孟君仁^,, 牛良, 邓丽, 潘磊, 鲁振华, 崔国朝, 王志强^,, 曾文芳^,中国农业科学院郑州果树研究所/国家桃葡萄改良中心/农业部果树育种技术重点实验室,郑州 450009

Screening and Sequence Analysis of BAC Clone Contained PG Gene Controlling Clingstone/Freestone Characteristic of Peach

MENG JunRen^,, NIU Liang, DENG Li, PAN Lei, LU ZhenHua, CUI GuoChao, WANG ZhiQiang^,, ZENG WenFang^,Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Peach and Grape Improvement Center/Key Laboratory of Fruit Breeding Technology of Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009

通讯作者: 王志强,E-mail： wangzhiqiang@caas.cn。曾文芳,E-mail： zengwenfang@caas.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-12-3接受日期:2021-02-26

基金资助:

国家重点研发计划(2019YFD1000200) 国家自然科学基金(31872085) 河南省科技攻关项目(202102110037)

Received:2020-12-3Accepted:2021-02-26
作者简介 About authors
孟君仁,E-mail： 82101186035@caas.cn。










摘要
【目的】控制桃果实粘/离核性状的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase,PG）基因存在串联重复和大片段的缺失。本研究对粘核桃所处的F-M基因座序列特征进行分析,为开发相关分子标记提供依据。【方法】本研究利用构建的粘核桃单株‘87-7-1’基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库,通过PCR筛选出含F-M基因座的阳性克隆,利用单分子纳米孔技术进行全长测序,并对BAC克隆中的插入片段进行基因注释、序列比对和生物信息学分析。【结果】利用已有桃品种的基因组重测序数据设计PCR引物,以BAC文库为模板,扩增F-M基因座上/下游稳定共有的序列,获得了扩增产物上/下游条带均为阳性的目标单克隆46-B-10。全长测序结果表明,BAC克隆的插入片段全长为111 612 bp,GC含量为37.03%。利用基因同源共线性方法对Prunus_persica_v2.0桃参考基因组和BAC克隆之间的同源信息进行比对分析,确定了同源区域。而与已知的桃参考基因组（测序品种为‘Lovell’,离核）序列进行比对,发现只有5个基因（Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262500）序列能比对到该单克隆全长的区域,而‘87-7-1’在相应位置缺失了4个基因共34 kb,其中包括控制桃粘/离核的EndoPGF（Prupe.4G262200）。【结论】与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,粘核桃单株‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM,本研究明确了粘核桃F-M基因座的结构变异情况,为粘/离核性状分子标记的开发奠定了基础。
关键词： 桃;粘/离核;PG基因;BAC文库

Abstract
【Objective】Tandem repeats and large segment deletions of Polygalacturonase (PG) gene was related to the clingstone/freestone characteristic of peach (Prunus persica) fruit. In this study, the sequence character of F-M locus of clingstone peach was analyzed to provide a basis for the development of related molecular markers. 【Method】With a Bacterial Artificial Chromosome library of clingstone peach 87-7-1 constructed, the positive BAC clone contained F-M locus was screened from the BAC library by PCR analysis. The screened BAC clone was sequenced by single-molecule nanopore technology. Gene annotation and sequence alignment were performed by bioinformatics. 【Result】PCR primers were designed based on re-sequencing data of existing peach varieties, and PCR reactions were performed with all the BAC library clones. Amplification products of the sequences in upstream/downstream of F-M loci were corrected, and then the target clone 46-B-10 was obtained. Full-length sequencing showed that the fragment with the length of 111612 bp and GC content of 37.03% was inserted between upstream and downstream primers. The homologous region of 46-B-10 was determined by sequence alignment with the reference genome Prunus_persica_v2.0. Five genes (Prupe.4G261700, Prupe.4G261800, Prupe.4G261900, Prupe.4G262000, and Prupe.4G262500) in F-M locus were found in the BAC clone 46-B-10. In comparison, 87-7-1 with 34 kb sequence including four genes was discarded, and one of them was EndoPGF, which controlled peach freestone and was reported previously. 【Conclusion】Compared with the reference genome freestone variety ‘Lovell’, there was only EndoPGM (Prupe.4G261900) in F-M locus of clingstone peach individual 87-7-1, while EndoPGF (Prupe.4G262200) was discarded. In this study, the structural variation of F-M locus in clingstone peach was determined, which has laid an important foundation for the development of molecular markers for clingstone/freestone trait in peach.
Keywords：peach;clingstone/freestone;PG gene;BAC library


