1. 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122;
2. 江南大学 酿酒科学与工程研究室，江苏 无锡 214122
收稿日期：2018-12-11；接收日期：2019-02-18；网络出版时间：2019-04-17
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31571942, 31601558, 31771963)，江苏省现代工业发酵协同创新中心资助
摘要：酵母细胞壁在细胞形态学的建立和维持中起重要作用，有助于细胞抵御环境变化。细胞壁主要由β-葡聚糖、甘露糖蛋白和几丁质组成，其组成和结构会由于压力胁迫发生动态重构。同时为了适应环境压力变化，啤酒酵母细胞壁在长期驯化过程中表现出相关压力应答机制。文中介绍了啤酒酵母细胞壁组成与结构，并综述了细胞壁重构与信号通路调控的分子机制。
关键词：啤酒酵母细胞壁压力应答细胞壁重构信号通路
Progress in brewer's yeast cell wall stress response
Mingfang Zhang1,2, Jinjing Wang1,2, Chengtuo Niu1,2, Yongxian Li1,2, Feiyun Zheng1,2, Chunfeng Liu1,2, Qi Li1,2
1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
2. Laboratory of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: December 11, 2018; Accepted: February 18, 2019; Published: April 17, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571942, 31601558, 31771963), Collaborative Innovation Center of Jiangsu Modern Industrial Fermentation in Jiangnan University
Corresponding author: Qi Li. Tel: +86-510-86918176; Fax: +86-510-85805219; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn.
Abstract: Yeast cell wall plays an important role in the establishment and maintenance of cell morphology upon the cell wall stress. The cell wall of yeast consists of β-glucans, mannoproteins and chitin. The composition and structure remodel due to cell wall stress. Brewer's yeast cell wall exhibits stress response during long-term acclimation in order to adapt to environmental changes. This paper reviews the composition and structure of yeast cell wall and the molecular mechanisms of cell wall remodeling and signal pathway regulation.
Keywords: brewer's yeastcell wallstress responsecell wall remodelingsignal pathway
