陈赢男^1,2, 陆静^1,2 1. 南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,南京 210037
2. 南京林业大学林学院,南方现代林业协同创新中心,南京 210037

Application of CRISPR/Cas9 mediated gene editing in trees

Yingnan Chen^1,2, Jing Lu^1,2 1. Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology of Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
2. Nanjing Forestry University, Co-Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing 210037, China

通讯作者: 陈赢男。

编委: 高彩霞
收稿日期:2020-04-4修回日期:2020-05-25网络出版日期:2020-07-20

基金资助:

青年人才托举工程编号.YESS20160121 江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师项目和江苏省优势学科项目资助

Editorial board: GaoCaixia
Received:2020-04-4Revised:2020-05-25Online:2020-07-20

Fund supported:

Supported by the Youth Elite Science Sponsorship Program by CAST No.YESS20160121 the Qing Lan Talent Support Program at Jiangsu Province, and the Priority Academic Program Development Program of Jiangsu Province

作者简介 About authors
陈赢男,博士,副教授,研究方向：林木遗传育种。E-mail:chenyingnan@njfu.edu.cn。




摘要
CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行精确定点编辑,是目前公认的最有发展潜力的基因编辑技术,并已在主要粮食及经济作物的精准育种方面发挥了重要作用。CRISPR/Cas9系统的出现也为林木基础研究和分子育种带来了新的途径。近年来CRISPR/Cas9系统在林木遗传研究中的应用越来越广泛,不仅实现了抗旱、抗病等林木新品种的培育,而且在调控木质素合成和缩短林木育种周期等方面也展现了巨大潜力。本文详细梳理了CRISPR/Cas9系统在林木基因功能验证及遗传改良中的研究进展,并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了展望,以期为林木功能基因组研究和林木基因工程育种提供有益参考。
关键词： CRISPR/Cas9;基因编辑;林木;基因功能;遗传改良

Abstract
The CRISPR/Cas9 system, which can induce precise modifications at a target gene, has been recognized as the most promising gene editing technology, and has played an important role in precision crop breeding. It also provides a new strategy for fundamental researches and molecular breeding of forest trees. Recently, CRISPR/Cas9-mediated gene editing has been applied more extensively in tree genetic studies. It has not only succeeded in developing new drought- resistance or disease-resistant cultivars, but also shows a great potential in regulating lignin biosynthesis and shortening the breeding cycle of forest trees. In this review, we summarize the application and advance of CRISPR/Cas9 in gene function identification and genetic improvement of forest plants. We also discuss the related problems and future perspectives. This review aims to provide a useful reference for tree functional genomics and genetic engineering breeding.
Keywords：CRISPR/Cas9;gene editing;trees;gene function;genetic improvement


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本文引用格式
陈赢男, 陆静. CRISPR/Cas9系统在林木基因编辑中的应用. 遗传[J], 2020, 42(7): 657-668 doi:10.16288/j.yczz.20-092
Yingnan Chen. Application of CRISPR/Cas9 mediated gene editing in trees. Hereditas(Beijing)[J], 2020, 42(7): 657-668 doi:10.16288/j.yczz.20-092


对基因组进行精确编辑和改造一直是分子生物学家不断探究的技术难题,继锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术之后,基于细菌成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)序列开发的CRISPR/Cas9系统是近几年最为主流的基因编辑技术。与ZFN和TALEN技术相比,CRISPR/Cas9系统设计流程简单、操作方便、基因编辑效率高,一经开发就迅速在动物、植物和微生物中得到应用。自2013年首次用于编辑模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)以来^[1],CRISPR/Cas9系统已在24个属45个科的植物中成功应用^[2],在提高作物产量、改良作物品质、培育抗病及抗胁迫新品种等领域都具有良好的应用前景^[3,4,5]。

林木具有世代周期长、遗传杂合度高、基因组倍性复杂等生物学特点,长期以来林木遗传改良进程缓慢。CRISPR/Cas9系统的出现对林木基因功能研究和遗传改良起到很大促进作用,本文对CRISPR/ Cas9系统在林木中的应用进行了详细梳理,并展望了未来需要解决的一些问题和发展趋势,以期为林木功能基因组研究和林木基因工程育种提供参考。

