张宇, 白素英^,, 马跃东北林业大学野生动物资源学院,哈尔滨 150040

Comparative analysis on the transcriptomes of the prostates of muskrats at breeding stage and non-breeding stage

Yu Zhang, Suying Bai^,, Yue MaCollege of Wildlife Rescources, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

第一联系人: 白素英，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：野生动物种质资源保护与分子育种技术。E-mail: baisynefu@qq.com
编委: 吴强
收稿日期:2017-12-20修回日期:2018-04-23网络出版日期:2018-06-20

Received:2017-12-20Revised:2018-04-23Online:2018-06-20
作者简介 About authors
张宇,硕士研究生,专业方向：动物遗传育种与繁殖E-mail:zynefuzx@163.com。





摘要
麝鼠(Ondatra zibethicus L.)是季节性繁殖动物。成年雄性麝鼠在尿生殖孔上方肌肉与背皮之间有一对香腺,在繁殖期能分泌麝鼠香。与其他鼠类相比,麝鼠在繁殖期时前列腺—精囊腺组织极其发达。研究发现,经腹腔注射麝鼠香后,能够明显促进雄性小鼠的前列腺—精囊腺发育,表明两者之间可能存在一定的相关性。本研究利用RNA-seq技术对麝鼠繁殖期和非繁殖期的前列腺样品进行了转录组测序,对差异表达的基因进行GO分析和KEGG通路分析。结果显示,共筛选出1629个显著差异表达基因,涉及多种信号转导和能量代谢相关基因,其中OBP2、Bcl-2家族和肿瘤坏死因子受体超家族成员的差异表达提示麝鼠前列腺发育受多种机制调控,由香腺分泌的麝鼠香可能参与了前列腺的发育调节。
关键词： 麝鼠;RNA-seq;前列腺;繁殖期;非繁殖期

Abstract
The muskrat (Ondatra zibethicus L.) is a seasonal breeding animal. Adult male muskrat has a pair of scent glands between the muscle and skin above the urogenital tract, which secrete muskrat musk during the breeding stage. Compared with other rodents, the muskrat prostates and seminal vesicles are very well developed throughout the breeding stage. Studies have shown that intraperitoneal injection of muskrat musk can readily promote the development of the prostates and seminal vesicles in the male mice, suggesting a tight correlation between musk secretion and the development of the prostates and seminal vesicles in the muskrat. In this study, RNA-seq technology was used to analyze the gene expression patterns were further investigated by gene ontology (GO) analysis and KEGG pathway analysis. The results showed that 1629 genes were significantly and differentially expressed and were involved in a variety of signal transductions and energy metabolism pathways. The differential expression patterns of the OBP2 gene, and members of the Bcl-2 family and tumor necrosis factor receptor superfamily suggest that the prostate development in muskrat is controlled by a variety of molecular mechanisms; and the musk secreted by the muskrat scent glands might participate in the regulation of such developmental processes.
Keywords：muskrat;RNA-seq;prostate;breeding stage;non-breeding stage


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本文引用格式
张宇, 白素英, 马跃. 麝鼠前列腺在繁殖期和非繁殖期转录组差异分析. 遗传[J], 2018, 40(6): 488-495 doi:10.16288/j.yczz.17-409
Yu Zhang, Suying Bai, Yue Ma. Comparative analysis on the transcriptomes of the prostates of muskrats at breeding stage and non-breeding stage. Hereditas(Beijing)[J], 2018, 40(6): 488-495 doi:10.16288/j.yczz.17-409


麝鼠(Ondatra zibethicus L.)又称青根貂、水耗子,原产于北美地区,20世纪50年代末引入中国。成年雄性麝鼠在尿生殖孔上方肌肉与背皮之间有一对香腺,在繁殖期(每年3~10月)时能够分泌麝鼠香^[1]。因此麝鼠的繁殖期也称为泌香期,非繁殖期也称为非泌香期。雄性麝鼠利用麝鼠香吸引雌性麝鼠交配,同时麝鼠香中含有麝香酮^[2],麝香酮是天然麝香中的主要活性成分。在麝科动物种质资源遭到极大破坏的情况下,麝鼠香具有成为天然麝香替代品的巨大潜力。

目前,针对麝鼠的相关研究尚处于初级阶段,大多集中于组织形态学观察、分类与进化、毛皮和麝鼠香的药用价值等方面,而对麝鼠前列腺发育调节的相关研究鲜见报道。华树芳等^[1]研究发现,麝鼠的前列腺—精囊腺发育情况随着繁殖期和非繁殖期发生周期性变化,繁殖期时前列腺—精囊腺非常发达。陈玉山等^[3]研究表明,麝鼠香与麝香相同,都具有雄激素样的作用,经腹腔注射后,能够明显促进雄性小鼠的前列腺—精囊腺发育。由此推测,麝鼠发达的前列腺—精囊腺与雄性麝鼠周期泌香可能存在相关性。

