1. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122;
2. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122
收稿日期：2018-12-25；接收日期：2019-01-31；网络出版时间：2019-03-12
基金项目：国家优秀青年科学基金(No. 21822806)，国家自然科学基金(No. 31770097)资助
摘要：酪氨酸是三大芳香族氨基酸之一，广泛用于食品、医药和化工等领域。转运系统工程为代谢工程改造大肠杆菌选育酪氨酸生产菌株提供了一种重要的研究策略。大肠杆菌中酪氨酸胞内转运主要通过aroP和tyrP基因编码的通透酶进行调控。以酪氨酸生产菌株HGXP为出发菌株，利用CRISPR-Cas9技术成功构建了aroP和tyrP基因敲除菌，并通过发酵试验考察了调节转运系统对酪氨酸生产的影响。发酵结果表明，aroP和tyrP基因敲除菌酪氨酸产量分别达到3.74 g/L和3.45 g/L，较出发菌株酪氨酸产量分别提高了19%和10%。对诱导温度进行了优化，结果表明38 ℃为最佳诱导温度。在3 L发酵罐上进行了补料分批发酵，aroP和tyrP基因敲除菌酪氨酸产量进一步提高至44.5 g/L和35.1 g/L，较出发菌株酪氨酸产量分别提高了57%和24%。研究结果对代谢工程强化大肠杆菌生产酪氨酸具有重要的参考价值。
关键词：大肠杆菌L-酪氨酸转运系统基因敲除
Effect of gene knockout of L-tyrosine transport system on L-tyrosine production in Escherichia coli
Qin Wang1,2, Weizhu Zeng1,2, Jingwen Zhou1,2
1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: December 25, 2018; Accepted: January 31, 2019; Published: March 12, 2019
Supported by: National Science Fund for Excellent Young Scholars (No. 21822806), National Natural Science Foundation of China (No. 31770097)
Corresponding author: Jingwen Zhou. Tel: +86-510-85918312; E-mail: zhoujw1982@jiangnan.edu.cn.
Abstract: L-tyrosine is one of three aromatic amino acids that are widely used in food, pharmaceutical and chemical industries. The transport system engineering provides an important research strategy for the metabolic engineering of Escherichia coli to breed L-tyrosine producing strain. The intracellular transport of L-tyrosine in E. coli is mainly regulated by two distinct permeases encoded by aroP and tyrP genes. The aroP and tyrP gene knockout mutants were constructed by CRISPR-Cas technique on the basis of L-tyrosine producing strain HGXP, and the effects of regulating transport system on L-tyrosine production were investigated by fermentation experiments. The fermentation results showed that the aroP and tyrP knockout mutants produced 3.74 and 3.45 g/L L-tyrosine, respectively, which were 19% and 10% higher than that of the original strain. The optimum induction temperature was determined to be 38 ℃. Fed-batch fermentation was carried out on a 3-L fermentor. The L-tyrosine yields of aroP and tyrP knockout mutants were further increased to 44.5 and 35.1 g/L, respectively, which were 57% and 24% higher than that of the original strain. The research results are of great reference value for metabolic engineering of E. coli to produce L-tyrosine.