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本文引用格式
孟君仁, 牛良, 邓丽, 潘磊, 鲁振华, 崔国朝, 王志强, 曾文芳. 控制桃粘/离核PG基因的BAC克隆筛选与序列分析. 中国农业科学, 2021, 54(20): 4396-4404 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.013
MENG JunRen, NIU Liang, DENG Li, PAN Lei, LU ZhenHua, CUI GuoChao, WANG ZhiQiang, ZENG WenFang. Screening and Sequence Analysis of BAC Clone Contained PG Gene Controlling Clingstone/Freestone Characteristic of Peach. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(20): 4396-4404 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.013


开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

0 引言

【研究意义】桃[Prunus persica( L.) Batsch]起源于中国,其果实味美多汁,营养丰富,深受人们喜爱。F-M基因座复杂的结构变异决定了离核溶质、粘核溶质和粘核不溶质3种果实肉质类型的形成。明晰F-M基因座的序列特征,有助于进一步解析不同果实肉质的形成机制,为相关性状的分子标记开发奠定基础。【前人研究进展】桃是典型的呼吸跃变型果实,根据成熟软化的特点可以分为溶质和不溶质等^[1]。溶质桃是栽培桃的主要类型,常用于鲜食;不溶质桃成熟时具有韧性,多用于加工,即“罐桃”^[2]。桃果实溶质/不溶质（M/m）是单基因控制的质量性状,其中溶质为显性^[3]。研究发现,内切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-PG）表达和活性的增加是溶质桃果实成熟迅速软化的关键因素,而不溶质桃由于缺乏Endo-PG活性,细胞结构未发生明显改变^[4,5]。桃果实粘/离核（f/F）也是单基因控制的质量性状,其中离核为显性^[6]。桃溶质/不溶质与粘/离核性状由LG4上的F-M基因座^[7,8,9]控制,PEACE等^[10]提出F-M基因座存在至少2个拷贝的Endo-PG基因,其一控制溶质/不溶质性状,另一个控制粘/离核,由于Endo-PG基因簇的缺失导致了粘核和不溶质性状。GU等^[11]也发现该F-M基因座存在着缺失,并提出桃的溶质/不溶质和粘/离核表型主要是由于存在/缺失两种功能不同的endoPG基因—EndoPGM和EndoPGF;同时存在表现为离核溶质,缺失EndoPGF为粘核溶质,两者都缺失为粘核不溶质,而EndoPGF具有溶质性的多效性,导致未出现离核不溶质类型。尽管对F-M基因座在遗传和序列变异上取得了一些进展,然而其序列特征由于多拷贝PG基因以及大片段缺失等因素仍未得到很好的阐释。构建细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库是获取大片段DNA序列,研究基因组功能和克隆功能基因的有效工具^[12]。BAC文库具有插入片段大、遗传稳定性好、嵌合率低等优点^[13,14]。现有的一代、二代测序,往往涉及到将所测片段打断、拼接再比对参考基因组重新组装的过程,对于有大片段缺失的基因并不能十分准确的获得序列。因此,在如今3代测序飞速发展的情况下,BAC文库对于基因组序列、功能分析仍具有重要意义。【本研究切入点】虽然前人研究已明确F-M基因座存在缺失,但并未真正获得缺失序列信息;此外,与传统的测序手段相比,3代测序能整体上有效地反映序列变异情况,更加准确。【拟解决的关键问题】因此,本研究利用粘核溶质型桃品种‘87-7-1’的BAC文库,采用PCR法筛选含F-M基因座的克隆,通过3代单分子纳米孔测序技术,对桃F-M基因座的序列进行分析,明晰F-M基因座序列变异特征。

1 材料与方法

试验于2019年在中国农业科学院郑州果树研究所进行。

1.1 材料

BAC文库构建的试验材料为粘核溶质桃单株‘87-7-1’^[15],7月下旬成熟,来自桃育种圃。BAC文库由华中农业大学罗美中实验室提供,笔者实验室保存。BAC文库构建所使用的菌株是E. coli DH10B（Invitrogen）;BAC文库构建所使用的载体是由SHI等^[16]改造的pIndigoBAC536-S载体,BAC文库的平均插入片段大小约为110 kb,克隆总数为23 040个,基因组覆盖率约为11X,保存于60个384孔板中。

1.2 引物设计

根据已有粘核桃品种‘黄金蜜桃3号’‘NJC83’‘中桃5号’和‘中油15号’,离核桃品种‘春雪’等50×基因组重测序数据,利用igv软件,在F-M基因座上、下游寻找测序质量高、稳定的共有片段,然后利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。同时在GDR网站（https://www.rosaceae.org/）,与桃参考基因组数据进行BLAST比对,检测引物的特异性以及扩增片段的特异性。经筛选,最终得到F-M基因座上、下游区域各一对特异性引物,由河南郑州尚亚生物技术有限公司合成,序列见表1。采用Vazyme LAmp® DNA Polymerase（南京诺唯赞生物科技股份有限公司,P302）进行PCR扩增,反应总体系为50 μL：10×Vazyme LAmp^® Buffer (Mg²⁺ free) 5 μL、25 mmol∙L^-1 MgCl₂ 3 μL、dNTP Mix (10 mmol∙L^-1 each) 1 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、Vazyme LAmp^® DNA Polymerase 0.5 μL、ddH₂O 37.5 μL。PCR反应循环程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,34个循环;72℃延伸1 min,4℃保持。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