本研究对繁殖期和非繁殖期的麝鼠前列腺组织进行RNA-seq测序分析,通过构建繁殖期和非繁殖期麝鼠前列腺组织的转录图谱,筛选出差异表达基因,探究麝鼠香与前列腺发育的关系,为新基因的进一步挖掘和功能研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

分别于4月末和10月末在黑龙江省哈尔滨市呼兰区麝鼠养殖场购买体况相近的1岁龄成年雄性麝鼠,共计6只。4月末为繁殖期,3只麝鼠标记为A1、A2和A3;10月末为非繁殖期,3只麝鼠标记为B1、B2和B3。将麝鼠保定后,乙醚吸入麻醉,无菌条件下采集左右两侧前列腺背侧叶,组织离体后立即液氮速冻,并迅速转移至-80℃保存。

1.2 RNA提取

分别取麝鼠繁殖期和非繁殖期的前列腺背侧叶组织100 mg,液氮研磨后利用RNA提取试剂盒(Thermo Scientific, USA)提取总RNA。DNase I消除总RNA中潜在DNA污染,利用RNA提取试剂盒中的纯化柱纯化RNA。通过Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA)检测RNA纯度(OD_260/280、OD_260/230),用Bioanalyzer 2100 (Agilent, USA)检测RNA片段完整性。

1.3 文库构建及测序

使用带有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA,通过酶促法使mRNA片段化。利用随机引物反转录合成cDNA。纯化片段大小为150~300 bp的cDNA,并以切割3°突出端和补平5°突出端的方式将cDNA片段两端修复为平末端。将末端修复后的cDNA片段3°端加上A碱基,利用T4 DNA连接酶在DNA两端添加Y型测序接头。测序接头连接后,为满足测序需求,需要对测序文库进行PCR扩增和富集,去除多余的扩增引物和测序接头。使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测,当片段大小符合预期时,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对文库的有效浓度进行精确定量。测序文库质检完成后通过Illumina高通量测序平台进行测序,得到原始数据raw reads。

1.4 麝鼠转录组数据分析

使用Fastx_toolkit软件对raw reads进行质控处理,过滤含接头的reads、N比例过大和低质量碱基数过多的reads,得到clean reads。对clean reads进行分析,主要包括：Trinity转录本拼接;Unigene功能注释;利用皮尔森积矩相关系数分析生物学重复间相关性;应用每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(FPKM)算法对繁殖期(A组)和非繁殖期(B组)转录本进行表达量标准化,以P_value<0.05为标准比较分组间差异表达基因,统计显著差异表达的基因;利用Cluster V3.0软件和Tree View软件构建显著差异表达基因聚类热图,预测未知转录本潜在功能;分别采用GOseq R软件包和ClusterProfiler R软件包对筛选结果进行GO分类注释和KEGG分析等。转录本注释所参照的数据库为NR、NT、KO、Swissprot、Pfam、KOG和GO。显著差异表达的判定标准为：如两者FPKM值大于1且两者比值大于3则认为差异显著;如其中一组FPKM值小于1而另一组FPKM值大于3也认为差异显著。

1.5 实时荧光定量PCR验证

在测序结果中随机选择5个差异表达基因的转录本,利用Primer Premier V 6.0软件设计引物(表1),对RNA-seq结果进行qRT-PCR验证。内参基因为β-actin,内参引物参考文献^[4]。扩增体系为：2× SYBR GREEN I Supermix (BIO-RAD)10 μL,上下游引物各0.2 μL (10 μmol/μL),cDNA模板2 μL,7.6 μL水补足体系。扩增程序：98℃ 30 s;98℃ 10 s,60℃ 1 min,40个循环。利用2^-ΔΔCT法计算表达差异倍数。

Table 1
表1
表1 本文所用的引物信息
Table 1 Primers used in this study

引物名称	引物序列(5°→3°)
OBP2F	GCAACATCATCAACTCTGG
OBP2R	ATGGAAGCAATCACCTAAGT
TNFRSF4F	TCCAGTCCACCACAGTCT
TNFRSF4R	GCCAGCAGAACAGTCAAG
TNFRSF13bF	GTTGAGCCAGCCTACATC
TNFRSF13bR	CTAGACTCCGCACTCTGT
TTPαF	AGTACCTGTTCCAGTGTATC
TTPαR	GGCTTCTTCTGCTGTTCA
GHRF	TCCGAGGTCTCAGGTATG
GHRR	TTATCTCCTTCTGTCCAGTAG
ActbF	AGCCATGTACGTAGCCATCC
ActbR	CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA

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2 结果与分析

2.1 转录本拼装

在麝鼠繁殖期与非繁殖期前列腺组织样品(繁殖期3份,非繁殖期3份)的测序结果中,clean reads均≥90%,测序质量满足分析要求。利用Trinity软件对测序结果进行从头组装,产生301 662条transcripts和282 577条Unigenes。以Trinity拼接得到的转录本作为参考序列(ref),将每个样品的clean reads参照参考序列进行比对映射,统计结果见表2。