Keywords: Escherichia coliL-tyrosinetransport systemgene knockout
酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)是一种人体的条件必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料、医药、化工等行业。酪氨酸常被用作苯丙酮尿症患者的营养补充剂[1]，也是多肽类激素、抗生素、L-多巴等医药化工产品的制备原料[2]，以及合成如白藜芦醇、柚皮素、生松素等高附加值酪氨酸衍生物的前体[3-5]。目前，工业上主要由酶法来制备酪氨酸[6]，虽然其具有周期短、选择性强、转化率高和分离纯化步骤简单的优点，但天然酶活性低和稳定性差等缺点限制了酶法的应用[7-8]。与酶法相比，微生物发酵法可以利用生物质原料实现酪氨酸的从头合成，可以降低生产成本。代谢工程和先进生物技术的快速发展为合理设计和优化微生物的代谢途径以生产酪氨酸提供了有力的工具[9-10]，因此微生物发酵法生产酪氨酸具有非常广阔的发展前景[11-12]。
目前微生物发酵法生产酪氨酸的研究主要集中在提高前体物质供应、解除反馈抑制、阻断竞争代谢途径等方面，但对转运系统的研究较少[13-15]。酪氨酸的转运涉及到细胞对外界环境的感应，对优化代谢途径也起到了重要的作用[16]。大肠杆菌中酪氨酸的胞内转运主要是由aroP和tyrP基因编码的通透酶进行调控。AroP通透酶为通用芳香族氨基酸转运体，负责酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸向胞内的转运。TyrP通透酶为酪氨酸特异性转运体，特异性地将酪氨酸转运到胞内。在大肠杆菌中，DAHP合成酶(DS)催化酪氨酸合成的前体物4-磷酸赤藓糖(Erythrose-4-phosphate，E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，它包含AroG、AroF和AroH这3个同工酶，它们的活性分别受胞内苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的反馈阻遏和反馈抑制[17]。胞内酪氨酸积累过高会抑制DAHP合成酶的表达，进而影响酪氨酸的合成。本研究以酪氨酸生产菌株HGXP为出发菌株，利用CRISPR-Cas9技术敲除了酪氨酸转运系统编码基因aroP和tyrP，从而减弱酪氨酸向胞内转运的能力，一定程度上减轻酪氨酸的积累对DAHP合成酶的阻遏作用。并通过发酵试验考察了酪氨酸转运系统相关基因的敲除对大肠杆菌菌体生长和酪氨酸生产的影响。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒出发菌株为酪氨酸生产菌株HGXP，其宿主菌HGX由大肠杆菌WSH-Z06 (pAP-B03)通过连续传代消除pAP-B03质粒选育而来[18]。HGXP带有pAP-aroGfbr-tyrAfbr质粒，pAP-aroGfbr-tyrAfbr质粒带有抗反馈抑制的大肠杆菌酪氨酸合成途径关键酶基因aroGfbr和tyrAfbr，具有PRPL启动子和Kan抗性筛选标记。酪氨酸生产菌株HGXP由实验室前期通过基因工程手段构建。本研究以
HGXP为出发菌株，分别构建了aroP和tyrP单基因敲除菌。基因敲除所需的工具质粒pCas和pTarget由中国科学院上海植物生理生态研究所提供[19]。本研究中所使用的菌株和质粒见表 1。
表 1 本研究所使用的菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study
| Strain and plasmid | Relevant characteristics | Source or reference |
| E. coli | ||
| WSH-Z06(pAP–B03) | L-phenylalanine producing strain | [18] |
| HGX | Elimination pAP-B03 plasmid of WSH-Z06 (pAP-B03) | Stock in lab |
| HGXP | HGX, pAP-aroGfbr-tyrAfbr | Stock in lab |
| HGXΔaroP | HGX knocking out aroP gene | This study |
| HGXΔtyrP | HGX knocking out tyrP gene | This study |
| HGPP | HGXΔaroP, pAP-aroGfbr-tyrAfbr | This study |
| HGEP | HGXΔtyrP, pAP-aroGfbr-tyrAfbr | This study |
| Plasmid | ||
| pAP-aroGfbr-tyrAfbr | PR-aroGfbr, PL-tyrAfbr, p15A replicon, Kan resistance | Stock in lab |
| pCas | repA101(Ts), Pcas-cas9, ParaB-Red, lacIq, Ptrc-sgRNA- pMB1, Kan resistance | [19] |
| pTarget-cadA | pMB1, aadA, sgRNA-cadA, Spc resistance | [19] |
