何祥鹏^1,2, 邹秉杰², 齐谢敏², 陈杉², 陆妍², 黄青³, 周国华^,1,21. 中国药科大学生命科学与技术学院,南京 210009
2. 东部战区总医院(原南京军区南京总医院)药理科,南京 210002
3. 江苏省食品药品监督检验研究院检验技术研究中心,南京 210000

Methods of isothermal nucleic acid amplification-based microfluidic chips for pathogen microorganism detection

Xiangpeng He^1,2, Bingjie Zou², Xiemin Qi², Shan Chen², Yan Lu², Qing Huang³, Guohua Zhou^,1,21. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
2. Department of Pharmacology, Jinling Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210002, China
3. Center of Inspection and Technical Research, Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210000, China

通讯作者: 周国华,博士,研究员,研究方向：分子诊断。E-mail: ghzhou@nju.edu.cn

编委: 张天宇
收稿日期:2019-02-27修回日期:2019-05-6网络出版日期:2019-07-20

基金资助:

国家自然科学基金项目.61871403 国家自然科学基金项目.81673390 国家自然科学基金项目.81603219 国家自然科学基金项目.81603196 江苏省****基金项目.BK20180005 江苏省六大人才高峰项目.2015-WSN-085 江苏省青年医学重点人才项目资助.QNRC2016889

Received:2019-02-27Revised:2019-05-6Online:2019-07-20

Fund supported:

Supported by the National Natural Science Foundation of China.61871403 Supported by the National Natural Science Foundation of China.81673390 Supported by the National Natural Science Foundation of China.81603219 Supported by the National Natural Science Foundation of China.81603196 Jiangsu Provincial Science Fund for Distinguished Young Scholars.BK20180005 Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province.2015-WSN-085 Jiangsu Provincial Medical Youth Talent Program.QNRC2016889

作者简介 About authors
何祥鹏,硕士研究生,专业方向：分子诊断E-mail:hxpbio@outlook.com。









摘要
病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于PCR的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题,已成为目前最主要的病原微生物筛查方法。然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。本文从核酸等温扩增原理、进样方式、检测方式等方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。
关键词： 病原微生物检测;等温扩增;微流控芯片

Abstract
Rapid detection of pathogenic microorganisms is key to the epidemiologic identification, prevention and control of disease in the field of public health. PCR-based pathogen detection methods have been widely used because they overcome the time-consuming issues that traditional culture-based methods required including the limited window required by immunological detection. However, the requirement on precision temperature-controlled thermal cyclers severely limits their use in resource-limited areas. The detection methods of pathogenic microorganisms based on isothermal amplification of nucleic acids are free of dependence on high-precision temperature control equipment, but requirements for nucleic acids extraction, amplification and detection must be defined. In recent years, a number of alternative methods for pathogenic microorganism detection have been developed by combining microfluidic technology with nucleic acid isothermal amplification technology. By designing the chip structures, optimizing the injection modes, and utilizing multiple detection and quantitative methods, the integration of pathogen nucleic acid extraction, amplification and detection is achieved. The method provides advantages of less instrument dependence, decreased operator requirements, smaller sample size, and higher automation which are suitable for the rapid detection of pathogenic microorganisms in various environments. In this review, we summarize several microfluidic detection methods based on nucleic acid isothermal amplification for pathogens including amplification principles, injection methods and detection methods. These methods provide more capability for the rapid screening of pathogenic microorganisms which enhances the management of infectious diseases in the field of public health.
Keywords：pathogen microorganism detection;isothermal amplification;microfluidic chip


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本文引用格式
何祥鹏, 邹秉杰, 齐谢敏, 陈杉, 陆妍, 黄青, 周国华. 基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术[J]. 遗传, 2019, 41(7): 611-624 doi:10.16288/j.yczz.19-051
Xiangpeng He, Bingjie Zou, Xiemin Qi, Shan Chen, Yan Lu, Qing Huang, Guohua Zhou. Methods of isothermal nucleic acid amplification-based microfluidic chips for pathogen microorganism detection[J]. Hereditas(Beijing), 2019, 41(7): 611-624 doi:10.16288/j.yczz.19-051