1 CRISPR/Cas9系统在林木模式树种中的应用

杨树是重要的短轮伐期工业用材树种,也是木本植物遗传研究的模式树种,因此在杨树中应用基因编辑技术具有重要的应用价值和理论意义。2015年,两个研究团队先后报道了利用CRISPR/Cas9系统在杨树中实现内源基因的定点突变：中国西南大学罗克明团队成功敲除毛白杨(Populus tomentosa Carr.)八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene, PDS,编辑效率51.7%),导致杨树白化表型^[6];美国佐治亚大学Tsai团队在种间杂种银灰杨(P. tremula × alba)中成功编辑4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL1和4CL2 (突变效率达100%),获得茎秆呈红褐色的突变体材料,并发现接近或位于PAM位点内的SNP能完全抑制基因打靶作用,该研究提示：基因组高杂合度是在木本植物中应用CRISPR/Cas9系统时必须考虑的重要因素^[7]。基于成花关键基因LEAFY和AGAMOUS,Elorriaga等^[8]分析了CRISPR/ Cas9系统在杨树中产生基因突变的类型和特点,结果发现,当目标基因中只有一个靶位点时,单碱基插入突变和小的缺失突变(1~3 bp)是较为普遍的突变类型;当目标基因中存在两个靶位点时,产生大片段删除突变的概率较高,同时有产生倒位突变的可能,但概率较低;但是,该研究未在杨树中检测到脱靶效应。此外, Bruegmann等^[9]利用SOC1等9个杨树内源基因,分析比较了不同sgRNA产生基因编辑的效率,他们认为高效sgRNA具备以下序列结构特征：(1) GC含量在40%~60%之间;(2) sgRNA 3′末端的4个碱基最好都是嘌呤碱;(3)sgRNA序列中的种子序列(seed region, 18~20 nt)不形成二级结构配对。最近,四川大学马涛团队以我国西北部地区主要造林树种新疆杨(P. bolleana)为研究对象,成功利用CRISPR/Cas9系统编辑了C2H2-AZF基因^[10],为利用基因工程培育新疆杨新品种提供了技术支撑。

到目前为止,杨树是木本植物中CRISPR/Cas9系统发展最为迅速的树种,该系统在杨树功能基因组研究和基因工程育种中都有着广泛的应用。例如,杨树BRC1和BRC2基因敲除株系的分支数目比野生型均明显增加,BRC2基因敲除株系更为显著,且该株系在茎节处有异位叶片形成,说明这对直系同源基因虽然都参与调控杨树侧芽发生,但它们的表达模式和作用机制并不相同^[11];CRISPR/Cas9介导产生的NST/SND同源基因四重突变体杨树几乎无法直立,解剖学观察发现突变体植株的木纤维细胞、韧皮纤维细胞和木射线薄壁细胞缺少次生细胞壁,证明这些基因在杨树次生壁的形成中发挥关键调控作用^[12];敲除杨树DET2基因导致生物质糖化和生物乙醇产量降低,该基因过表达能够显著提高酶解糖化率和糖醇转化率,为培育新型生物能源树种提供了参考^[13]。本文对近年来CRISPR/Cas9系统在杨树上的应用进行了归类总结(表1)。根据表1中的研究报道,杨树中实施基因编辑的技术要点总结如下：设计1~3条sgRNA即可实现对目标基因的有效编辑;应用于杨树基因编辑的Cas9基因多数进行了植物密码子优化,根据人类密码子优化的Cas9基因,甚至是未经优化的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SpCas9序列直接应用于杨树,也能够成功进行基因编辑,但在拟南芥和烟草中的研究表明,经过植物密码子优化的Cas9基因具有更高的表达水平和剪切活性^[1,28]。

Table 1
表1
表1CRISPR/Cas9系统在杨树中的应用
Table 1Applications of CRISPR/Cas9 system in poplar