| pTarget-aroP | pMB1, aadA, sgRNA-aroP, Spc resistance | This study |
| pTarget-tyrP | pMB1, aadA, sgRNA-tyrP, Spc resistance | This study |
表选项
1.1.2 培养基种子培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。
酪氨酸发酵培养基(g/L)：葡萄糖35，蛋白胨4，酵母粉2，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 3，NaCl 1，柠檬酸钠1.5，CaCl2·2H2O 0.015，FeSO4·7H2O 0.112 5，维生素B1 0.075，微量元素营养液(TES) 1.5 mL/L，卡那霉素0.04，pH 6.8±0.1。摇瓶发酵时，添加12 g/L CaCO3用于调节pH。
TES (g/L)：Al2(SO4)3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，CuSO4·5H2O 2.5，H3BO3 0.5，MnSO4·H2O 24，Na2MoO4·2H2O 3.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15。
1.1.3 主要试剂蛋白胨和酵母粉购自Oxoid公司。NaCl、葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、柠檬酸钠、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、维生素B1、CaCO3、Al2(SO4)3·18H2O、CoSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、NiSO4·6H2O、ZnSO4·7H2O均购于上海国药集团。L-酪氨酸标准品购自Sigma-Aldrich公司(上海)。卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spc)、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒和高效制备感受态细胞试剂盒均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 方法1.2.1 使用CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌目的基因Jiang等[19]先前描述了在大肠杆菌K12基因组中敲除目的基因的方法。此方法采用了双质粒系统，其中一个为含有Cas9编码基因的pCas质粒，另一个为含有打靶目的基因的sgRNA的pTarget质粒。将pTarget质粒和目的基因上下游同源臂同时通过电转化到含有pCas质粒的细胞中，可以达到敲除目的基因的目的。pCas质粒在终浓度为0.01 mol/L的阿拉伯糖诱导下，合成重组酶，更有利于同源重组的发生。pTarget质粒会组成型的产生靶向目的基因的sgRNA，与pCas
质粒产生的Cas9蛋白结合，sgRNA 20 bp的N20序列与目的基因碱基配对成功后Cas9蛋白会切断目的基因的双链。如果此20 bp定位在基因组上，那么基因组就会被切断，从而无法繁殖。但是如果同时导入线性的同源臂，在切口两侧发生同源重组，那么同源臂就会取代原来的基因序列，而使得繁殖继续下去。pCas质粒在IPTG诱导下可以产生定位在pTarget质粒上的sgRNA，从而消化pTarget质粒，pCas质粒本身在42 ℃下会被消除，因此可以把敲除目的基因的菌株中两个质粒消除掉。本研究所用引物见表 2。
表 2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| aroP-up-F | CCACTTGCCGAAGTCAATTGGTC | 23 |
| aroP-up-R | CGGGTGAGGGCGTAGAGAGAGAAACCTCGTGCGGTGGTTG | 40 |
| aroP-down-F | CAACCACCGCACGAGGTTTCTCTCTCTACGCCCTCACCCG | 40 |
| aroP-down-R | ACGAACGTGAGTATTTGCGTGAG | 23 |
| aroP-sgRNA-F | CCTCCGTAATACAGTCCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | 43 |
| aroP-sgRNA-R | ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG | 24 |
| aroP-sgRNA-v-F | GACCTACACCGAACTGAGATACCTA | 25 |
| aroP-sgRNA-v-R | TGCGGACTGTATTACGGAGG | 20 |
| tyrP-up-F | GCGAAGGTCTGTATTTTATCGAC | 23 |
| tyrP-up-R | AGGAATTTGAGGCTATCTGAGCTTTCTTCTGTCCTGACGA | 40 |