世界卫生组织(World Health Organization,WHO)发布的《2018世界卫生统计报告》指出,病原体依然是危害人类健康与生命的重要原因之一,尤其对6岁以下儿童,由病原体引起的呼吸道感染、腹泻及疟疾是导致死亡的第一原因。在病原体类型中,尤以病原微生物传播更为隐秘,疫情爆发更为突然、难控,破坏性往往也更为严重,例如2018年8月在我国爆发的非洲猪瘟疫情,给国家造成了重大经济损失,同时也使食品安全面临严峻挑战。因此,对病原微生物的防控关乎人民健康与国家安危,发展简单快速的病原微生物检测技术是病原体防控的关键之一^[1]。

对病原微生物检测的早期策略主要是基于对病原体的分离和培养,非常耗时耗力,难以满足对突发疫情防控的要求。尽管现在普遍使用的基于免疫方法的病原微生物检测非常简便快速^[2],但因存在检测窗口期及灵敏度还不够高而限制了应用。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的发展给病原微生物检测带来了革命性的变化^[3],通过PCR扩增病原微生物核酸,使高灵敏和高特异检测单个病原微生物已成为现实^[4],采用荧光定量PCR与数字化PCR技术,甚至还能实现病原微生物的精确定量^[5]。或借助芯片技术可在简化操作的同时实现多重PCR检测^[6]。然而,对热循环仪的依赖使基于PCR的病原微生物核酸检测仍难以在基层医疗单位或者资源匮乏的偏远地区推广使用。

核酸等温扩增技术突破了核酸检测对热循环设备的依赖,仅需简单的温控装置或在室温下即可实现对靶标核酸高灵敏度的检测^[7],这使构建病原微生物现场快速检测平台更加容易。但基于等温扩增的病原微生物核酸检测方法依然离不开核酸提取、扩增与检测等步骤,对场地及人员要求依然较高。近年来,微流控技术的突飞猛进助力病原微生物核酸等温扩增检测进入了一个新阶段。通过对微流控芯片的结构设计和功能化分区,可以在一块微小芯片内部集成传统实验室里的核酸提取、等温扩增与产物检测,实现“样本进结果出”(sample-to-answer)的现场快速检测^[8]。由于微流控芯片具有操作简便、对操作人员要求不高、所需样本量少和检测成本低等优点^[9],众多研究者将微流控技术与等温核酸扩增技术结合用于病原微生物的检测,它们在扩增原理、进样途径、检测方式等方面各具特色,本文对目前基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术及其研究进展进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。

1 基于重组酶聚合酶扩增的病原微生物微流控检测技术

2006年,Piepenburg等^[10]首次提出了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重组酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和单链结合蛋白(gp32)以及两条特异性的上下游引物参与的等温扩增。首先,T4 uvsX在辅助因子uvsY的作用下与引物结合形成核酸蛋白复合物,然后该复合物寻找与靶标DNA的互补区域进行杂交并置换下另一条单链,置换下的单链马上被gp32结合防止其再与互补链杂交,最后T4 uvsX在ATP的作用下与引物解离,聚合酶Bsu与引物结合并沿模板进行延伸(图1)。该反应在37~42℃下30 min内可以获得10¹²拷贝的扩增产物,其灵敏度可达到单拷贝,其扩增产物长度在500 bp以内最佳^[10]。对RPA产物的检测可采用包括琼脂糖凝胶电泳^[10]、荧光探针实时检测^[10]、及侧流层析检测^[10]等多种方法。由于RPA反应快速、灵敏以及恒温条件温和等特点,因此易于与微流控芯片结合开发出对病原微生物的即时检测(point-of-care testing, POCT)技术。

图1

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图1重组酶聚合酶扩增反应基本原理

1：在重组酶作用下,引物与靶序列结合;2：引物与靶序列结合后置换下的单链被单链结合蛋白结合;3：在聚合酶作用下进行延伸,同时置换下的单链被单链结合蛋白结合;4：同源双链分离,持续延伸;5：形成新的双链,并进行下一个循环。参考文献[10]修改绘制。
Fig. 1Principle of recombinase polymerase amplification