研究目的	杨树种名	基因	sgRNA 数目	Cas 9密码子	参考 文献
CRISPR 技术体系 的建立 与探索	毛白杨 (Populus tomentosa Carr. clone 741)	PtoPDS	4	human codon-optimized Cas9	[6]
	银灰杨 (P. tremula × alba clone 717-1B4) ; 欧美山杨 (P. tremula × tremuloides clone 353-38)	LEAFY、AGAMOUS	1~2	human codon-optimized Cas9	[8]
	银灰杨 (P. × canescens poplar clone INRA 717-1B4); 欧洲山杨 (P. tremula clone W52)	SOC1、SOC1 Paralog 1、SOC1 Paralog 2、AGL8.1、AGL8.2、NFP-like1-4、TOZ19	1~2	Cas9 wild type gene (Streptococcus pyogenes)	[9]
	新疆杨 [P. alba var. pyramidalis (P. bolleana)]	C2H2‐AZF	3	plant codon-optimized Cas9	[10]
木质素及 类黄酮 合成	银灰杨 (P. tremula × alba clone 717-1B4)	4CL1、4CL2	1	plant codon-optimized Cas9	[7]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	MYB115	3	plant codon-optimized Cas9	[14]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtoMYB156	3	plant codon-optimized Cas9	[15]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtoMYB170	3	plant codon-optimized Cas9	[16]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtrMYB57	3	plant codon-optimized Cas9	[17]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	JMJ25	1	plant codon-optimized Cas9	[18]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	MYB189	2	plant codon-optimized Cas9	[19]
木质部 发育	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtoDWF4	3	plant codon-optimized Cas9	[20]
	欧美山杨 (P. tremula L.× P. tremuloides clone T89)	Pt×tvns09、vns10、 vns11、vns12	1	Arabidopsis codon-optimized Cas9	[12]
	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtoDET2	3	plant codon-optimized Cas9	[13]
生长与 生长 节律	银灰杨 (P. tremula × alba clone INRA 717-1B4)	PcBRC1、PcBRC2	2	plant codon-optimized Cas9	[11]
	银灰杨 (P. tremula × alba clone 717)	GNC	1	Arabidopsis codon-optimized Cas9	[21]
	银灰杨 (P. tremula × alba INRA clone 717-1B4)	LHY2	1	human codon-optimized Cas9	[22]
	欧美山杨 (P. tremula× tremuloides clone T89)	BRC1	2	maize-codon optimized Cas9	[23]
抗旱性状	毛果杨 (P. trichocarpa)	PtrADA2b-3	1	Arabidopsis codon-optimized Cas9	[24]
	84K杨 (P. alba × P. glandulosa)	PdNF-YB21	1	Arabidopsis codon-optimized Cas9	[25]
抗病性状	毛白杨 (P. tomentosa Carr. clone 741)	PtrWRKY18、PtrWRKY35	3	plant codon-optimized Cas9	[26]
酚甙类次生 代谢产物	银灰杨 (P. tremula× alba INRA 717-1B4)	UGT71L1	1	Arabidopsis codon-optimized Cas9	[27]

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2 CRISPR/Cas9系统在经济林木中的应用

2.1 果品类林木

近年来,CRISPR/Cas9系统在果树的生长发育、抗病性、果实品质改良等方面有着越来越广泛的应用^[29]。目前已建立该系统的果品类树木有：橙子(Citrus sinensis)、葡萄柚(C. paradisi)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、苹果(Malus prunifolia)、葡萄(Vitis vinifera)、梨(Pyrus communis)和石榴(Punica granatum)。