Table 2
表2
表2 序列比对情况统计
Table 2 Statistics for mapped sequences

样品名称	总读段数	比对读段数	百分比(%)
A1	47 295 796	31 329 322	66.24
A2	51 176 432	35 534 334	69.43
A3	50 930 182	33 493 652	65.76
B1	50 972 724	33 988 504	66.68
B2	50 292 570	33 601 490	66.81
B3	49 952 898	33 176 016	66.41

A1~A3来源于3只不同的繁殖期雄性麝鼠;B1~B3来源于3只不同的非繁殖期雄性麝鼠。

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2.2 差异表达基因筛选

在麝鼠繁殖期和非繁殖期的前列腺组织中,共鉴定得到130 827条转录本,其中繁殖期(A组)转录本数量为73 810条,非繁殖期(B组)为101 179条,两组共有转录本数量为44 162条(图1)。麝鼠在繁殖期和非繁殖期前列腺组织样品的生物学重复间皮尔森积矩相关系数平方均大于0.95 (图2),因此认定生物学重复满足统计学要求,可用于下游数据分析。利用FPKM算法标准化繁殖期和非繁殖期基因转录水平差异,共筛选出转录水平显著差异的基因1629个。其中A组与B组相比,显著差异表达的基因中表达上调基因共有837个,表达下调基因共有792个。

图1

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图1A组和B组转录本韦恩图

A：繁殖期;B：非繁殖期。
Fig. 1Venn diagram of group A and B transcripts

图2

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图2麝鼠前列腺组织样品间皮尔森相关系数

A1~A3：繁殖期麝鼠前列腺组织样品;B1~B3：非繁殖期麝鼠前列腺组织样品。
Fig. 2The Pearson correlation coefficient between samples of muskrat prostate tissues

2.3 基因分类注释结果

分别在NR、NT、KO、Swissprot、Pfam、KOG和GO 7个数据库中对Unigenes进行注释,得到注释的Unigenes比例分别为10.60%、34.17%、4.71%、7.89%、7.18%和5.48%,其中至少得到一条注释的Unigenes比例为35.32%。Unigenes中共有20 287条转录本在GO数据库中得到了归类注释,其中显著差异表达基因注释涉及生物学过程、细胞组成和分子功能。繁殖期显著高表达基因注释结果显示,与氧化还原酶活性、转运活性和底物特异性跨膜转运蛋白活性相关的基因富集最为明显,同时离子转运条目中也出现显著富集(图3A)。在非繁殖期显著高表达基因中,与膜、细胞进程和信号转导相关的基因出现明显富集(图3B)。

图3

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图3麝鼠繁殖期和非繁殖期前列腺组织中差异表达基因GO富集分析

A：繁殖期高表达基因GO富集;B：非繁殖期高表达基因GO富集。Y轴代表GO条目;X轴代表富集基因数。
Fig. 3GO analysis of differentially expressed genes of muskrat prostate tissues between breeding stage and non-breeding stage



基于KEGG通路分析,发现Unigenes中富集于细胞信号转导和翻译这两个通路的基因比例最大,其中差异表达基因KEGG富集散点图结果显示,大量差异表达基因在多种信号转导通路中被显著富集(图4)。结合GO分析和KEGG分析发现,麝鼠的前列腺组织在繁殖期受到多种机制的调控,涉及大量细胞信号转导,繁殖期显著高表达基因在氧化还原酶活性等条目的显著富集,提示在繁殖期时麝鼠前列腺合成和分泌功能旺盛。

图4

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图4麝鼠繁殖期和非繁殖期前列腺组织中差异表达基因KEGG通路分析

X轴代表富集因子;Y轴代表Pathway名称。气泡大小和颜色分别反映了富集在某通路差异表达基因数量及富集显著性。
Fig. 4KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of muskrat prostate tissues between breeding stage and non-breeding stag



由于生物学重复样品间的重复性良好,因此先将繁殖期与非繁殖期生物学重复分别合并,然后对转录水平存在差异的转录本进行聚类并绘制聚类热图(图5)。根据图5可知,通过表达模式预测未能得到注释的转录本功能。

图5

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图5麝鼠繁殖期和非繁殖期前列腺组织中差异表达基因聚类图

A：繁殖期;B：非繁殖期。
Fig. 5The clustering maps of differentially expressed genes of muskrat prostate tissues between breeding stage and non-breeding stage

2.4 qRT-PCR验证

为验证RNA-seq测序结果的可信度,选择繁殖期和非繁殖期麝鼠前列腺组织中的生长激素受体基因(GHR)、气味结合蛋白2基因(OBP2)、α-生育酚转运蛋白基因(TTPα)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4 基因(TNFRSF4)和肿瘤坏死因子受体超家族成员13b (TNFRSF13b)基因的转录本进行qRT-PCR验证。结果显示：在繁殖期(A组),GHR、OBP2和TTPα基因的转录水平分别约为非繁殖期的2.2倍、163.8倍和1.8倍;在非繁殖期,TNFRSF4和TNFRSF13b基因的转录水平分别约为繁殖期的3.9倍和11倍。GHR、OBP2、TNFRSF4和TNFRSF13b基因转录水平差异情况与RNA-seq结果相符,而TTPα差异倍数明显小于RNA-seq结果(图6,表3),RNA-seq测序正确率为80%。同时对这些基因的cDNA进行扩增测序,测序结果与RNA-seq结果经BLAST比对后相似度为100%。因此认为RNA-seq测序结果可靠。