1.1 不同进样方式的RPA芯片

POCT技术是病原体检测的发展方向,尽管微流控芯片的便捷性、易操作性和低成本都符合POCT的要求,但依靠高精度注射泵或压力泵的进样方式无疑会限制其应用^[11],因此无仪器、无电力消耗的进样方式是病原微生物检测芯片的发展方向之一。为摆脱对进样泵的需求,碟式微流控芯片(图2A)孕育而生,其内部提前预载样本提取、扩增与检测反应所需试剂,通过不同功能区的逻辑排布、管道通路的设计,利用离心力进样,控制样品停留在不同区域,依次完成样本提取、RPA扩增及产物检测等步骤,极大简化了操作流程。韩国科学技术研究院Tae Seok Seo课题组开发的碟式RPA芯片设置有3 个重复单元,一次可检测3个样本,每个重复单元含有储样池、分装室、废液池、毛细管微阀、RPA试剂存放室、反应室(引物探针存放室),不同功能区配合不同转速可依次实现样本的分离、反应试剂预混,扩增反应及检测^[12]。由于每个单元设置有4个反应室,其中1个作为阴性对照,其他3个通过放入不同靶标对应的引物探针,可实现对单个样本进行三重检测(图2A)。Chen等^[13]开发了用于尿液常见病原微生物检测的碟式RPA芯片,可同时检测两个样本,每个样本可筛查9个靶标。但碟式芯片由于需要离心完成各个步骤,且需要配备特定的检测设备,仍无法摆脱对复杂仪器的依赖。为简化进样方法,Rohrman等^[14]开发了一款基于纸基与塑料的RPA芯片。首先将反应试剂与醋酸镁分别加到芯片左右两个区域,将芯片尾巴放入样本管内,然后将带有样本的尾巴折叠至试剂区,再将整个芯片对折,激活剂醋酸镁与体系混合,开始恒温反应(图2B)。该芯片通过手工操作替代了管内体系配制的复杂流程,简化了操作流程,但该方法需要对产物进行稀释后经过侧流层析试剂条检测结果,增大了产物交叉污染的可能性。由于RPA反应体系内酶组成较为复杂,且体系内不同酶发挥作用有先后顺序要求,因此需要严格控制不同反应组分的加入次序,这给RPA芯片进样方式的设计带来了一定的难度,也是RPA芯片进样方式较为单一的原因。随着微流体技术的进步,将可能有更简便有效的进样方式供RPA芯片使用,如采用电流控制的微液滴操控技术^[15]等,但如何实现无需仪器的RPA进样依然是一个挑战,也是RPA芯片进行病原微生物即时检测的发展方向。

图2

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图2RPA微流控芯片

A：碟式芯片示意图,芯片内部集成样本提取、扩增功能区,并通过集成的侧流层析试纸条进行结果检测;“?”：有无待测靶标;“×”：无;“○”：有;虚线框：检测结果指示区。B：塑料-纸基混合微流控芯片,首先在塑料内左右两个纸基上加入醋酸镁与体系混合物,之后将样本提取条放入样品管内进行核酸提取,最后将提取条及芯片折叠,开始进行扩增反应。C：滑动式数字化定量RPA芯片,在两个进样孔内分别加入反应体系与激活剂,之后将芯片滑动,分成多个独立的反应单元,同时反应体积与激活剂混合,反应开始进行。参考文献[14,16,21]修改绘制。
Fig. 2RPA microfluidic chip

1.2 不同检测方式的RPA芯片

目前用于病原微生物检测的RPA芯片多采用荧光探针和侧流层析进行结果指示。多种碟式微流控芯片均是将冻干Exo荧光探针提前预载在反应室 内,反应过程中通过荧光检测装置可实时读取荧光信号^[12,13],并成功地对牛奶中食源性致病菌包括肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行检测,在30 min内,检测灵敏度为1.25 个细胞/μL。该方法结果判读准确性高,灵敏度与特异性好,但对配套仪器依赖性高。韩国国立蔚山科学技术院Yoon-Kyoung Cho课题组将侧流层析试纸条与碟式芯片进行了整合,可直接通过肉眼进行结果判读,摆脱了对荧光检测装置的依赖,同时又集成了样本处理、扩增反应,而且整个过程是在封闭的芯片内完成,可有效避免传统的试纸条检测时开管所带来的污染问题(图2A)^[16]。该芯片针对PBS和乳制品中沙门氏菌(Salmonella)检测限分别为10¹ CFU/mL和10² CFU/mL。然而,不论荧光探针还是试纸条检测,往往仅能对一种至数种病原微生物进行同时检测,难以实现多重病原微生物组合筛查。将微阵列芯片^[17]或液相微球解码技术^[18]与之结合,可能是实现RPA芯片多重检测的有效途径。