柑橘属(Citrus spp.)植物是最早尝试应用CRISPR/ Cas9进行基因编辑的木本植物。Jia和Wang^[30]针对甜橙CsPDS基因,采用柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri subsp. citri)促进的农杆菌注射法在离体叶片中首次证实了该系统在甜橙中应用的可行性,但基因编辑效率只有3.2%~3.9%,并未获得完整的基因编辑植株。随后,多个研究团队致力于改进转化方法和提高基因编辑效率,分别在晚锦橙(C. sinensis Osbeck)^[31]、枳橙(Poncirus trifoliate L. Raf. × C. sinensis L. Osb.)^[32]和葡萄柚(C. paradisi)^[33]中获得了能够稳定遗传的基因编辑株系,基因突变效率最高达到80%以上(表2)。柑橘溃疡病是危害柑橘属植物最严重的病害之一,CsLOB1是引起柑橘对溃疡病感病反应的关键基因,也是柑橘抗溃疡病研究的热门基因。应用CRISPR/Cas9对CsLOB1基因及其启动子序列进行编辑提高了柑橘对溃疡病的抗性^[31,33,34]。上述研究中采用的Cas9蛋白序列均来源于化脓链球菌(S. pyogenes),即应用最为广泛的SpCas9蛋白。Jia等^[35]利用来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9在枳橙中成功编辑Cs7g03360基因,该基因与番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) SlAgo基因同源,能够影响叶片发育,在获得的12个枳橙基因编辑株系中,基因突变效率在15.55%~79.67%之间,但均未出现预期表型,作者推测可能与未得到纯合突变系有关。最近,该研究团队又利用CRISPR/Cas12a系统在葡萄柚中编辑CsLOB1基因,获得3个突变株系,基因突变频率在15%~55%之间,这也是CRISPR/Cas12a系统首次应用于木本植物的研究报道^[36]。与Cas9蛋白不同的是,Cas12a识别富含T的PAM序列—“TTTV”,脱靶率更低,CRISPR/Cas9与CRISPR/Cas12a系统互为补充,丰富了植物基因组编辑系统选择的多样性^[37]。

猕猴桃是多年生木本攀缘植物,被誉为水果之王。Wang等^[38]以红阳猕猴桃为材料,比较了传统的CRISPR/Cas9系统和PTG/Cas9系统对猕猴桃AcPDS基因的编辑效率,两种系统均获得了白化植株,但PTG/Cas9系统的编辑效率比CRISPR/Cas9系统高10倍。PTG (polycistronic tRNA-sgRNA cassette)是应用内源tRNA加工系统开发的植物多基因编辑载体系统,该系统将多个tRNA-sgRNA结构串联排列,构建成一个多顺反子tRNA-sgRNA基因,该多顺反子转录后被加工成多个sgRNA分子^[39]。PTG/Cas9系统的高效编辑可能是由于tRNA序列中的增强子提高了sgRNA的转录水平^[39]。猕猴桃雌雄异株,童期较长,需要大约5年才能开花,Varkonyi-Gasic等^[40]通过编辑AcCEN4 和AcCEN基因获得了在组培阶段即可开花的雌株,研究结果为缩短多年生木本植物育种周期提供了借鉴和参考。

葡萄是果品及其加工产品中效益最高的大宗果品之一。为利用CRISPR/Cas9系统在葡萄中开展基因功能研究和基因改良,Wang 等^[41]鉴定了葡萄基因组中所有包含NGG的PAM位点及潜在的基因编辑靶点,开发了用于葡萄基因编辑的数据库Grape- CRISPR website (http://biodb.sdau.edu.cn/gc/index.html)。2016年,中国科学院植物研究所梁振昌团队首次利用葡萄悬浮细胞证明了CRISPR/Cas9系统在葡萄中的可行性,通过对葡萄酒石酸合成关键酶基因IdnDH进行敲除,成功降低了葡萄细胞中酒石酸含量^[42]。Nakajima等^[43]利用CRISPR/Cas9 系统对葡萄内源 PDS 基因进行编辑,获得的再生植株中白化苗比例最高达到72.2%。2018年和2020年,我国科学家分别对葡萄VvWRKY52和VvCCD8基因进行编辑,分别获得了对灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)抗性增强和分枝数增加的突变体材料^[44,45]。