| tyrP-down-F | TCGTCAGGACAGAAGAAAGCTCAGATAGCCTCAAATTCCT | 40 |
| tyrP-down-R | AAGAGATGACGCGCTTTATG | 20 |
| tyrP-sgRNA-F | GGAGGTGTACCAGCATGTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | 43 |
| tyrP-sgRNA-R | ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG | 24 |
| tyrP-sgRNA-v-F | GACCTACACCGAACTGAGATACCTA | 25 |
| tyrP-sgRNA-v-R | GAACATGCTGGTACACCTCC | 20 |
| The underlined part of the aroP-up-R, aroP-down-F, tyrP-up-R and tyrP-down-F primer sequences indicate homology extensions; the underlined part of aroP-sgRNA-F and tyrP-sgRNA-F primer sequences indicate N20 sequences. | ||
表选项
1.2.2 培养方法种子培养：从LB平板上挑取单菌落接种至装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中培养，37 ℃、200 r/min培养10–14 h。
摇瓶发酵培养：将培养好的种子培养液以10%的接种量，接种至装有25 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中进行培养，发酵温度33 ℃，摇床转速200 r/min，当菌体生长至OD600为1.5–2.0时，升温至38 ℃诱导产L-酪氨酸。
发酵罐发酵培养：将培养好的种子液以10%的接种量接入装有1.1 L发酵培养基的3 L发酵罐中，通过流加20%的氨水控制pH在6.7–6.9，发酵温度33 ℃，待菌体浓度达到OD600=23–27时，升温至38 ℃诱导产L-酪氨酸。初始转速400 r/min，当溶解氧(Dissolved oxygen，DO)降至20%以下时逐步提高转速使DO维持在20%以上，当培养基中葡萄糖基本耗尽时，流加700 g/L的葡萄糖使培养基中的葡萄糖浓度维持在10 g/L以内。
1.2.3 菌体浓度的测定测定发酵罐发酵培养中的菌体浓度需在定容前加6 mol/L的HCl溶解发酵液中的酪氨酸，处理后的发酵液经12 000 r/min离心10 min，弃上清。菌体沉淀用去离子水洗涤2次，离心后得到的湿菌体在105 ℃下烘干至恒重，计算出细胞干重(Dry cell weight，DCW)。发酵液稀释至适当的范围后，使用722s型分光光度计测定其在600 nm处的吸光度(OD600)，得到OD600与DCW的关系式。在本研究中，DCW(g/L)=0.364×OD600。
1.2.4 葡萄糖浓度的测定取1 mL发酵液经12 000 r/min离心5 min，上清液稀释一定倍数，采用葡萄糖-乳酸生物传感分析仪(深圳西尔曼科技有限公司)测定葡萄糖浓度。
1.2.5 发酵液样品的处理方法由于酪氨酸在室温和中性pH下在水中的溶解度很低，因此在发酵过程中采集的大多数样品具有大量以晶体形式存在的酪氨酸固体。将发酵液样品以1:1的比例用6 mol/L HCl稀释，涡旋振荡，以确保酪氨酸完全溶解。用去离子水将发酵液样品进一步稀释使最终产物浓度达到分析方法的测量范围。涡旋振荡，12 000 r/min离心10 min。收集上清液并过滤得到处理后的发酵液样品用于高效液相色谱测定。
1.2.6 L-酪氨酸的测定采用高效液相色谱法检测发酵液中L-酪氨酸的含量。色谱柱为Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相为0.1 mol/L乙酸钠(冰乙酸调节pH至4.0)和甲醇，体积百分比为90%和10%，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL[20]。
2 结果与分析2.1 aroP和tyrP基因敲除菌的构建由于酪氨酸合成关键酶的表达质粒pAP-aroGfbr-tyrAfbr和基因敲除的工具质粒pCas都是Kan抗性筛选标记，为避免pAP-aroGfbr-tyrAfbr质粒影响基因敲除菌的筛选，本研究首先在宿主菌HGX内进行酪氨酸转运系统的基因敲除，然后通过转化pAP-aroGfbr-tyrAfbr质粒获得出发菌株HGXP的基因敲除菌。利用引物up-F和up-R扩增得到目的基因上游同源臂，利用引物down-F和down-R扩增得到目的基因下游同源臂，利用融合PCR技术扩增得到目的基因上下游同源臂。利用引物sgRNA-F和sgRNA-R以pTarget-cadA质粒为模板通过全质粒PCR获得带有目的基因N20序列的pTarget质粒，用引物sgRNA-v-F和sgRNA-v-R对构建的pTarget质粒进行菌落PCR验证(图 1A)。若能得到大小为500 bp左右的条带，则证明pTarget质粒构建成功。将pTarget质粒和同源臂同时通过电转化到含有pCas质粒的感受态细胞中，使用引物up-F和down-R进行菌落PCR验证(图 1B)。若基因敲除成功则应得到大小约1 000 bp的同源臂片段。将样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，核酸序列与同源臂序列一致，结果表明aroP和tyrP基因已经成功敲除。将含有酪氨酸合成关键酶基因的质粒pAP-aroGfbr-tyrAfbr分别转化至aroP和tyrP基因敲除菌中，获得酪氨酸基因工程菌HGPP和HGEP。