1.3 可定量检测的RPA芯片

定量检测对诸如HBV等病原微生物的治疗非常重要^[19]。韩国科学技术研究院Tae Seok SeoSeo课题组尝试用实时荧光RPA定量检测食物毒性病原微生物,但其定量线性范围仅为4个数量级,且定量线性相关系数R²值仅为0.97^[12]。这是由于不同于PCR,RPA反应并不存在扩增循环数,其扩增产物的生成也并非严格按指数增长,因此利用类似于荧光定量PCR的定量方法并非十分准确,而且在微流控芯片平台上搭建可实时测定荧光信号的装置无疑会增加设备成本。数字化检测无疑是实现等温扩增定量检测的最佳途径。将待测模板分子按泊松分布原理分散成单靶标分子反应单元,然后对每个阳性反应单元进行计数,可实现对待测模板的绝对定量^[20]。因为RPA可以在常温反应,加入镁离子体系,酶的活性被激活,扩增便开始进行,因此常规的微液滴数字化检测芯片并不适用于RPA。Feng等^[21]则开发了一款数字化RPA滑动微流控芯片,可以控制每个反应单元内的RPA反应同步开始。该芯片由上下两片组成,两片的进样通道互不相通且平行。从两个进样通道分别加入激活剂醋酸镁和RPA反应体系,经过滑动之后形成1550个独立的反应单元,两个 通道内的体系进行混合,由醋酸镁激活RPA反应,之后通过荧光扫描拍照进行绝对定量(图2C)。该方法检测限可达300拷贝/mL,其定量线性范围为10³~10⁶拷贝/mL。然而,该芯片反应单元数有限,严重制约了其检测灵敏度和定量范围,开发具有更多反应单元数目的RPA定量检测芯片是数字化RPA芯片的发展趋势。

2 基于环介导等温扩增的病原微生物微流控检测技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi等^[22]于2000年首次发表,该反应原理如图3所示。针对待测靶标设计一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP,在具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,引物沿模板发生延伸和链置换反应,产生长短不一的靶标重复片段,该反应通常在60~65℃进行,1 h内将待测靶标扩增10⁹倍以上,灵敏度可达到检测10拷贝的待测靶标。通过额外引入一对环状引物可显著提升其检测灵敏度并使反应时间缩短至30 min内^[23]。其扩增产物可通过凝胶电泳^[22]、双链嵌合染料^[24]、比浊法^[25]、钙黄绿素^[8]、羟基萘酚蓝^[26]、pH响应显色^[27]、纳米金可视化^[27]等方法进行检测。鉴于LAMP灵敏度高、检测方式多样、反应速度快等优点,近年来发展了很多LAMP微流控芯片,它们在进样方式、产物检测方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸检测方面均具有较好的应用前景。

图3

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图3环介导等温扩增原理

A：LAMP外引物F3/B3和内引物FIP/BIP与靶标互补的6个区域,如其中F3与F3c互补,B3与B3c互补;B：起始结构产物生成步骤,引物FIP通过F2区域与模板链F2c结合并进行延伸,之后F3与靶标F3c结合并进行链置换反应,FIP延伸产物被替换释放,释放的单链末端形成环结构(结构3)。BIP和B3以相似的方式进行,生成两端具有环结构的产物5。C：循环放大步骤,结构5以自身为模板,从3°末端F1区域开始自引发DNA合成,同时FIP退火至环状结构中的F2c区域并进行延伸得到结构6。结构6以自身为模板延伸,置换下与结构5互补的产物7。结构7到结构8再到结构5与结构5到结构6再到结构7类似。结构9和结构10分别由结构6和结构8生成。在环状结构与FIP/BIP引物的共同作用下生成含有多个重复靶标序列的结构11、12。参考文献[22]修改绘制。
Fig. 3Principle of loop-mediated isothermal amplification