细胞壁作为酵母细胞最外层结构具有保护细胞、维持细胞形态、为细胞表面蛋白提供吸附支架等功能，且能够通过信号通路感应环境的变化进行调控来维持细胞壁完整性[1]。啤酒酵母Saccharomyces pastorianus受到各种环境压力的胁迫时易发生自溶[2]，细胞壁结构逐渐疏松，同时细胞壁组分发生缓慢降解[3]。因此，细胞壁对环境压力的应答在维持细胞形态中发挥重要作用[4-5]。
酵母细胞壁对环境压力应答的途径主要有细胞壁重构和信号通路调控。细胞壁重构包括组成重构和交联重构，受到环境压力胁迫时，细胞壁的组分含量增加，与交联相关基因表达量发生变化，同时相关交联结构增强[6-7]。细胞对不同压力的应答涉及多种信号通路和信号因子，信号通路调控压力信号的转导，从而使相关基因的表达量发生变化[8]。文中介绍了啤酒酵母的细胞壁组成、结构与交联，综述了酵母细胞壁在压力胁迫下的细胞壁重构动态变化及其信号通路调控机制，为提高啤酒酵母压力耐受性和研究压力应答机制提供理论依据与参考。
1 酵母细胞壁组成与结构1.1 细胞壁组成酵母细胞壁约占细胞干重的15%-30%，主要由甘露糖蛋白、β-葡聚糖和少量的几丁质组成[9]。通过电子显微镜观察得到细胞壁分为两层，外层富含甘露糖蛋白，内层主要物质为葡聚糖与少量几丁质。葡聚糖分为β-1, 3-葡聚糖和β-1, 6-葡聚糖。β-1, 3-葡聚糖一般通过β-1, 3键由1 500个葡萄糖残基构成线性分子，作为细胞壁的骨架与其他组分相交联，是最为重要的组分。几丁质只占细胞干重的1%-2%[10]，是由氨基葡萄糖残基通过β-1, 4键合成的链状结构，通常位于母细胞与新生芽体之间和新分离子细胞的侧壁中。几丁质使细胞具有一定刚性并在细胞分裂中起重要作用，虽然在细胞壁组分中含量微少，但却是细胞生长所必不可少的。甘露糖蛋白占细胞壁干重的30%-50%，由甘露聚糖和经过糖基化修饰的蛋白组成，分为磷脂酰肌醇蛋白(Glycosylphosphatidylinositol cell wall proteins，GPI-CWPs)和内重复蛋白(Proteins with internal repeats，Pir-CWPs)[11]。
1.2 细胞壁结构与交联酵母细胞壁是具有高度弹性、连续的三维网络，β-1, 3-葡聚糖是网络的骨架，其他组分作为侧链相互交联延伸构成复杂的细胞壁网络系统(图 1)。以β-1, 3-葡聚糖为主体，细胞壁多糖之间有3种交联方式[9]。首先是几丁质还原端通过β-1, 4键与β-1, 3-葡聚糖连接，此为最主要的多糖交联方式(图 1B)。β-1, 3-葡聚糖为具有柔性的螺旋状分子结构，赋予细胞壁一定的弹性，而几丁质的刚性会影响β-葡聚糖的溶解度。第2种方式是几丁质还原端通过β-1, 3-葡萄糖与β-1, 6-葡聚糖连接(图 1A)。第3种连接是β-1, 3-葡聚糖通过β-1, 6-葡萄糖相互连接，使细胞壁葡聚糖形成紧密网络(图 1C)。多糖之间的交联构成细胞壁内层，甘露糖蛋白的交联则构成细胞壁外层。GPI-CWPs通过糖苷键与β-1, 6-葡聚糖连接，是最多的细胞壁蛋白与多糖的交联方式(图 1D)。Pir-CWPs是通过蛋白质重复序列中谷氨酸的羧基以酯键与β-1, 3-葡聚糖中的羟基相连，对碱敏感(图 1E)。而蛋白之间是由二硫键连接，可通过SDS解链(图 1F)[11]。
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| 图 1 细胞壁结构与交联[9] Fig. 1 Cell wall structure and cross-linking[9]. |
| 图选项 |
2 细胞壁重构与环境压力应答细胞壁中各组分相互交联，赋予其既坚硬又具有弹性的特性，具有维持细胞形态、保护细胞等功能。细胞壁具有高度动态性，酵母细胞壁的组成和结构会由于环境压力发生动态变化，通过细胞壁重构对环境压力进行应答[12]。细胞壁重构(Cell wall remodeling)是指破坏细胞壁组分之间的交联，以及将新合成的多糖经糖基化酶进行伸长、分枝和交联到原有的细胞壁中[13]。细胞壁组成和交联、细胞壁刚性和弹性在环境压力应答过程中发生相应变化[14]。