为实现无外源DNA的基因编辑体系,Malnoy 等^[46]将体外组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein, RNP)转化葡萄原生质体(由愈伤组织制备),并通过高通量测序对靶基因MLO-7的编辑情况进行检测和分析,编辑效率只有0.1%;利用相同方法,该研究还对苹果叶片细胞制备的原生质体进行了转化,针对苹果DIPM同源基因的3条sgRNA中突变效率最高为6.9%,但未获得再生的基因编辑植株。Nishitani等^[47]以半矮化的砧木品种“JM2”为材料,针对PDS基因设计4条sgRNA,再生植株中有31.8%呈现部分或完全白化。最近,通过优化基因编辑载体,以“Gala”为受体材料,苹果基因编辑效率提升至85%以上;该研究还首次在梨树上应用CRISPR/Cas9系统,获得了由于PcTFL1.1基因突变导致提前开花的突变植株^[48]。石榴在我国栽培广泛,具有很高的食用和药用价值,由于石榴的离体再生比较困难,目前尚未建立完善的遗传转化体系。Chang等^[49]利用石榴发根培养体系,针对两个UDP-糖基转移酶基因PgUGT设计3条特异sgRNA,在两个PgUGT基因同时被编辑的发状根中,石榴特有的酚类物质安石榴苷含量降低40%,开启了CRISPR/Cas9系统对石榴基因编辑的应用。

2.2 饮料类林木

咖啡(Coffea canephora)和可可(Theobroma cacao)是世界上重要的热带经济树种,也是全球消耗最多的植物性饮料。2018年,来自法国和美国的科研人员分别建立了咖啡和可可的CRISPR/Cas9基因编辑系统^[50,51]。针对咖啡CcPDS基因开展的基因编辑研究中,虽然获得了纯合突变的T₀代植株,但与其他树种不同的是,CcPDS基因发生纯合突变的植株也未呈现完全白化,仅表现黄化、弱小等表型^[50]。可可黑果病是造成可可大面积减产的主要病害之一,研究显示可可免疫系统调节基因TcNPR3下调可以提高植株对疫霉菌的抗性^[52]。Fister等^[51]推测,利用CRISPR/Cas9系统敲除TcNPR3基因将大幅提高可可对疫霉菌抗性。他们首先利用农杆菌注射法,在离体叶片注射含基因编辑载体的农杆菌48 h后,接种疫霉菌,病斑面积较对照组显著减小,测序结果显示基因突变效率达27%;随后转化可可体细胞胚,但目前仅获得嵌合突变体胚^[51]。

2.3 工业原料类林木

木薯(Manihot esculenta)有肥厚的块状根,极富淀粉,是热带重要的食用植物之一,也是工业用粉主要原料之一。Odipio等^[53]基于MePDS基因在两种不同木薯品种(cv. 60444和TME 204)中首先建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统,两个品种分别获得58和25个独立转基因株系,再生植株中90%以上有白化表型,这一比例在木本植物基因编辑相关报道中是比较高的,作者推测这可能与CRISPR/ Cas9与gRNA表达盒整合入木薯基因组有关,持续表达的Cas9蛋白与sgRNA使得靶位点编辑的几率最大化。木薯褐纹病和花叶病是严重影响木薯产量的两种主要病害,培育抗木薯褐斑条纹病毒(cassava brown streak virus, CBSV)和抗非洲木薯花叶病毒(african cassava mosaic virus, ACMV)的新材料一直是木薯育种的研究热点。木薯褐纹病的发生依赖于CBSV基因组编码的VPg蛋白与寄主编码的转录起始因子的相互作用,利用CRISPR/Cas9同时突变木薯的两个转录起始因子基因nCBP-1和nCBP-2,能够提高木薯对CBSV的抗性,抑制病害症状的产生^[54]。值得注意的是,在利用CRISPR/Cas9系统培育抗ACMV木薯的报道中,研究人员设计了1条能够同时靶向病毒基因组上两个重叠基因(AC2和AC3)的sgRNA,首先获得了7个Cas9和sgRNA都表达的转基因株系,利用农杆菌浸润法接种ACMV八周后,在其中3个株系中检测到病毒基因组上的靶基因产生突变,但这些株系对ACMV的抗性并未改变^[55]。有文章评论称,对ACMV抗性并未改变的原因可能是病毒基因组在植物体内复制速度快,远远超过了产生基因编辑的速率;也有可能是农杆菌浸润接种方式造成病毒起始浓度过高导致^[56]。

橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻疯树(Jatropha curcas)同属大戟科热带经济作物。巴西橡胶树是当前商品天然橡胶的主要来源,但由于其异花授粉、童期长达6~7年等特性,常规育种方法效率低,难以满足经济需求。中国热带农业科学院华玉伟团队分别针对可以加快和延迟橡胶树花期的基因(FT和TFL1)设计sgRNA,利用PEG介导法将Cas9-sgRNA组装成的RNP导入叶肉细胞制备的原生质体,在国际上率先建立了橡胶树CRISPR/Cas9系统,为培育无外源DNA污染的基因编辑橡胶品系提供了参考^[57]。麻疯树种子可提炼生物柴油,是新兴的生物质能源树种。麻疯树雌雄异花同株,但花数量较少且雌雄花比例非常低,因此种子产量普遍较低^[58]。有研究报道,外源细胞分裂素处理麻疯花能够提高雌雄花比例从而增加种子产量^[59]。为研究细胞分裂素对麻疯树生长和成花的调控作用,中国科学院西双版纳热带植物园徐增富团队利用CRISPR/Cas9突变一个细胞分裂素合成的限速酶基因JcCYP735A,获得3个纯合突变株系,突变植株内源反式/顺式玉米素及其核苷浓度显著降低,突变体出现严重的生长抑制,株高仅是野生型植株的1/4^[60]。

大麻科山豆麻属植物Parasponia andersonii生长迅速,耐干旱瘠薄,是热带地区特有的先锋树种,而且该树种具有结瘤固氮能力,在土壤氮素输入和保持生态平衡等方面发挥重要作用。为研究P. andersonii根系结瘤过程,van Zeijl等^[61]利用CRISPR/ Cas9系统分别敲除PanHK4、PanEIN2、PanNSP1和PanNSP2四个基因,发现PanNSP1和PanNSP2基因对于根瘤的形成是至关重要的,而PanHK4突变导致茎的形成层活性降低,PanEIN2突变导致雌花中长出雄蕊,由单性花变成两性花。

竹子(Dendrocalamus spp.)虽属禾本科,但含大量纤维素,被视为具有特殊经济和生态价值的林木品种。Lin等^[62]最早利用绿竹原生质证实CRISPR/ Cas9可以用于编辑竹子内源PDS基因。Ye等^[63]在六倍体麻竹中建立了完善的基因编辑系统,该研究针对3对PSY1等位基因设计了两条sgRNA,成功编辑了麻竹3套亚基因组上的所有PSY1等位基因,获得了白化的突变体植株;此外,该研究还突变了一个赤霉素响应基因GRG1,该基因功能的缺失导致株高显著增加。

本文将CRISPR/Cas9系统在上述经济林木中的应用进行了归类总结(表2)。

Table 2
表2
表2CRISPR/Cas9系统在经济林木中的应用
Table 2Applications of CRISPR/Cas9 system in economic trees

