策略可用于预防或治疗异基因干细胞移植或器官移植后的CMV感染[41]。在HIV免疫治疗中，Sung等开发了一种免疫治疗方式，旨在改善T细胞介导的HIV-1感染细胞的清除。具体而言，通过采用双亲和DART抗体，可同时结合2种不同的细胞表面分子。该DART具有单价HIV-1包膜结合(Env结合)臂，该臂来自广泛结合的抗体依赖性细胞毒性介导抗体，能够与HIV感染的靶细胞结合，该臂与单价CD3结合臂偶联，招募细胞溶解效应T细胞(称为HIVxCD3 DART)。因此，这些DART重定向多克隆T细胞以特异性地接触并杀死表达Env的细胞，包括不同HIV-1亚型感染的CD4+ T细胞，从而避免了对HIV特异性免疫的需要。使用来自抑制性抗逆转录病毒疗法(ART)患者的淋巴细胞，证明DART介导CD8+ T细胞能够清除被HIV-1株JR-CSF重复感染或感染了从HIV感染患者分离病毒的静息期CD4+ T细胞。此外，在诱导潜伏期的病毒表达后，DART能够介导CD8+ T细胞能对静息期CD4+ T细胞中HIV的清除作用。与HIV潜伏期抗逆转录病毒药物相结合，HIVxCD3 DART有可能成为有效的免疫治疗剂，以清除HIV感染者的潜伏期HIV-1[42]。
3 双特异性抗体的研发趋势理想的治疗性双特异性抗体具有体内半衰期长、组织渗透性强等特性[44]。目前处于开发中的大多数双特异性抗体为IgG全长形式，这种形式的分子具有较好的稳定性和效应功能，但它们的大尺寸限制了其组织穿透能力。相反，抗体片段类的分子如scFv、Fab，缺少Fc段的抗体片段由于半衰期较短，有时需要PEG修饰等方法延长其血清半衰期[45]才能适合临床需求，但由于其较小的尺寸而具有更高的渗透能力，也是开发的方向之一。而双特异性抗体的制备依赖于平台技术，理想的开发过程需要从发现、临床前研究到临床生产的整个链条进行开发，以便在短时间内快速发现有效的抗体组合并进行临床级别的制备。在设计抗体形式时，简化结构和生产过程以及利用强大的生产平台是关键。
在病毒免疫疗法的特定背景下，双特异性及多特异性抗体的药物代谢动力学和免疫原性对成药性非常重要，但目前仍很少受到关注。一方面，融合分子的性质可能导致某些组合中的构象变化或错误折叠，从而影响IgG免疫缀合物的药代动力学[46]。另一方面，双特异性抗体的大分子量特性，加之其可能发生聚合，导致潜在的免疫原性风险[47]，尤其与免疫增强剂结合使用则可能会引发人体强烈的免疫反应。我们期待随着越来越多的治疗性的双特异性抗体进入临床试验甚至应用于临床治疗，能够提供更坚实的数据，帮助研究者不断提高对免疫原性及药代动力学的研究水平。
双特异性抗体的质量控制问题是其发展的最大制约因素，传统的单克隆抗体在质量控制上需要考虑抗体的鉴别、结构与理化特性、生物学活性分析、纯度和杂质、安全性等问题。双特异性抗体与单克隆抗体相比，其结构及生产工艺相比更为复杂，需要更多考虑其错配情况及目的产物的效率、结构与理化特性、生物学活性。首先，在设计双特异性抗体的时候，需要对抗体结构进行更好的设计，以降低错配率及提高产物效率，例如采用CrossMab技术能够减少重链与轻链的错配情况[48]。其次，在生产过程中，需要优化生产工艺，尽量减少副产物的产生，提高所需样品的纯度及稳定性。最后是对双特异性抗体的各种指标进行检测，检测主要侧重在以下几个方面：对产物效率及错配情况的检测，可采用液质谱联用(LC-MS)、疏水作用色谱(HIC)、二维LC-MS，能够有效地检测双特异性抗体的错配情况及产物的效率[49]。结构与理化特性主要对其聚体与降解物、电荷异质性、完整与还原分子量、氨基酸序列覆盖率、糖基化、翻译后修饰、二硫键、高级结构等进行检测，目前采用的技术有尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)、毛细管电泳(CE)、超高效液相色谱(UPLC-FLD)、埃德曼降解法(Edman degradation)、阳离子交换色谱(CEX-HPLC)、圆二色谱(CD)、差示扫描量热法(DSC)、傅里叶转换红外光谱(FTIR)等技术。生物学活性检测方面主要检测抗体的FcR结合活性、亲和力以及功能生物学活性方面，可以采用ELISA、Biacore、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、混合淋巴性反应(MLR)检测等。随着较多的新的检测技术的发展，能够推进双特异性抗体的制备及质控技术快速发展。
值得探讨的是，嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞治疗作为一种新型的免疫治疗方式，通过对患者的自体T细胞进行遗传修饰以表达对肿瘤抗原特异的抗体，从而靶向肿瘤进行治疗。靶向CD3的双特异性抗体与某些CAR-T分子的设计有异曲同工之妙，作用机制也类似，因此CAR-T细胞治疗对双特异性抗体的设计和研究具有借鉴意义。除了针对白血病和淋巴瘤的CAR-T已经取得了很大的进展外[50]，目前已有针对病毒感染的CAR-T治疗方法的研究，其中，研究人员将人表皮生长因子受体2-CAR (HER2-CAR)置于能识别巨细胞病毒(CMV)的T细胞中。这些CMV特异性细胞毒性T细胞(CMV-T细胞)更加活跃，它们对病毒以及肿瘤细胞都具有免疫反应，目前这种CMV特异性CAR-T已经处于临床Ⅰ期[51]。在另一项研究中，EBV特异性CAR-T细胞能够识别并杀死EB病毒(EBV)感染的细胞，从而防止EBV相关的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)复发[52]。虽然针对病毒的CAR-T研究不多，我们预期这将成为一个重要的研究方向，并为开发新型的抗病毒双特异性抗体药物开拓思路。
4 总结双特异性抗体的研发在肿瘤治疗领域已取得了巨大进步，而在病毒的免疫治疗方面尚处于起步阶段，而双特异性抗体作用途径及作用机制的前期积累，能够为其抗病毒治疗提供研究借鉴。此外，双特异性抗体由于结构复杂，其制备和质控均较为困难，随着近年来基因工程、蛋白质工程研究的进步，新的技术不断涌现，已能够较好地解决这些难题，例如本团队采用具有自剪接功能的天然分裂式split-intein设计的BAPTS (Bispecific antibodies by protein trans-splicing)技术平台即可实现双特异性抗体的高效制备[53]，从而推动新型双特异性抗体在抗病毒领域的研究和开发。
本文综述了应用于病毒治疗的各种双特异性抗体的研发现状及未来趋势，希望为本领域的研究人员提供一定的参考。总之，在单一靶点的单克隆抗体药物不能完全提供治疗效果的情况下，双特异性抗体能够发挥更好的附加效果或协同效果，从而增强病毒的免疫治疗效果，将双特异性抗体单独使用或与其他抗病毒疗法联合，必将成为开发下一代疗法的机会。
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