2.1 不同进样方式的LAMP微流控芯片

不同于RPA反应,LAMP无需严格控制反应体系内各组分的加入次序及酶的激活时间,使LAMP微流控芯片的进样方式设计更为容易。因此,除了基于碟式的LAMP微流控芯片^[8,29,30]外有更多进样形式可供选择。有研究者利用纸的吸水性进样,可在芯片内完成样本的提取,并通过预载的冻干试剂完成核酸扩增检测反应^[31],相对于RPA纸基芯片其集成度更高,整个过程无需额外手动操作,使病原微生物检测更为方便高效。但该类芯片的操作与检测依然为开放式,易产生扩增产物交叉污染,导致假阳性结果。美国加利福尼亚大学伯克利分校Luke P. Lee课题组开发了一款利用真空负压自动进样大的微流控芯片,如图4A所示。该芯片以PDMS为基质,在进样通道及反应室周边设置密闭的真空室,将芯片放置于真空环境中。由于PDMS具有透气性,因此真空室内的空气会逐渐被排空,芯片内部形成负压,由此提供进样动力,同时该芯片反应单元为一个封闭空间,可最大程度防止产物交叉污染的发生^[32]。但是由于难以控制负压的大小,使该芯片较难集成样本提取步骤。因此,如何实现无仪器依赖的进样方式是LAMP芯片发展的重要方向,也是实现病原微生物POCT的关键之一。

图4

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图4LAMP微流控芯片

A：真空自动进样LAMP芯片,由于反应单元外侧被真空通道包围且PDMS具有透气性,因此反应室内的空气进入到真空通道中而形成负压,进而将加样孔内的样本吸入到反应单元内部;B：比浊法LAMP微流控芯片,根据LAMP在反应过程中产生焦磷酸镁沉淀的原理,可以通过检测LAMP反应室内透光率的变化而判断LAMP反应是否进行;C：十字型液滴生成LAMP芯片,LAMP体系经芯片十字星通道生成微液滴,并在芯片内完成LAMP反应。之后在液滴流出的过程进行荧光检测,通过对阳性液滴的统计进行绝对定量;D：可捕获液滴LAMP芯片,在S型通道之间设置捕获井,使生成的液滴被捕获,最终形成规则的液滴阵列,可直接对芯片进行荧光成像分析。参考文献[11,29,37]修改绘制。
Fig. 4LAMP microfluidic chip

2.2 不同检测方式的LAMP微流控芯片

由于LAMP反应过程中除了生成大量的双链核酸之外还会伴随产生大量的焦磷酸根副产物,因此基于此类特性研发者还开发了多种不同于RPA的LAMP反应检测方式,如比浊法、碱土金属指示剂等,但如何将这些检测方式在微流控芯片上实现是发展LAMP微流控芯片的另一挑战。中国国家纳米科学中心蒋兴宇课题组利用LAMP反应过程中体系浊度的变化开发了一套用于病原微生物检测的LAMP微流控系统,该系统在反应通道两侧接入光纤,一侧连接LED,另一侧连接数字光学传感器。当反应通道内发生浊度变化时,光学传感器可检 测到光强度的变化进而实现对反应结果的判读(图4B)。该芯片仅需0.5 μL DNA样本,灵敏度可达10 fg/μL^[25]。此外,利用荧光嵌合染料检测产物也开发出多种LAMP微流控芯片,如Pang等^[33]针对SYBR Green染料检测LAMP反应产物时会存在弱阳性难以鉴别的问题,提出了羟基萘酚蓝与SYBR Green混合染料对微流控芯片内的LAMP产物进行指示的策略,阳性结果为绿色,阴性结果为橘红色,显著提升了检测结果的准确率,但该方法需要荧光成像系统。此外,有多个课题组利用钙黄绿素指示芯片内的LMAP产物,可通过裸眼或者手机拍照进行检测,但钙黄绿素对LAMP存在一定的抑制作用,且拍照需在暗室进行。Tae等^[16]开发了一种纸基微流控芯片,通过pH响应的指示剂对LAMP产物进行检测,阴性为棕色,阳性为黄色,可以直接通过裸眼观察,与钙黄绿素法相比灵敏度显著提升,但该方法阳性与阴性区分不够明显,受主观因素影响容易出现误判,且基于纸质材料的LAMP微流控芯片往往为非封闭检测,容易产生扩增产物交叉污染而导致假阳性结果。为了避免荧光染料造成的反应抑制、结果判读不便捷、不准确等问题,近年来还出现了一些通过监测电磁场变化从而对结果进行判读的LAMP微流控芯片。Zhi等^[34]通过在反应体系中引入能与产物结合的磁性纳米簇,再通过芯片内置的巨磁阻传感器(GMR)用于检测反应前后的磁性变化,进而将磁信号转化为电信号用于结果判读。Hsieh等^[35]直接在芯片反应体系内加入亚甲蓝(MB),由于反应后亚甲蓝与DNA双链产物结合,游离亚甲蓝量的变化会引起电流改变,可通过对电流的检测判读是否有LAMP产物。尽管LMAP微流控芯片检测方式更为多样,但对LAMP产物的检测均为非序列特异性检测,大多基于反应体系物理特性变化或是基于DNA双链嵌合染料,难以区分特异性扩增产物与非特异性扩增产物,易造成假阳性结果。因此,开发出特异性更高的LAMP微流控芯片检测方式将更有利于其在病原微生物检测中的应用。近年来发展的基于核酸侵入反应的多重LAMP产物检测方法实现了在单碱基分辨水平鉴别LAMP产物^[28]。如果将其与LAMP芯片相结合,无疑是提高LAMP芯片检测特异性的有效途径。