图6

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图6麝鼠在繁殖期和非繁殖期前列腺组织中5个差异表达基因qRT-PCR验证

A组：繁殖期;B组：非繁殖期。
Fig. 6qRT-PCR verification of five differentially expressed genes between breeding stage and non-breeding stage of muskrat prostatic tissue



Table 3
表3
表3 麝鼠繁殖期和非繁殖期前列腺组织中5个转录本的FPKM值
Table 3 The FPKM value of five transcripts of muskrat prostate tissues between breeding stage and non- breeding stage

基因	转录本编号	样品
		A1	A2	A3	B1	B2	B3
GHR	c122040_g9	53.93	63.99	47.55	20.61	26.33	20.61
TNFRSF13b	c109922_g1	3.01	2.98	3.37	9.29	12.09	10.93
TNFRSF4	c115647_g1	1.02	1.75	1.09	10.38	8.97	10.96
TTPα	c119872_g1	14.07	20.35	15.52	3.2	3.96	4.26
OBP2	c75134_g2	3756.43	4587.44	4355.14	16.61	28.71	34.07

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3 讨 论

本研究构建了麝鼠前列腺组织在繁殖期和非繁殖期的转录组文库,通过RNA-seq测序共筛选出1629个显著差异表达的基因,其中在繁殖期表达上调的基因共有837个,在繁殖期表达下调的基因共有792个。对测序结果进行生物信息学分析,发现麝鼠前列腺组织在繁殖期大量信号转导通路上的相关基因出现明显高表达,如Ras基因超家族中调节囊泡转运的ADP核糖基化因子6基因(ARF6)^[5];在细胞外竞争性的与细胞膜表面Fz受体结合,抑制Wnt信号通路激活的分泌型卷曲相关蛋白5基因(SFRP5)^[6]。同时,参与三羧酸循环的柠檬酸合酶基因(citrate synthase)、线粒体电子传递链的细胞色素b基因(Cytb)和前列腺特异性酸性磷酸酶基因(PAP)等多种氧化还原酶基因和能量代谢相关基因也显著高表达。这些结果提示：在繁殖期,麝鼠的前列腺组织合成和分泌功能旺盛;在非繁殖期,包括死亡受体等在内的多种肿瘤坏死因子受体超家族成员的转录水平有所上升,提示肿瘤坏死因子受体超家族在麝鼠前列腺组织非繁殖期的萎缩过程中可能起到了重要的调节作用。

在麝鼠繁殖期和非繁殖期前列腺组织中,Bcl-2/ Bax基因家族和气味结合蛋白基因(OBPs)转录水平出现了显著差异。Bcl-2/Bax基因家族参与细胞凋亡的调控过程,以Bcl-2基因为代表的一类基因可以抑制细胞的凋亡,而以Bax基因为代表的一类基因可以促进细胞凋亡^[7]。气味结合蛋白(OBPs)是在鼻腔上皮细胞中分离发现的,通过Northern blotting也已经证明其mRNA在鼻腔上皮细胞中表达^[8]。对昆虫的研究结果表明,OBPs功能是结合并运输亲脂性的气味分子通过感器淋巴液到达膜结合受体^[9],且OBPs对于气味分子的结合情况具有选择性^[10],OBPs在昆虫体内很多部位都有表达,故推测OBPs可能具有除嗅觉以外的其他功能^[11]。因此,麝鼠在繁殖期时前列腺组织中OBPs基因的高表达提示其在前列腺发育过程中可能存在重要作用。

袁玲等^[12]研究证明,麝鼠香可以调控Bcl-2/Bax蛋白的表达,从而抑制大鼠心肌细胞的凋亡。杨营等^[13]研究结果显示,雄麝膀胱穿刺所得的尿液样品中含有麝香酮。因此,本文推测麝科动物和麝鼠在繁殖期血液中可能都含有麝香酮。结合RNA-seq测序分析结果,推测麝鼠香除了具有外激素的作用,很可能具有调节自身生理过程的作用,麝鼠香中的麝香酮等亲脂性气味分子随血液循环到达前列腺组织,OBPs在这一过程中起到亲脂性气味分子载体的作用,帮助其与细胞膜表面的受体结合,通过调节Bcl-2/Bax家族基因的表达,从而调节前列腺组织的发育过程。麝鼠在繁殖期前列腺—精囊腺十分发达,这是否与其自身合成分泌的麝鼠香有关还值得进行深入的研究探讨。目前,本实验室已经通过实验证明麝鼠香可以抑制麝鼠前列腺细胞的凋亡(待发表),并将继续进行深入研究来验证以上推测。