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| 图 1 菌落PCR验证琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of colony PCR. (A) Verification of pTarget plasmid. 1: pTarget-aroP; 2: pTarget-tyrP. (B) Verification of gene deletion. 1: aroP gene deletion; 2: tyrP gene deletion. |
| 图选项 |
2.2 酪氨酸基因工程菌的摇瓶发酵为了初步考察大肠杆菌酪氨酸转运蛋白编码基因敲除对菌株生产酪氨酸的影响，对出发菌株HGXP及构建的酪氨酸基因工程菌HGPP和HGEP进行了摇瓶发酵试验。如图 2A所示，与对照菌株相比，aroP基因敲除菌HGPP的最高OD600与对照菌株相比降低了8%；tyrP基因敲除菌HGEP的最高OD600与对照菌株相比提高了14%。说明aroP基因的敲除对菌株生长有一定抑制作用，而tyrP基因的敲除对菌株的生长有一定促进作用，由于菌株的生长涉及到一系列复杂的调控，其原因有待于进一步探究。在酪氨酸生产方面，aroP基因敲除菌HGPP发酵48 h的酪氨酸产量为3.74 g/L，与对照菌株HGXP相比提高了19%；tyrP基因敲除菌HGEP发酵48 h的酪氨酸产量为3.45 g/L，与对照菌株相比提高了10% (图 2B)。结果表明，在HGXP菌株中敲除转运蛋白编码基因aroP和tyrP均对酪氨酸的生产有积极影响，aroP基因的敲除较tyrP基因的敲除更有利于酪氨酸的生产。发酵条件的优化有望进一步提高酪氨酸基因工程菌生产酪氨酸的能力。
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| 图 2 大肠杆菌酪氨酸转运系统基因敲除菌的摇瓶发酵 Fig. 2 Shake flask fermentation of Tyr transport system gene knockout mutants. The data represent the x±s of three measurements. |
| 图选项 |
2.3 酪氨酸基因工程菌的诱导温度优化由于酪氨酸合成关键酶的表达质粒pAP-aroGfbr- tyrAfbr为热诱导型质粒，诱导温度与酪氨酸生物合成关键酶的表达有着密切的联系，而且在不同的温度下酪氨酸合成过程中的关键酶的酶活和稳定性也会受到影响。因此本实验考察了不同的诱导温度(36 ℃、38 ℃、40 ℃)对酪氨酸生产菌株生产酪氨酸的影响。发酵48 h的酪氨酸产量如图 3所示，在38 ℃的诱导条件下，HGXP、HGPP和HGEP菌株的酪氨酸产量比在33 ℃的培养条件下分别提高了96.7%、77.4%和92.6%；比在36 ℃的诱导条件下分别提高了17%、19%和18%；比在40 ℃的诱导条件下分别提高了8%、9%和12%。结果表明采用38 ℃的诱导温度可以提高酪氨酸基因工程菌生产酪氨酸的能力，因此在3 L发酵罐水平上可以采用38 ℃的诱导条件来进一步探究其生产酪氨酸的能力。
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| 图 3 诱导温度的优化 Fig. 3 Optimization of induced temperature. The data represent the x±s of three measurements. |
| 图选项 |
2.4 酪氨酸基因工程菌的补料分批发酵由摇瓶发酵试验得知，aroP和tyrP基因敲除菌的酪氨酸生产能力较出发菌株HGXP都有提升。在3-L发酵罐上出发菌株HGXP的酪氨酸产量最高为28.3 g/L，为了进一步考察酪氨酸基因工程菌发酵生产酪氨酸的潜力，在3-L发酵罐上分别对HGPP和HGEP菌株进行了补料分批发酵的探究。如图 4所示，虽然在摇瓶水平上HGPP的生长情况不如HGEP，但是在发酵罐水平由于溶氧更为充足，2个菌株的最大DCW相近，分别为26.65 g/L和25.96 g/L。在酪氨酸生产方面，HGPP菌株发酵46 h的酪氨酸产量达到44.5 g/L，与出发菌株相比酪氨酸产量提高了57%，底物转化率为0.179，生产强度为0.967 g/(L·h)。HGEP菌株发酵46 h，可以生产35.1 g/L的酪氨酸，与出发菌株相比酪氨酸产量提高了24%，底物转化率为0.143，生产强度为0.763 g/(L·h) (表 3)。结果表明，HGPP的底物转化率和生产强度都大于HGEP，进一步证明了在HGXP菌株中aroP基因敲除相较于tyrP基因敲除更有利于酪氨酸的生产。因此aroP基因敲除菌可以作为酪氨酸生产的潜在优势菌株。