科	属	物种名称	外植体	遗传转化方法	靶基因	涉及性状	基因编辑 效率(%)	参考文献
芸香科 (Rutaceae)	柑橘属 (Citrus)	甜橙 (Citrus sinensis cv. Valencia)	叶片	柑橘黄单胞菌 Xcc促进的农杆 菌注射法	CsPDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	3.2~3.9	[30]
		晚锦橙 (C. sinensis Osbeck)	上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	CsLOB1 启动子	抗溃疡病	11.5~64.7	[31]
		葡萄柚 (C. paradisi)	上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	CsLOB1 启动子	抗溃疡病	14.29~81.25	[33]
			上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	CsLOB1	抗溃疡病	31.58~89.36	[34]
			上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	CsLOB1	抗溃疡病	15~55	[36]
	枳属 (Poncirus)	枳橙 (Poncirus trifoliate L. Raf. × C. sinensis L. Osb.)	上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	PDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	45.5~75	[32]
			上胚轴	农杆菌介导的 遗传转化	Cs7g03360	叶片发育	15.55~79.67	[35]
猕猴桃科 (Actinidiaceae)	猕猴桃属 (Actinidia)	红阳猕猴桃 (Actinidia chinensis cv. Hongyang)	叶盘	农杆菌介导的 遗传转化	AcPDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	65.38~91.67	[38]
		中华猕猴桃‘Hort16A’ (A. chinensis cv. Hort16A)	叶盘	农杆菌介导的 遗传转化	AcCEN4、 AcCEN	开花提前,果实早熟、紧凑	30~75	[40]
葡萄科 (Vitaceae)	葡萄属 (Vitis)	‘霞多丽’葡萄 (Vitis vinifera L. cv. Chardonnay)	悬浮细胞	农杆菌介导的 遗传转化	IdnDH	降低酒石酸 含量	100	[42]
		无核白葡萄 (V. vinifera cv. Thompson)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	VvWRKY52	抗灰霉病	31	[44]
		‘麝香’葡萄 (V. vinifera L. cv. Neo Muscat)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	VvPDS	产生白化植株	2.7~72.2	[43]
		‘葡萄砧木41B’ (V. vinifera cv. Chasselas × V. berlandieri)	胚性悬浮 细胞	农杆菌介导的 遗传转化	VvCCD8	增加分枝数	66.7	[45]
		‘霞多丽’葡萄 (V. vinifera L. cv. Chardonnay)	原生质体	PEG介导 RNP转化	MLO-7	抗白粉病	0.1	[46]
蔷薇科 (Rosaceae)	苹果属 (Malus)	‘金冠’苹果 (Malus prunifolia cv. Golden delicious)	原生质体	PEG介导 RNP转化	DIPM-1、DIPM-2、DIPM-4	抗白粉病	0.1~6.9
		‘苹果砧木JM2’ (M. prunifolia (Wild.) Borkh. ‘Seishi’?×?M. pumila Mill. var. paradisiaca Schneid. ‘M.9’)	叶盘	农杆菌介导的 遗传转化	PDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	31.8	[47]
		'嘎啦'苹果 (Malus × domestica Bork.)	嫩叶	农杆菌介导的 遗传转化	MdPDS、MdTFL1.1	影响叶绿素生物合成,产生白化苗;也出现早花	85~93	[48]
	梨属 (Pyrus)	‘康弗伦斯’梨 (Pyrus communis L. cv. ‘Conference’)	嫩叶	农杆菌介导的 遗传转化	PcTFL1.1	提前开花	9
石榴科 (Punicaceae)	石榴属 (Punica)	石榴 (Punica granatum L.)	毛状根	发根农杆菌遗传 转化毛状根	PgUGT84A23、PgUGT84A24	降低酚类物质安石榴苷含量	-	[49]
茜草科 (Rubiaceae)	咖啡属 (Coffea)	中粒咖啡 (Coffea canephora clone 197)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	CcPDS	产生白化苗	30.4	[50]
梧桐科 (Sterculiaceae)	可可属 (Theobroma)	可可 (Theobroma cacao)	叶片	农杆菌介导的 遗传转化	TcNPR3	抗疫霉菌	27	[51]
大戟科 (Euphorbiaceae)	木薯属 (Manihot)	木薯 (Manihot esculenta cv. 60444; cv. TME 204)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	MePDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	97.1~98.9	[53]
		木薯 (M. esculenta cv. 60444)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	nCBP-1、 nCBP-2	抗木薯褐斑条纹病毒	91	[54]
		木薯 (M. esculenta)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	病毒基因AC2、AC3	抗非洲木薯花叶病毒	4.9~11	[55]
	橡胶树属 (Hevea)	橡胶树 (Hevea brasiliensis)	原生质体	PEG介导 RNP转化	FT、TFL1	提前开花	3.74~20.11	[57]
	麻疯树属 (Jatropha)	麻疯树 Jatropha curcas	子叶	农杆菌介导的 遗传转化	JcCYP735A	生长和成花 调控	-	[60]
大麻科 (Cannabaceae)	山豆麻属 (Parasponia)	Parasponia andersonii	茎和叶柄	农杆菌介导的 遗传转化	PanHK4、PanEIN2、PanNSP1、PanNSP2	根瘤形成、茎形成层活性、植株性别	48~89	[61]
禾本科 (Poaceae)	簕竹属 (Bambusa)	绿竹 (Bambusa oldhamii)	原生质体	PEG介导质粒 DNA转化	PDS	影响叶绿素生物合成,产生白化苗	12.5	[62]
	牡竹属 (Dendrocalamus)	麻竹 (Dendrocalamus latiflorus Munro)	愈伤组织	农杆菌介导的 遗传转化	DlmPSY1-A、DlmPSY1-B、DlmPSY1-C、GRG1	白化苗,株高增加	40~100	[63]