Table 1
表1
表1F-M基因座上下游引物及扩增序列
Table 1Upstream and downstream primers of F-M loci and amplification sequences

位置 Location	引物名称 Primer code	引物序列 Primer sequence	片段大小 Size ( bp)	扩增序列 Amplification sequence
F-M基因座上游 Upstream of F-M	8771-PG F1	CACTAATGCTATGCGATTGTGA	178	CACTAATGCTATGCGATTGTGATCTTAACATGTAAAAATTTGCGATTAATACCTATTACAGAGAAGACTCTGCTAGATTATTGATAGATCCCTCCTTGTTTGTCCAAGTAGGGATTAAGGATAGTTTAAGTAGTGGGCTCACTTCTCTCGAGTTTATCCAAACGGAAATCTGAGAGTG
	8771-PG R1	CACTCTCAGATTTCCGTTTGG
F-M基因座下游 Downstream of F-M	8771-PG F2	TCCAGCTTAAGGCATCCACT	207	TCCAGCTTAAGGCATCCACTTGTTTCGGTTATGCAAGTGGATTAAGAATTGGATTGATTGTTGATGATGATATCACAACAAAAAAATTAGGCATGTACCATTATTCCAAGACTTCAGTTGGCCAAAGTCTCTTCCATGTGGAAATCTCTTCCTTGGTTCTAAGCTTCCTGATGCCCCCGTAAAACCCATCTGCCTCATTTCCCTCCT
	8771-PG R2	AGGAGGGAAATGAGGCAGAT

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根据得到的BAC克隆序列及参考基因组序列,在Prupe.4G262000倒数第二个外显子往后设计特异引物,同时BLAST检测引物的特异性,筛选到一对引物,在离核桃中扩增出特异片段,在粘核桃不能扩增到该片段。引物序列为F：ATGTCTTCATTTCAGCAGCA和R：CAAGGTGTCTGTGTGGGGTC,扩增的片段大小为721 bp。利用粘/离核桃单株各10份进行PCR验证。

1.3 含F-M基因座BAC单克隆的筛选及鉴定

以扩增的上、下游特异性片段为饵,筛选BAC文库中F-M基因上、下游均为阳性的克隆,即包含F-M基因座的克隆。首先,将BAC文库中一板384孔板的所有菌混为一个一级池,共得到60个一级混合池。提取60个一级混合池基因组DNA。以一级混合池质粒为模板,进行PCR扩增,初步确定阳性克隆所对应的一级混合池编号。

再建立相应编号的二级混合池,将一级混合池384孔板的每一行、每一列分别混合成二级池的行池和列池,共得到40个二级混合池。每块384板有16个行池和24个列池。对行池和列池进行二次PCR筛选,最终确定F-M基因座阳性克隆在BAC文库中的位置,并对PCR扩增产物测序验证,单克隆保菌贮存。

1.4 质粒提取

将阳性克隆所在的384孔板从-80℃冰箱取出,水平置于37℃培养箱融化,在超净台下取1 μL菌液划线于含氯霉素的LB培养基平板,倒置于37℃培养箱中过夜。用质粒大片段大量提取试剂盒QIAGEN- Large-Construct Kit,提取BAC阳性克隆的质粒DNA,方法见说明书。加入100 μL TE Buffer（pH 7.0）洗脱液溶解,1%琼脂糖凝胶电泳检测质量,Nanodrop紫外分光光度计检测浓度,-20℃保存备用。

1.5 单分子纳米孔测序及序列分析

含F-M基因座的BAC单克隆在深圳华大基因科技服务有限公司进行全长测序。测序得到的BAC序列通过NCBI网站与桃参考基因组进行BLAST比对分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM =blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）。从phytozome网站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）下载桃PG基因的DNA序列（Prunus persica v2.1）和登录号。

提取Prunus_persica_v2.0参考基因组^[17]中的所有基因信息,利用GeMoMa^[18]软件做基于同源的基因注释,获取基因结构的gff文件。基于BLAST比对鉴定共线性区块,然后利用TBtools^[19]进行可视化,得到共线性比对图。

2 结果

2.1 粘/离核表型分析

以中国农业科学院郑州果树研究所桃育种圃内7月下旬成熟的‘87-7-1’和7月上旬成熟的‘中桃8号’高接树为对象,在果实成熟时,观察果肉与核的粘附程度。其中,‘87-7-1’为粘核桃,‘中桃8号’为离核桃（图1）。