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| 图 4 大肠杆菌HGPP和HGEP的补料分批发酵 Fig. 4 Fed-batch fermentation of E. coli HGPP and HGEP. (A) HGPP. (B) HGEP. The data represent the x±s of three measurements. |
| 图选项 |
表 3 大肠杆菌HGPP和HGEP补料分批发酵参数比较Table 3 Comparison of fermentation parameters of fed-batch fermentation of E. coli HGPP and HGEP
| Fermentation parameters | HGPP | HGEP |
| Glucose consumption (g/L) | 248.000±4.243 | 245.000±7.071 |
| Culture time (h) | 46.050±1.061 | 46.050±1.061 |
| Maximum DCW (g/L) | 26.650±0.394 | 25.964±0.180 |
| Maximum L-Tyr concentration (g/L) | 44.520±0.438 | 35.100±0.453 |
| Cell productivity (g/(L·h)) | 0.579±0.022 | 0.564±0.017 |
| L-Tyr productivity (g/(L·h)) | 0.967±0.032 | 0.763±0.027 |
| Cell yield on glucose (g/g) | 0.107±0.001 | 0.106±0.002 |
| L-Tyr yield on glucose (mol/mol) | 0.179±0.001 | 0.143±0.002 |
| The data represent the x±s of three measurements. | ||
表选项
3 讨论L-酪氨酸的生物合成途径已得到广泛的研究[21]，转运系统的改造为代谢工程育种提供了重要的研究方向[22]。由于目前仍有许多氨基酸转运系统相关功能基因尚未得到鉴定，因此只有少数文献考察了转运系统工程对氨基酸生物合成的影响[23-25]。在最近的一项研究中，Kim等[26]构建了一株生产酪氨酸的大肠杆菌菌株，通过在tyrP基因敲除菌株中过表达aroGfbr、aroL和tyrC，可以产生43.1 g/L酪氨酸。这是首次报道在大肠杆菌中通过改造酪氨酸转运系统来生产酪氨酸。在本研究中分别构建了aroP和tyrP基因敲除菌，由于同时敲除aroP和tyrP基因后，菌株的生长受到严重影响，酪氨酸产量与对照菌株相比没有提高，因此我们着重考察了酪氨酸转运系统单基因敲除对菌株生产酪氨酸的影响。结果表明，aroP和tyrP单基因敲除菌的酪氨酸产量与对照菌HGXP相比分别提高了19%和10%。
我们又对酪氨酸生产菌的诱导温度进行了优化，结果表明在38 ℃下诱导关键酶的表达最有利于酪氨酸的生产。在进一步的补料分批发酵试验中，酪氨酸最高产量为aroP单基因敲除菌的44.5 g/L，底物转化率为0.179，由于仅敲除了一个基因，对菌株的生长影响较小，因此可以进行后续的分子改造以进一步提高其生产酪氨酸的能力。
本研究所构建的酪氨酸生产菌株为热诱导型菌株，相较于其他需要添加价格昂贵的诱导剂的工程菌株具有经济节约且不易染菌的优点，更适合进行工业上的大规模生产。同时，对酪氨酸转运系统的研究也为代谢工程育种提供了重要的研究策略。
参考文献
| [1] | Giovannini M, Verduci E, Salvatici E, et al. Phenylketonuria: dietary and therapeutic challenges.J Inherit Metab Dis, 2007, 30(2): 145–152.DOI: 10.1007/s10545-007-0552-8 |
| [2] | Seetharam G, Saville BA. L-DOPA production from tyrosinase immobilized on zeolite.Enzyme Microb Tech, 2002, 31(6): 747–753.DOI: 10.1016/S0141-0229(02)00182-5 |
| [3] | Katsuyama Y, Funa N, Miyahisa I, et al. Synthesis of unnatural flavonoids and stilbenes by exploiting the plant biosynthetic pathway in Escherichia coli.Chem Biol, 2007, 14(6): 613–621.DOI: 10.1016/j.chembiol.2007.05.004 |
| [4] | Lütke-Eversloh T, Santos CNS, Stephanopoulos G. Perspectives of biotechnological production of L-tyrosine and its applications.Appl Microbiol Biot, 2007, 77(4): 751–762.DOI: 10.1007/s00253-007-1243-y |