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3 结语与展望

相比于草本模式植物和粮食作物来说,CRISPR/ Cas9系统在木本植物基因功能研究和品种改良方面的应用相对滞后,多数尚处于基因编辑体系建立的初步阶段。在林木上应用CRISPR/Cas9系统所面临的主要问题及发展趋势主要体现在以下几个方面：(1)现有植物sgRNA在线设计软件数据库中仅包含毛果杨等少数木本植物基因组信息,建立针对木本植物的sgRNA设计和检测脱靶效应的公共网络平台,收集更多品种的基因组数据,特别是生产上常用林木良种的基因组信息,无疑会大大改善CRISPR/ Cas9系统的应用环境。(2)多数木本植物尚不具备完整的组培再生体系和(或)稳定的遗传转化体系,无法利用基因工程技术进行遗传改良。因此,发展完善更多树种的遗传转化体系是扩大CRISPR/Cas9系统应用范围的重要基础。(3)农杆菌介导的遗传转化在获得稳定转基因植株的同时伴随筛选标记基因、Cas9基因等外源DNA的插入。粮食等农作物可以在后代群体的分离中获得无外源DNA污染的遗传改良品系,但木本植物通常具有较长的童期,且普遍采用扦插等无性繁殖方式,难以通过上述方法实现无外源DNA污染的基因编辑,这就涉及基因水平转移、基因垂直流动等生态风险问题。直接向细胞内导入Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物可以很好的解决外源DNA污染问题,但该技术依赖于原生质体制备和再生体系,因此开发木本植物的原生质体制备和再生体系,提高单细胞转化效率,将有助于加快基因编辑优良品系的产生。

Cas9蛋白对sgRNA与靶位点的碱基错配非常敏感,越靠近PAM位点的碱基错配对Cas9的活性影响越大^[64]。林木由于长期异交,基因组高度杂合,为CRISPR/Cas9系统的应用提出了新的挑战和机遇：一方面,基因组序列的多态性有可能影响CRISPR/ Cas9同时对多个基因进行编辑,增大了在遗传转化T₀代即可获得纯合或双等位基因突变株系的难度;另一方面,等位基因间存在的丰富序列变异使得针对某一个等位基因的特异编辑(allele-specific editing)成为可能。开发等位基因特异的sgRNA,获得等位基因特异的基因编辑株系,可以为研究基因功能冗余和基因剂量效应提供必要的研究材料。

突变体对于植物基因功能研究至关重要。CRISPR/Cas9系统可以在基因组特定位置引入突变,极大提高了目的基因突变效率,节省了对大规模群体的筛选工作。中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋院士研究团队已利用大规模的sgRNA文库在全基因组水平上对水稻基因进行编辑,获得了9万多个靶向缺失突变体,为水稻功能基因组学研究奠定了基础^[65]。木本植物突变体材料匮乏,人工诱发突变鉴定困难,限制了功能基因组研究和遗传育种进程。进一步提高林木遗传转化和再生效率,利用CRISPR/Cas9系统创制林木定向突变体库将为深入研究林木基因功能和林木基因资源的开发提供宝贵的材料基础。此外,基于CRISPR/Cas9系统衍生的很多新技术,如CRISPR/Cpf1系统、靶向基因激活与抑制、基因定向敲入、碱基编辑技术(包括胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器)等^[66,67],在木本植物上的应用还非常有限,拓宽这些新技术在林木上的应用范围也将成为今后的发展方向。

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