本文通过RNA-seq测序,对麝鼠前列腺在繁殖期和非繁殖期的转录组进行差异表达分析,为深 入研究麝鼠前列腺发育机制提供了重要的基础资 料。本研究发现的气味结合蛋白等显著差异表达的基因对前列腺发育的调控作用将成为未来研究的 重点。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献 View Option 原文顺序
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被引期刊影响因子

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目的 对体外细胞分泌与自然分泌的麝鼠香化学成分进行比较.方法 薄层层析和GC-MS联用技术.结果 体外细胞分泌的麝鼠香与自然分泌的麝鼠香均含有环酮类、烷类、酯类、醛类和有机酸类成分.结论 体外细胞分泌的麝鼠香其化学成分与自然分泌的麝鼠香相近,均含有动物香料成分化学基础,呈现出了灭然动物香料的主要特征,为麝鼠香新资源的开发提供了重要参考.
赵伟刚, 陈玉山, 赵蒙, 李晓文, 刘大有 . 体外细胞分泌与自然分泌的麝鼠香化学成分比较研究
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动物为了适应野外环境以及确保其后代能够生存,在长期的进化过程中形成了各自独特的繁殖策略,如季节性繁殖等,季节性繁殖现象是在一年特定的季节出现。麝鼠(Ondatra zibethicus)是季节性繁殖动物,其性活跃期为3月到10月,雄性麝鼠尾部附近的腹部肌肉和表面毛皮之间有一对泌香腺,繁殖期的雄性麝鼠泌香腺能够分泌麝鼠香,从而吸引雌性麝鼠交配,这种麝鼠香是昂贵的中药药材。麝鼠泌香腺分泌麝鼠香的能力与其体内性类固醇激素的水平变化密切相关。细胞色素P450芳香化酶(aromatase cytochrome P450, P450arom)在雌激素合成过程中能够催化雄激素转化为雌激素,发挥重要的生理作用。本研究旨在调查繁殖期和非繁殖期麝鼠泌香腺中雄激素受体(androgen receptor, AR)、雌激素受体(estrogen receptor alpha, ERa和estrogen receptor beta, ER(3)和P450arom在麝鼠泌香腺中的免疫定位、免疫活性以及它们分子表达水平的变化,评价雄激素和雌激素对麝鼠泌香腺的调节作用。在繁殖期和非繁殖期分别采集麝鼠泌香腺、睾丸组织及血液样品,对泌香腺和睾丸分别进行形态学与组织学观察、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分析(Western blotting)以及反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测；对血液样本进行激素测定。形态学结果显示繁殖期麝鼠泌香腺和睾丸的重量和大小都明显高于非繁殖期。组织学结果表明,在繁殖期和非繁殖期麝鼠泌香腺中都能观察到腺细胞、间质细胞、上皮细胞和排香管,其中繁殖期的腺细胞较大,且与非繁殖期相比细胞数量多、密度大。免疫组织化学结果发现繁殖期的AR只在泌香腺的腺细胞中有免疫阳性表达；P450arom在腺细胞和上皮细胞中均有免疫阳性发现；ERa在泌香腺的腺细胞、间质细胞和排香导管的上皮细胞中都有阳性表达；ERβ只在主要的腺细胞与上皮细胞中有较弱免疫阳性；而非繁殖期它们只在腺细胞中有表达。此外,免疫印迹实验结果显示繁殖期的AR、P450arorm ERa(?)口ERp的蛋白表达水平均强于非繁殖期。RT-PCR结果与免疫印记的结果呈现一致,AR、P450arom. ERa和ERβ均在繁殖期有较高的mRNA表达。麝鼠血清的激素检测结果显示繁殖期的睾酮(testosterone, T)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黄体激素(luteinizing hormone, LH)含量均显著高于非繁殖期。上述结果表明,麝鼠泌香腺是雄激素和雌激素的靶器官,雄激素在麝鼠泌香腺既可以通过其受体结合,也可以转化雌激素与雌激素受体结合参与调节麝鼠泌香腺的生理功能。
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ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor，ARF）是Ras基因超家族的成员，它们是大小约20kDa的乌嘌呤核苷酸结合蛋白。ARF最初发现作为霍乱毒素ADP-核糖转移酶的辅助因子共同作用于G蛋白α亚基，促使其ADP-核糖基化。近来人们发现ARF还参与囊泡运输、调节磷脂酶D的活性，在细胞内物质运输和信号转导过程中具有更加重要的生理功能。现就ARF的发现、分类、结构和功能、表达以及生理功能作一综述。
王磊, 宿红艳, 王昌留, 穆春华 . ADP核糖基化因子的结构及其功能机制
.细胞生物学杂志, 2007, 29(5): 675?681.
URL [本文引用: 1]
ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor，ARF）是Ras基因超家族的成员，它们是大小约20kDa的乌嘌呤核苷酸结合蛋白。ARF最初发现作为霍乱毒素ADP-核糖转移酶的辅助因子共同作用于G蛋白α亚基，促使其ADP-核糖基化。近来人们发现ARF还参与囊泡运输、调节磷脂酶D的活性，在细胞内物质运输和信号转导过程中具有更加重要的生理功能。现就ARF的发现、分类、结构和功能、表达以及生理功能作一综述。