2.3 可定量检测的LAMP微流控芯片

目前,可定量检测病原微生物的微流控芯片大多采用实时检测荧光信号或电信号的方法来进行监测LAMP扩增产物的变化,从而根据扩增产物达到检测阈值的时间进行定量^[25,34~36]。然而,与RPA类似,LAMP也并非严格的指数扩增,通过实时荧光定量并非十分精确,开发数字化LAMP芯片依然是实现精确定量的途径。由于LAMP最适温度在65℃,可以通过对温度的控制来实现LAMP的反应起始,因此液滴式数字化LMAP芯片的开发便成为了可能。Wang等借鉴液滴数字化PCR的原理开发出了数字化LAMP芯片,该芯片集成了液滴生成、LAMP反应和阳性反应单元在线计数功能(图4C)。通过计算阳性液滴与阴性液滴的比例实现绝对定量,在0.0001~1拷贝/液滴的范围内,投入模板量与检出模板量的定量线性相关系数(R²值)可达0.9997^[37]。Ma 等^[11]通过巧妙的芯片结构设计,实现了在芯片内生成液滴之后对其进行捕获,从而构成30 × 8的液滴阵列(图4D)。该方法在一定程度上减少了液滴不均一及聚集问题带来的定量误差,并通过芯片直接拍照扫描的方式直接进行计数,整合了微阵列芯片与液滴芯片的优势,可在40 min内实现50~25000拷贝/μL模板分子的精确定量,其灵敏度可达单拷贝。尽管如此,微液滴的制备依然需要十分精密的进样装置与设备,这无疑增加了芯片的设计难度和操作要求。因此,该课题组开发了更简便的反应单元生成方法,通过对PDMS表面的亲水改性实现了反应体系的自动流入,待体系完全进入芯片之后,配合独特设计的气动微阀可将芯片分隔为一个个封闭的反应单元,构成微阵列芯片,实现数字化LAMP检测^[38]。该方法无需额外的辅助进样装置,数字化微孔体积变化在3.78%以内,极大地简化了液滴的制备流程,降低了由液滴不均一带来的误差。其最低检测限达0.37拷贝/μL。然而,与RPA数字化检测芯片相同,如何设计制作反应单元数目更多的数字化LAMP芯片是提高检测灵敏度和定量准确性的技术瓶颈。

3 基于其他核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

3.1 基于滚环扩增的病原微生物微流控检测技术

滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是一种具有链置换活性DNA聚合酶催化的等温扩增反应,需要一条锁式探针与靶序列杂交后连接成环状模板,引物与环状模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链,最终产生重复的长单链DNA产物^[39](图5A)。在RCA基础上通过引入与延伸产物退火杂交的另一条或多条引物可形成超分支RCA,实现超指数式扩增^[40];或通过偶联RCA与核酸侵入反应实现低成本、高灵敏、高特异性的信号放大核酸检测^[41]。Jiang等^[42]开发了一款RCA芯片,其通道内修饰的适配体可捕获病原微生物,再通过另一适配体引物与菌体结合形成“三明治”结构,利用适配体引物引发RCA反应进行信号放大,最后通过荧光探针的杂交进行检测(图5B),该方法可检测10²个细胞/mL的E. coli O157:H7。但由于RCA需要锁式探针首先与靶标连接成环,连接与扩增步骤一般不在同一体系进行,因此较难开发集提取、扩增和检测于一体的RCA微流控芯片。