| [5] | Wu JJ, Liu PR, Fan YM, et al. Multivariate modular metabolic engineering of Escherichia coli to produce resveratrol from L-tyrosine.J Biotechnol, 2013, 167(4): 404–411.DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.07.030 |
| [6] | Kim DY, Rha E, Choi SL, et al. Development of bioreactor system for L-tyrosine synthesis using thermostable tyrosine phenol-lyase.J Microbiol Biotechnol, 2007, 17(1): 116–122. |
| [7] | Kim JH, Song JJ, Kim BG, et al. Enhanced stability of tyrosine phenol-lyase from Symbiobacterium toebii by DNA shuffling.J Microbiol Biotechnol, 2004, 14(1): 153–157. |
| [8] | Rha E, Kim S, Choi SL, et al. Simultaneous improvement of catalytic activity and thermal stability of tyrosine phenol-lyase by directed evolution.FEBS J, 2009, 276(21): 6187–6194.DOI: 10.1111/j.1742-4658.2009.07322.x |
| [9] | Santos CNS, Xiao WH, Stephanopoulos G. Rational, combinatorial, and genomic approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(34): 13538–13543.DOI: 10.1073/pnas.1206346109 |
| [10] | Kim SC, Min BE, Hwang HG, et al. Pathway optimization by re-design of untranslated regions for L-tyrosine production in Escherichia coli.Sci Rep, 2015, 5: 13853.DOI: 10.1038/srep13853 |
| [11] | Patnaik R, Zolandz RR, Green DA, et al. L-tyrosine production by recombinant Escherichia coli: fermentation optimization and recovery.Biotechnol Bioeng, 2008, 99(4): 741–752.DOI: 10.1002/bit.v99:4 |
| [12] | Olson MM, Templeton LJ, Suh W, et al. Production of tyrosine from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes to phenylalanine-producing Escherichia coli strains.Appl Microbiol Biot, 2007, 74(5): 1031–1040.DOI: 10.1007/s00253-006-0746-2 |
| [13] | Gosset G, Yong-Xiao J, Berry A. A direct comparison of approaches for increasing carbon flow to aromatic biosynthesis in Escherichia coli.J Ind Microbiol, 1996, 17(1): 47–52.DOI: 10.1007/BF01570148 |
| [14] | Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. Feedback inhibition of chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (TyrA) of Escherichia coli: generation and characterization of tyrosine-insensitive mutants.Appl Environ Microbiol, 2005, 71(11): 7224–7228.DOI: 10.1128/AEM.71.11.7224-7228.2005 |
| [15] | Ikeda M, Katsumata R. Metabolic engineering to produce tyrosine or phenylalanine in a tryptophan-producing Corynebacterium glutamicum strain.Appl Environ Microbiol, 1992, 58(3): 781–785. |