2.1 细胞壁组成重构细胞壁重构一般会造成细胞壁多糖组成变化，组分含量的增加能够提高细胞壁的刚性。β-葡聚糖链是细胞壁的骨架，因此β-葡聚糖含量的提高有助于维持细胞壁完整性和抵御发酵过程中的环境压力[15]。甘露糖蛋白位于细胞壁最外层直接与外界环境接触，在高渗透压环境下，甘露糖蛋白含量增加使得外层结构更为紧密以适应环境压力[16]。为了提高菌株抗压能力，可通过改造酵母获得细胞壁刚性菌株。本研究组通过复合压力平板对传统紫外线诱变处理过的啤酒酵母菌株进行筛选，得到两株抗压能力明显提高的菌株。对细胞壁的多糖组分进行分析发现葡聚糖与甘露聚糖含量均明显增加，使得细胞壁能更好地抵挡外界环境因素的干扰[17]。
由于酵母细胞壁复杂的交联结构，研究两种或多种组分之间的动态变化关系有助于进一步解析细胞壁重构对环境压力的应答机制。改变啤酒酵母的生长pH与培养基中甘油浓度，甘露聚糖蛋白和β-1, 6-葡聚糖的含量均有增加，且P < 0.05具有显著性，相关系数r=0.661[18]。Sestak等敲除酵母中编码细胞壁蛋白的SCW4和SCW10基因，发现葡聚糖与甘露聚糖的含量没有显著变化；依次利用β-1, 3-葡聚糖酶和β-1, 6-葡聚糖酶水解细胞壁测定游离葡萄糖与甘露糖，发现甘露聚糖与β-1, 6-葡聚糖的交联发生变化，与野生菌相比甘露聚糖与几丁质的交联程度增加。说明基因敲除所导致的细胞壁重构不仅表现在组分含量的变化，还表现在细胞壁组分之间的交联变化[19]。
2.2 细胞壁交联重构2.2.1 甘露糖蛋白-葡聚糖交联重构对酵母自溶全过程进行跟踪发现，由于葡聚糖酶水解葡聚糖导致细胞壁内层失去其纤维状连续结构，随后细胞壁内外层交联紊乱，细胞壁逐渐降解[20]。因此细胞壁蛋白与多糖之间的正常交联是保证细胞进行生理活动的基础之一，其中GPI-CWP→β-1, 6-葡聚糖→β-1, 3-葡聚糖是正常状态下最主要的交联方式。
在该结构中，甘露糖蛋白提供细胞壁表面的负电荷和亲水基团，与酵母细胞的絮凝性有关。啤酒酵母的絮凝有助于酵母本身抵抗发酵期间的酒精胁迫和保持细胞活性，且甘露糖蛋白具有高度交联的刚性结构，这些特性共同增强酵母对渗透压和分解酶的抗性。在啤酒发酵过程中，随着CO2的产生啤酒酵母处于厌氧环境，与酵母絮凝性有关的甘露糖蛋白CWP基因和DAN基因的表达量发生变化，调控细胞壁交联以应答环境压力[21]。作为对多重压力的应答机制之一，甘露糖蛋白和葡聚糖会发生交联重构。据报道啤酒酵母在经过3-7次发酵周期后甘露糖蛋白表现出更紧密的交联结构并且含量增加；(α1→4)-糖苷键和(β1→4)糖苷键的交联结构的增加超过(1→3)糖苷键，这种类纤维素的结构对细胞刚性的增强十分重要[22]。
甘露糖蛋白-葡聚糖交联主要由葡聚糖重构酶负责，包括Gas1p、Exg1p和Bgl2p，其在细胞壁合成与压力应答的过程中活跃着。Gas1p为GPI锚定蛋白，负责β-1, 3-葡聚糖的延长并且涉及酵母对低pH、高渗透压力的适应机制；Exg1p和Bgl2p分别具有外、内切-β-1, 3-葡聚糖酶活性，参与β-1, 3-葡聚糖和β-1, 6-葡聚糖的重构。目前对于葡聚糖重构酶参与环境压力应答机制的研究多在酿酒酵母中，发现过量表达GAS1能够增强酵母对低pH和高渗透压的抗性[23]，敲除BGL2基因引起几丁质含量上升[24]，敲除与过表达EXG1基因分别导致β-1, 6-葡聚糖含量上升和下降[25]。这些研究结果对啤酒酵母细胞壁环境压力应答机制的研究具有借鉴意义。