[6] Bai B, Wu XM, Guo YM, Zhou WC, Li X, Li XY, Ma RH . Secreted frizzled-related protein 5 plays a role in pathogenesis of metabolic diseases through regulating Wnt signaling pathway
J Lanzhou University ( Medical Sciences ), 2015, 41(1): 14? 17, 22.
[本文引用: 1]

白冰, 吴新民, 郭亚明, 周文策, 李汛, 李兴源, 马荣花 分泌型卷曲相关蛋白5通过调控Wnt信号通路对代谢性疾病发病的影响
. 兰州大学学报(医学版 ), 2015, 41(1): 14? 17, 22.
[本文引用: 1]

[7] Gross A, Mcdonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis
Genes Dev, 1999, 13(15): 1899?18911.
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[8] Pevsner J, Reed RR, Feinstein PG, Snyder SH . Molecular cloning of odorant-binding protein: member of a ligand carrier family
Science, 1988, 241(4863): 336?339.
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[9] Wang B . Mechanism analysis of interaction between olfactory associated protein in Holotrichia oblita (Falderman) [Dissertation]
Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013.
URL [本文引用: 1]
地下害虫是我国农业生产上一类重要的有害物种，具有生活隐蔽，适应性强等特点，是国内外公认的难以防治的害虫。华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann (Coleoptera: Scarabaeidae)属于地下害虫重要类群之一，对农作物、果树以及林木等可以造成重大经济损失。在控制地下害虫的同时也造成了生态环境破坏等多种潜在威胁。昆虫错综复杂的嗅觉系统能够检测和识别环境中不同的挥发性小分子气味物质，这种特征在昆虫寻找寄主、交配、产卵以及逃避行为中起到了至关重要的作用。因此，对昆虫嗅觉感受机理的研究将有助于揭开昆虫感受和识别环境中的气味物质并引起相关行为反应的秘密，有助于开发新型生物制剂来干扰害虫之间的通讯，最终达到控害保益的目的，为生物防治开辟新的途径。本研究所获得的主要结果如下： （1）根据GenBank登录的华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP3和OBP4的序列，设计特异性引物，获得了OBP3和OBP4基因的开放阅读框序列，并将其成功克隆到原核表达载体pET-30a（+）上，为后续气味结合蛋白功能的研究奠定了分子基础。 （2）以冈比亚按蚊AgamOBP20晶体结构为模板对HoblOBP3和HoblOBP4蛋白进行同源建模。从模型上可以看出组成蛋白的α螺旋形成一个结合口袋，蛋白的C端伸入到结合口袋内，与冈比亚按蚊AgamOBP1的结构相似。对HoblOBP3和HoblOBP4以及已知的4种嗅觉相关蛋白HoblCSP1、HoblCSP2、HoblOBP1和HoblOBP2成功地进行了原核表达以及蛋白纯化。竞争结合实验分析了华北大黑鳃金龟OBP3和OBP4对植物绿叶气味以及已经鉴定的金龟子性信息素成分等42种气味分子的结合特征，研究发现HoblOBP4展现出了非常广泛的结合亲和性，尤其与6个碳的植物绿叶气味结合亲和性较高，并且能够结合L-异亮氨酸甲酯等金龟子性信息素成分。HoblOBP3只能够专一性的结合α-紫罗兰酮和-紫罗兰酮，从而显示出严谨的分子筛作用。除此之外，我们发现配体化合物官能团的种类、数量和位置，碳链的长短，碳链的开环与闭环结构，以及旋光异构等差异对蛋白结合亲和性的影响非常大。利用荧光结合实验对目前已知的6种华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白之间的相互关系以及是否存在二聚体进行了探讨，我们推测HoblOBP2能够分别和HoblOBP1、HoblOBP4形成异源二聚体。 （3）本研究根据免疫组织化学法利用胶体金双标记技术在亚细胞水平上检测了二元蛋白混合物在华北大黑鳃金龟触角感器中的共定位情况。实验结果显示，HoblOBP1/HoblOBP2和HoblOBP2/HoblOBP4均在华北大黑鳃金龟板型感器和锥形感器中共表达，这一实验结果是对OBPs之间能够形成二聚体以感受外界气味分子以及信息素这一理论的验证和支持，为疏水性通道理论提供了强有力的证据。 （4）本研究利用DUALsystem Biotech公司文库构建试剂盒，构建了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库，并将其克隆到酵母双杂交系统的表达载体pPR3-N上，为下一步利用酵母双杂交技术研究蛋白互作搭建了技术平台。构建好的均一化cDNA文库经质量检测发现，原始文库的库容量为1.1×106，平均插入片段大小约为1.2kb，达到了高质量文库的标准，保证了文库的覆盖性。 （5）本实验利用DUALsystem Biotech公司DUALhunter starter kits酵母双杂交筛选试剂盒，构建了华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP1和OBP2诱饵载体，筛选了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库，经鉴定以及在GenBank中进行Blast比对分析，以OBP1为诱饵鉴定出6个互作物，以OBP2为诱饵鉴定出8个互作物。通过-半乳糖苷酶活性检测，以OBP1为诱饵，最终确定的阳性互作物为receptor for activated protein kinase C-like，以OBP2为诱饵最终确定的阳性互作物为proclotting enzyme，我们推测这两种蛋白可能是华北大黑鳃金龟在嗅觉识别过程中的相关蛋白。
王冰 . 华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白互作机制研究[学位论文]
中国农业科学院, 2013.
URL [本文引用: 1]
地下害虫是我国农业生产上一类重要的有害物种，具有生活隐蔽，适应性强等特点，是国内外公认的难以防治的害虫。华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann (Coleoptera: Scarabaeidae)属于地下害虫重要类群之一，对农作物、果树以及林木等可以造成重大经济损失。在控制地下害虫的同时也造成了生态环境破坏等多种潜在威胁。昆虫错综复杂的嗅觉系统能够检测和识别环境中不同的挥发性小分子气味物质，这种特征在昆虫寻找寄主、交配、产卵以及逃避行为中起到了至关重要的作用。因此，对昆虫嗅觉感受机理的研究将有助于揭开昆虫感受和识别环境中的气味物质并引起相关行为反应的秘密，有助于开发新型生物制剂来干扰害虫之间的通讯，最终达到控害保益的目的，为生物防治开辟新的途径。本研究所获得的主要结果如下： （1）根据GenBank登录的华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP3和OBP4的序列，设计特异性引物，获得了OBP3和OBP4基因的开放阅读框序列，并将其成功克隆到原核表达载体pET-30a（+）上，为后续气味结合蛋白功能的研究奠定了分子基础。 （2）以冈比亚按蚊AgamOBP20晶体结构为模板对HoblOBP3和HoblOBP4蛋白进行同源建模。从模型上可以看出组成蛋白的α螺旋形成一个结合口袋，蛋白的C端伸入到结合口袋内，与冈比亚按蚊AgamOBP1的结构相似。对HoblOBP3和HoblOBP4以及已知的4种嗅觉相关蛋白HoblCSP1、HoblCSP2、HoblOBP1和HoblOBP2成功地进行了原核表达以及蛋白纯化。竞争结合实验分析了华北大黑鳃金龟OBP3和OBP4对植物绿叶气味以及已经鉴定的金龟子性信息素成分等42种气味分子的结合特征，研究发现HoblOBP4展现出了非常广泛的结合亲和性，尤其与6个碳的植物绿叶气味结合亲和性较高，并且能够结合L-异亮氨酸甲酯等金龟子性信息素成分。HoblOBP3只能够专一性的结合α-紫罗兰酮和-紫罗兰酮，从而显示出严谨的分子筛作用。除此之外，我们发现配体化合物官能团的种类、数量和位置，碳链的长短，碳链的开环与闭环结构，以及旋光异构等差异对蛋白结合亲和性的影响非常大。利用荧光结合实验对目前已知的6种华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白之间的相互关系以及是否存在二聚体进行了探讨，我们推测HoblOBP2能够分别和HoblOBP1、HoblOBP4形成异源二聚体。 （3）本研究根据免疫组织化学法利用胶体金双标记技术在亚细胞水平上检测了二元蛋白混合物在华北大黑鳃金龟触角感器中的共定位情况。实验结果显示，HoblOBP1/HoblOBP2和HoblOBP2/HoblOBP4均在华北大黑鳃金龟板型感器和锥形感器中共表达，这一实验结果是对OBPs之间能够形成二聚体以感受外界气味分子以及信息素这一理论的验证和支持，为疏水性通道理论提供了强有力的证据。 （4）本研究利用DUALsystem Biotech公司文库构建试剂盒，构建了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库，并将其克隆到酵母双杂交系统的表达载体pPR3-N上，为下一步利用酵母双杂交技术研究蛋白互作搭建了技术平台。构建好的均一化cDNA文库经质量检测发现，原始文库的库容量为1.1×106，平均插入片段大小约为1.2kb，达到了高质量文库的标准，保证了文库的覆盖性。 （5）本实验利用DUALsystem Biotech公司DUALhunter starter kits酵母双杂交筛选试剂盒，构建了华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP1和OBP2诱饵载体，筛选了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库，经鉴定以及在GenBank中进行Blast比对分析，以OBP1为诱饵鉴定出6个互作物，以OBP2为诱饵鉴定出8个互作物。通过-半乳糖苷酶活性检测，以OBP1为诱饵，最终确定的阳性互作物为receptor for activated protein kinase C-like，以OBP2为诱饵最终确定的阳性互作物为proclotting enzyme，我们推测这两种蛋白可能是华北大黑鳃金龟在嗅觉识别过程中的相关蛋白。