| [16] | Ikeda M, Katsumata R. Transport of aromatic amino acids and its influence on overproduction of the amino acids in Corynebacterium glutamicum.J Ferment Bioeng, 1994, 78(6): 420–425.DOI: 10.1016/0922-338X(94)90040-X |
| [17] | Hu CY, Jiang PH, Xu JF, et al. Mutation analysis of the feedback inhibition site of phenylalanine- sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase of Escherichia coli.J Basic Microbiol, 2003, 43(5): 399–406.DOI: 10.1002/(ISSN)1521-4028 |
| [18] | Zhou HY, Liao XY, Wang TW, et al. Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAfbr and aroFwt.Bioresour Technol, 2010, 101(11): 4151–4156.DOI: 10.1016/j.biortech.2010.01.043 |
| [19] | Jiang Y, Chen B, Duan CL, et al. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol, 2015, 81(7): 2506–2514.DOI: 10.1128/AEM.04023-14 |
| [20] | Ji CX. Determination of tryptophan and tyrosine of fermentation liquid by HPLC.Anhui Chem Ind, 2014, 40(1): 68–69, 74.(in Chinese). 纪传侠. 高效液相色谱法测定发酵液中色氨酸和酪氨酸含量的研究.安徽化工, 2014, 40(1): 68-69, 74.DOI:10.3969/j.issn.1008-553X.2014.01.024 |
| [21] | Juminaga D, Baidoo EEK, Redding-Johanson AM, et al. Modular engineering of L-tyrosine production in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol, 2012, 78(1): 89–98.DOI: 10.1128/AEM.06017-11 |
| [22] | Burkovski A, Kr?mer R. Bacterial amino acid transport proteins: occurrence, functions, and significance for biotechnological applications.Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58(3): 265–274.DOI: 10.1007/s00253-001-0869-4 |
| [23] | Ikeda M, Katsumata R. Tryptophan production by transport mutants of Corynebacterium glutamicum.Biosci Biotechnol Biochem, 1995, 59(8): 1600–1602.DOI: 10.1271/bbb.59.1600 |
| [24] | Vrljic M, Sahm H, Eggeling L. A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum.Mol Microbiol, 1996, 22(5): 815–826.DOI: 10.1046/j.1365-2958.1996.01527.x |
| [25] | Okamoto K, Kino K, Ikeda M. Hyperproduction of L-threonine by an Escherichia coli mutant with impaired L-threonine uptake.Biosci Biotechnol Biochem, 1997, 61(11): 1877–1882.DOI: 10.1271/bbb.61.1877 |
| [26] | Kim B, Binkley R, Kim HU, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the enhanced production of L-tyrosine.Biotechnol Bioeng, 2018, 115(10): 2554–2564.DOI: 10.1002/bit.26797 |