2.2.2 葡聚糖-几丁质交联重构增强葡聚糖-几丁质的交联结构是细胞对环境压力的应答之一，其中GPI-CWP→β-1, 6-葡聚糖←几丁质这一交联起到重要作用。葡聚糖与几丁质的交联由Crh1p和Crh2p进行催化合成。Crh1p和Crh2p为转糖基酶，主要负责几丁质与β-1, 3-葡聚糖、β-1, 6-葡聚糖之间的交联[26]。酵母细胞壁对环境压力的应答使得CRH的表达受到调控，葡聚糖-几丁质交联结构随之进行重构，有利于增强细胞壁的刚性。葡聚糖-几丁质交联程度的测定可用C14同位素标记法特异性标记几丁质，用不同的水解酶，如β-1, 3-葡聚糖酶、β-1, 6-葡聚糖酶和几丁质酶处理细胞壁，然后羧甲基化后通过排阻色谱比较各馏分[27]。酵母中大约40%的几丁质是游离的，而与β-1, 3-葡聚糖和β-1, 6-葡聚糖交联的几丁质含量分别占总含量的40%-45%和15%-20%。
虽然细胞壁中几丁质含量微少，但是β-葡聚糖与几丁质交联组成的细胞壁骨架在细胞壁生物合成和完整性中起关键作用，也是决定细胞壁物理性质的重要因素。细胞壁组分的交联结构赋予细胞壁一定的刚性，这种刚性使得细胞壁在面对环境压力急剧变化时能够有效控制细胞体积变化，有利于压力的缓冲[14]。同时β-葡聚糖的合成影响葡聚糖-几丁质交联结构，从而导致酵母细胞壁完整性发生变化。Wang等通过敲除酵母细胞壁β-1, 3-葡聚糖合成酶FKS1、FKS2基因，发现菌株表现出对渗透压和细胞壁抑制剂的高度敏感，β-1, 3-葡聚糖的合成在细胞应答环境压力过程中不可或缺[28]。
3 信号通路调控与环境压力应答环境压力应答过程中酵母细胞壁的多糖含量平衡、交联类型调整、重构酶调节等变化是由于细胞壁有关基因表达改变而引起的。环境压力激活细胞相应信号转导通路，从而调节通路相关基因表达和代谢[29]。
3.1 CWI信号通路有不少信号通路参与其中，其中酵母细胞壁完整性(Cell wall integrity，CWI)信号通路起到主要调控作用。CWI信号通路由MAPK级联系统介导，首先由细胞壁压力感应因子Wsc1-3p、Mid2p和Mtl1p作用于鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs) Rom2p，激活Rho1p。Rho1p是CWI信号通路的主要调节因子，不仅负责细胞外界信号的输入还涉及细胞壁合成、蛋白分泌信号的输出。随后蛋白激酶C (Protein kinase C，Pkc1)被激活[30]，Pkc1p作为MAPK级联系统的核心，激活MAPK模块使Bck1p磷酸化，再由Bck1p将信号传导至Mkk1p/Mkk2p，最终激活Slt2p。Slt2p作用于环境压力应答的Rlm1p和调控细胞周期的Swi4/6p两个转录因子。Rlm1p调节至少25个基因的表达，大多数与细胞壁蛋白或细胞壁应激蛋白的编码有关[31]。作为酵母细胞壁环境压力应答最重要的途径之一，CWI信号通路上的基因表达调控对酵母细胞适应压力环境显得尤为重要。负责β-1, 3-葡聚糖合成的FKS家族基因包括FKS1、FKS2和FKS3。Fks1p和Fks2p分别为催化亚基(Catalytic subunit)和调节亚基(Regulatory subunit)。Fks3p是Fks1p的同源蛋白，与Fks1p和Fks2p有56%的同源性，通过调节葡聚糖合成影响子囊孢子壁的形成。FKS家族基因的缺失会激活CWI信号通路，导致细胞壁重构。本研究组敲除了酵母的FKS3基因，CWI信号通路上游的感应因子WSC2基因表达量发生明显上调，细胞壁葡聚糖含量增加，重组菌的抗自溶能力增强[32]。WSC2基因的上调有利于细胞壁快速应答环境变化，增强对环境的适应能力。此外，与WSC2基因同为感应因子的MID2和MTL1基因在酵母自溶过程中转录水平发生下调。啤酒酵母自溶过程中细胞壁受到外界压力胁迫，细胞壁对低渗、氧化等压力的感知降低，MID2和MTL1基因的转录水平下调导致细胞壁对于这些压力的抵御能力下降[33]。