[10] Vogt RG, Prestwich GD,Lerner MR . Odorant-binding protein subfamilies associate with distinct classes of olfactory receptor neurons in insects
J Neurobiol, 1991, 22(1): 74?84.
URLPMID:2010751 [本文引用: 1]
The olfactory receptors of terrestrial animals exist in an aqueous environment, yet detect odorants that are primarily hydrophobic. The aqueous solubility of hydrophobic odorants is thought to be greatly enhanced via odorant binding proteins (OBP) which exist in the extracellular fluid surrounding the odorant receptors. We have isolated and partially sequenced 14 candidate OBPs from six insect (moth) species. All 14 represent a single homologous family based on conserved sequence domains. The 14 proteins can be divided into three subfamilies based on differences in tissue specific expression and similarities in amino acid sequences. All 14 proteins are specifically expressed in antennal olfactory tissue. Subfamily I represents previously described pheromone binding proteins (PBP), which are malespecific, associate with pheromone-sensitive neurons, and are highly variable in their sequences when compared among species. Subfamilies II and III are expressed in both male and female antennae, appear to associate with general-odorant-sensitive neurons, and are highly conserved when compared among species. The properties of the subfamily II and III proteins suggest these are general-odorant binding proteins (GOBP). The properties of the respective insect OBP subfamilies suggest that they have different odorant binding specificities. The association of different insect OBP subfamilies with distinct classes of olfactory neurons having different odorant specificities suggests that OBPs can act as selective signal filters, peripheral to the actual receptor proteins.

[11] Zhou JJ . Chapter Ten - Odorant-Binding Proteins in Insects
Vitamins & Hormones, 2010, 83: 241?272.
URL [本文引用: 1]
Our understanding of the molecular and biochemical mechanisms that mediate chemoreception in has been greatly improved after the discovery of olfactory and receptor . However, after 50 years of the discovery of first insect sex pheromone from the , it is still unclear how hydrophobic compounds reach the of sensory neurons in vivo across aqueous space and interact with the sensory receptors. The presence of soluble in high concentration in the lymph of chemosensilla still poses unanswered questions. More than two decades after their discovery and despite the wealth of structural and biochemical information available, the physiological function of () is not well understood. Here, I review the structural properties of different subclasses of insect and their to pheromones and other small ligands. Finally, I discuss current ideas and models on the role of such in insect chemoreception.

[12] Yuan L, Nan Y, Wu Y . Muskrat musk regulates the expression of Bcl-2/Bax and inhibited apoptosis of myocardial ischemia in rats
Journal of Ningxia Medical University, 2010, 32(1): 1?3, 11.
URL [本文引用: 1]
目的研究麝鼠香 (Muskrat musk,Mrm)对大鼠心肌缺血(myocardial ischemia,MI)模型心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。方法通过结扎大鼠左冠状动脉前降支复制大鼠MI模型。实验动物随机分为6 组:假手术组、模型组、阳性对照组、麝鼠香高、中、低(600、300、150mg.kg-1.d-1剂量组)。采用原位末端标记(TUNEL)法进行细 胞凋亡指数检测;免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与模型组比较,麝鼠香高、中剂量组心肌细胞凋亡指数明显降低,Bcl-2蛋白表达水平显 著升高,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值升高,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论麝鼠香通过调控Bcl-2/Bax蛋 白表达,能有效抑制心肌细胞凋亡的发生,对缺血心肌提供保护作用。
袁玲, 南一, 吴洋 . 麝鼠香调控Bcl-2/Bax蛋白表达抑制缺血性大鼠心肌细胞凋亡
宁夏医科大学学报, 2010, 32(1): 1?3, 11, 插2.
URL [本文引用: 1]
目的研究麝鼠香 (Muskrat musk,Mrm)对大鼠心肌缺血(myocardial ischemia,MI)模型心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。方法通过结扎大鼠左冠状动脉前降支复制大鼠MI模型。实验动物随机分为6 组:假手术组、模型组、阳性对照组、麝鼠香高、中、低(600、300、150mg.kg-1.d-1剂量组)。采用原位末端标记(TUNEL)法进行细 胞凋亡指数检测;免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与模型组比较,麝鼠香高、中剂量组心肌细胞凋亡指数明显降低,Bcl-2蛋白表达水平显 著升高,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值升高,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论麝鼠香通过调控Bcl-2/Bax蛋 白表达,能有效抑制心肌细胞凋亡的发生,对缺血心肌提供保护作用。

[13] Yang Y, Cai YH . Study on the new ways of promoting musk yield
Sichuan Animal & Veterinary Sciences, 2011, 38(9): 23?25.
[本文引用: 1]

杨营, 蔡永华 . 促进麝香增产的新途径研究
四川畜牧兽医, 2011, 38(9): 23?25.
[本文引用: 1]