图5

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图5RCA反应原理及微流控芯片

A：RCA扩增原理,环状模板两端与连接模板退火,并进行连接,使模板成环,之后引物与环状模板退火后经DNA聚合酶进行延伸,最终可得到一条含有多个重复模板序列的长DNA单链。B：RCA微流控芯片,在微流控内壁修饰由适配体,可将大肠杆菌特异性捕获。适配体-引物复合体与被捕获的大肠杆菌结合,引物以环状DNA为模板进行延伸,通过荧光探针对延伸产物进行检测。参考文献[40,42]修改绘制。
Fig. 5Principles of RCA and the microfluidic chip

3.2 基于依赖核酸序列扩增的病原微生物微流控检测技术

1991年,加拿大Cangene Corporation公司Jean Compton实验室首次提出依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)^[43]。该方法以单链RNA为模板,在恒温条件下,通过逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物来模拟体内逆转录病毒的复制机制对目标RNA进行扩增(图6A)^[44],90min内可以将靶标扩增至10¹²,其产物长度为100~250 bp,灵敏度可达检测单个拷贝的靶标分子^[45]。产物可通过琼脂糖凝胶电泳^[43]、分子信标荧光探针^[46]或与焦磷酸测序结合进行检测^[47]。通过调整NASBA扩增程序可以用于DNA的检测,但需要反复开管加入不同阶段所需要的组分^[48]。Wang等^[44]发展了一种可以进行数字化检测的NASBA芯片(dNASBA),如图6B所示,沿芯片主通道分布多个独立小室,小室最末端伸出分支通道与主通道相通。首先通入油相排除芯片腔体内的空气,进样口加入水相体系并在出样口连接负压,基于流体的固有性质及芯片结构,液体会经主通道自动填充至每个分离的小室,但不会进入分支通道,再加入油相填充主通道使每个小室体系隔离,完成反应体系的数字化分布。该芯片对血浆样本HIV RNA的定量检测结果表明其检测限低至1拷贝/μL。然而,NASBA扩增步骤多,反应体系较复杂,不易开发成微流控检测芯片,因此基于NASBA的病原微生物检测芯片鲜有报道。

图6

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图6NASBA反应原理及微流控芯片

A：NASBA扩增原理,含有T7序列的引物1与靶RNA杂交,进行逆转录生成DNA,加Rnase使RNA降解,并加入引物2与DNA杂交延伸,生成双链DNA。由双链DNA经T7 RNA 聚合酶进行转录生成RNA。然后进行循环。最终生成大量RNA经荧光探针进行检测。B：NASBA数字化微流控芯片,首先在干净的芯片通入油相填充真个芯片,再加入反应体系,使反应体系填充至每个小室。由于小室底部通道疏水,因此并不会经小室底部的通道流出。最后再通油相封闭主通道,使每个小室独立分隔。形成数字化液滴芯片。参考文献[44]修改绘制。
Fig. 6Principles of NASBA and the microfluidic chip

3.3 基于解旋酶依赖性扩增的病原微生物微流控检测技术

在体内,DNA通过解旋酶、DNA聚合酶及各种辅助蛋白因子进行复制,Vincent等^[49]模仿这一过程开发出了体外解旋酶依赖性扩增法(helicase-dependent amplification, HDA)。该方法原理如图7A所示,首先DNA双链被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分离为单链并分别被单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)结合,之后两条上下游特异性引物分别与模板杂交,在DNA聚合酶(exo^- Klenow)的作用下延伸,合成新的双链,在37℃条件下反应1~2 h可获得10⁶倍的扩增产物,其靶序列在400 bp范围内可以得到有效扩增。后来有研究将UvrD解旋酶与Bst-DNA聚合酶偶联构成一种双功能蛋白,可显著提升HDA反应速率,并可实现长达2.3 kb的片段扩增^[50]。目前有多种方式可以用于HDA产物的检测,包括琼脂糖凝胶电泳^[51]、双链嵌合荧光染料^[52]、发卡荧光探针^[53]、TaqMan探针^[54]等。Mahalanabis等^[55]开发了一种μSPE-HDA芯片,可直接将样本裂解液注入芯片进样孔,流经芯片内置的固相萃取色谱柱,之后进行洗涤洗脱完成DNA的提取,再将提取的DNA和HDA反应体系直接注入混合室,经混匀后进入反应室(整个过程通过瓣阀控制废液、洗脱液和体系的流向) (图7B)。该芯片极大地简化了用户的操作,检测限可达10 CFU/mL。然而,HDA反应体系复杂,反应过程难以控制,给基于HDA的微流控芯片设计带来了困难。