3.2 CWI与HOG信号通路的共同调控尽管CWI信号通路是细胞壁的主要调控路径，但是维持细胞稳定必然需要与其他信号通路共同调控。HOG (High-osmolarity glycerol)信号通路和CWI信号通路同属于级联调控，主要调控细胞对高渗透压的应答。HOG信号通路包含Sho1p和Sln1p两条分支：Sho1p支路由Sho1p、Hkr1p和Msb2p感应因子传递信号，激活PAK家族的Ste20p，随后级联调控启动，Ste11p、Pbs2p、Hog1p依次被激活；Sln1p支路的压力信号通过应答调节蛋白Ypd1p和Ssk1p传递至Ssk2p/Ssk22p级联调控，磷酸化激活Pbs2p和Hog1p。被激活的Hog1p作用于多个转录因子，从而调控细胞应答环境压力[34]。在啤酒酵母自溶过程中，感应因子HKR1、MSB2和MAPK模块中的SSK1、SSK2/22、PBS2基因表达发生明显上调，说明环境压力激活了细胞的抗渗透压能力[35]。啤酒酵母在高渗透压环境下连续发酵20代，发现PBS2基因表达明显上调，细胞调节HOG信号通路上基因表达以适应环境的渗透压力[36]。
当酵母受到温度压力时，CWI信号通路起主要调控作用。感应因子Wsc1p和Mid2p传递压力信号激活通路，调控细胞应激基因表达，导致细胞膜流动性增加，胞内海藻糖积累[37]。同时观察到Sho1p和Hog1p发生高度磷酸化，说明HOG信号通路的Sho1p分支共同参与热压力的应答调控[38]。当酵母受到高渗透压胁迫时，细胞膨压减小、体积缩小。胞内甘油的溶出和细胞膨压的变化激活HOG信号通路，引起胞内甘油积累。随后胞内甘油水平的变化导致CWI信号通路的Slt2p级联调控模块被激活，有助于细胞维持细胞壁形态以抵御外界渗透压胁迫[39]。对于氧化压力应答来说，Sln1p和Sho1p通路基因缺失的酵母表现出对过氧化氢的高度敏感，且Hog1p发生高度磷酸化，说明CWI和HOG信号通路共同作用于细胞的氧化压力应答[40]。酵母细胞在Zymolyase压力胁迫下，HOG和CWI信号通路之间的共同调控现象更为明显。Zymolyase是一种β-1, 3-葡聚糖酶，能够抑制细胞壁合成。细胞壁损伤压力由Sho1p途径传导至Hog1p，随后激活CWI信号通路上的Rho1p引发下游的调控，补偿细胞壁损伤。这种调控过程不涉及CWI信号通路的上游感应因子与鸟嘌呤核苷酸交换因子，CWI通路的激活依赖于HOG通路的信号传导[41] (图 2)。
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| 图 2 细胞壁完整性(CWI)信号通路与高渗透性甘油(HOG)信号通路[42] Fig. 2 The cell wall integrity (CWI) signaling pathway and the high-osmolarity glycerol response (HOG) signaling pathway[42]. |
| 图选项 |
因此，酵母受到上述压力胁迫时HOG和CWI信号通路的应答有所不同，Hog1p的磷酸化快速且短暂，而Slt2p在其后才被激活且可维持一段时间。HOG信号通路对环境压力作出快速应答，CWI信号通路在HOG通路被激活的情况下参与维持细胞壁的稳定性，二者的共同调控机制用于维持细胞的正常生理活动，高效精确地应答多种环境压力。这种与CWI途径复杂的共同调控现象的机制研究在酿酒酵母中已有了一定的进展，然而在啤酒酵母中仍需进一步研究。
4 展望啤酒酵母是决定啤酒质量的重要因素之一，优良的酵母需要具有高发酵能力、抗环境压力与抗自溶能力等条件，使其对环境压力的变化具备快速适应能力和耐受性。目前啤酒酵母细胞壁压力应答的研究多在于发酵或自溶过程中细胞壁多糖组分变化和细胞壁压力应答基因研究，但对于细胞壁重构的酶及组分交联的详细机制仍需要进一步了解。基于细胞壁组分交联对酵母刚性的贡献，可增强和改造组分交联结构提高酵母耐压能力。酵母在压力应答过程中涉及基因表达水平和胞内代谢物的变化，通过转录组学、蛋白组学以及代谢组学的分析可对酵母环境压力应答机制有更全面的了解。通过了解啤酒酵母细胞壁的动态变化及其环境压力应答机制，有利于提高啤酒质量，指导传统方式育种选育环境耐受性和抗自溶性能优良的工业啤酒酵母，促进啤酒行业发展。
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