图7

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图7HDA反应原理及微流控芯片

A：HDA扩增原理,首先双链DNA经解旋酶解旋,单链被单链结合蛋白结合。引物与单链特异性杂交后经聚合酶延伸,最后形成新的双链;B：HDA微流控芯片,芯片内置SPE提取柱、反应单元、废液池,各位置开关阀门可控制液体流向。反应末端为疏水出气孔,可在满足进样的同时防止液体流出。参考文献[55]修改绘制。
Fig. 7Principles of HDA and the microfluidic chip

4 结语与展望

核酸等温扩增技术因其反应条件温和而备倍受病原微生物检测的青睐^[56]。虽然各种核酸等温扩增技术在反应体系组成、反应条件、检测方式等方面均各有优劣(表1),但它们依然离不开核酸提取、扩增与产物分析等步骤,如何简化与集成这些繁琐操作步骤成为病原微生物核酸现场快速检测的关键。微流控芯片与核酸等温扩增技术的结合成功解决了这一问题。近年来,基于核酸等温扩增的微流控芯片层出不穷,通过优化设计进样方式和检测方式,开发出了集核酸提取、等温扩增与检测高度整合的一体化病原微生物检测芯片,实现了无仪器进样、多样本和多重检测等功能,极大地简化了操作流程,降低了病原微生物核酸检测对实验人员与环境的要求,有利于偏远地区或资源匮乏地区病原微生物的防控。但是,目前的病原微生物等温扩增检测芯片依然有很大的提升空间。在进样方式方面,虽然碟式芯片可以实现将分子生物学实验室内的常规操作步骤进行集成整合,但其需要额外的离心装置;纸基芯片虽然摆脱了设备的依赖,但其开放式的检测环境容易引起样本间的交叉污染;虽然基于芯片通道表面亲水改性或真空负压结构的自动进样方式摆脱了仪器并可实现封闭检测,但如何集成样本的核酸提取是该类芯片需要进一步解决问题。在检测方式方面,基于荧光探针、双链DNA嵌合染料或电化学法的芯片虽然在特异性、灵敏度或定量方面具有优势,但是此类芯片需要额外的荧光监测或电化学监测仪器;而基于纳米金显色、pH响应显色、碱土金属指示剂显色等可视化检测方法虽然摆脱了检测设备的依赖,但却难以实现定量分析。因此,构建集病原微生物预处理、核酸提取、扩增与检测于一体的等温扩增芯片是未来的发展方向,并且为了发展适用于极端恶劣环境的病原微生物POCT芯片,如何降低对仪器设备的依赖性、增强芯片及反应体系的稳定性、提高检测的特异性与定量性能始终是等温扩增病原微生物检测芯片需要克服的技术瓶颈。相信随着微流控技术与核酸等温扩增检测技术的发展,会出现定量性能更好、仪器依赖度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等温扩增病原微生物检测芯片技术,使病原微生物即时检测向着集成化、快速、高通量、多重筛查的方向发展。

Table 1
表1
表1 不同核酸等温扩增技术比较
Table 1 Summary and comparison of different nucleic acid isothermal amplification methods

扩增方式	酶组份	反应温度(℃)	反应时间(min)	引物条数	检测方式	灵敏度(拷贝)	优点	缺点
RPA	T4 uvsX重组酶、Bsu聚合酶、单链结合蛋白	37~42	10~30	2	荧光探针 侧流层析 电泳	1	低温恒温、 反应迅速	引物设计规则不明、体系复杂、成本高
LAMP	Bst DNA 聚合酶	65	30~60	4~6	双链嵌合染料 比浊法 碱土金属 指示剂 侧流层析 电泳	<10	体系简单、 检测方式多样、产物可 直接裸眼 检测	非特异性 扩增难以 区分
RCA	连接酶 φ29DNA 聚合酶	37	30~240	1	荧光探针	10	可进行信号放大不容易发生污染	操作步骤较多、反应时 间较长
HDA	单链结合蛋白 UvrD解旋酶 Exo-Klenow 聚合酶	37	60~120	2	双链嵌合染料 荧光探针 电泳	1	低温恒温、 高灵敏度	反应时间较长
NASBA	AMV逆转录酶 RNase H T7 RNA聚合酶	41(需65℃ 95℃预热)	<90	2	荧光探针 电泳	1	可直接检测RNA,防止 污染发生	需要预热, 无法真正 做到恒温

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