图1

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图1桃粘/离核性状表型

A：87-7-1,粘核;B：中桃8号,离核
Fig. 1Phenotype of clingstone/freestone trait in peach

A: 87-7-1, Clingstone; B: Zhongtao8, Freestone

2.2 PCR筛选与鉴定含F-M基因座的BAC克隆

PCR筛选BAC文库流程见图2。共构建60个一级混合池,进行第一轮PCR筛选,发现BAC文库编号46的质粒DNA上、下游扩增结果均为阳性;对PCR产物测序,确认为PG基因上、下游扩增序列,上游扩增片段大小为178 bp,下游为207 bp。对该阳性一级混合池的二级混合池进行第二轮PCR筛选,进一步定位到BAC文库46号质粒的第2行、第10列克隆（即46-B-10）。对46-B前14克隆进行PCR鉴定,验证了编号46-B-10为唯一的阳性单克隆,1%琼脂糖凝胶检测结果见图3-A,对PCR产物进行测序,与目标序列符合率为100%。提取BAC克隆46-B-10质粒,1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3-B。

图2

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图2PCR法筛BAC文库流程示意图

Fig. 2Schematic diagram of the BAC library was screened by PCR

图3

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图3PCR验证阳性克隆和质粒提取的琼脂糖检测

A：M：DL 2000 DNA Marker;泳道1—14：以BAC克隆46-B-1-14为模板,阳性对照以粘核溶质桃‘黄金蜜桃3号’为模板,阴性对照以灭菌水为模板。B：M：TSINGKE 1.5 kb Marker,BAC：提取的质粒
Fig. 3Agarose assays for PCR confirmed positive clones and the BAC clone plasmid

A: M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1-14: BAC clones 46-B-1-14 as template, and the positive control uses the clingstone with melting flesh peach Huangjinmi 3 as the template, while the negative control uses sterilized water as the template. B: M: TSINGKE 1.5 kb Marker, BAC: Plasmid extracted

2.3 阳性单克隆全序列测序与共线性比对分析

对阳性单克隆46-B-10进行全长测序,结果表明,46-B-10质粒全长为120 132 bp;其中,插入片段长度为111 612 bp,GC含量为37.03%。

基于方法1.5,得到共线性分析的结果（图4）。结果表明,BAC克隆序列与参考基因组的Prupe.4G261400、Prupe.4G261700、Prupe.4G261900、Prupe.4G262100、Prupe.4G262200、Prupe.4G262400、Prupe.4G262500、Prupe.4G262600等基因存在同源共线性。经过Phytozome注释结果显示,这些基因编码的蛋白主要包括多聚半乳糖醛酸酶、烯丙醇脱氢酶、依赖NADPH的烯醛/酮氧化还原酶、F-box蛋白等。

图4

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图4BAC克隆和参考基因组PG基因序列比对

Fig. 4Sequence alignment of PGs of BAC clone 46-B-10 and reference genome

2.4 阳性单克隆插入序列BLAST比对分析

对阳性单克隆上、下游引物之间的序列进行分析,覆盖长度为42 147 bp,而参考基因组覆盖的序列长度为76 235 bp。参考基因组分析,该区域包含9个基因（Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262100、Prupe.4G262200、Prupe.4G262300、Prupe.4G262400和Prupe.4G262500）,包含分别控制溶质/不溶质和粘/离核性状的EndoPGF（Prupe.4G262200）和EndoPGM（Prupe.4G261900） ^[19]。但是,46-B-10中该区域缺失了34 kb片段。基于NCBI网站BLAST分析,与已知的桃参考基因组（Prunus_persica_NCBIv2）PG基因序列进行比对,结果显示只有5个基因（Prupe.4G261700、Prupe. 4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe. 4G262500）的序列与该单克隆对应序列的比对相似度达到80%以上（图5）,证明粘核桃单株‘87-7-1’缺失EndoPGF（Prupe.4G262200）等4个基因。进一步利用ORF Finder工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）对BAC基因序列进行编码氨基酸预测,并通过DNAMAN 8.0软件与参考基因组的氨基酸序列进行比对（表2）。其中,BAC序列与EndoPGM（Prupe.4G261900）氨基酸相似度达99.75%,具有很高的同源性。但是,在BAC序列中并未找到Prupe.4G262000基因的最后一个外显子,BAC克隆的F-M基因座从此处开始出现大片段的缺失。

图5

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图5阳性克隆序列与参考基因组同源共线性比对

箭头表示所设计的上下游引物,虚线表示缺失部分
Fig. 5Collinearity alignment of BAC clone and reference genome sequence

The arrows indicate the location of upstream and downstream primers, and the dotted lines indicate the missing part


Table 2
表2
表2BAC克隆46-B-10和参考基因组PG基因序列比对
Table 2Sequence alignment of PGs of BAC clone 46-B-10 and reference genome

基因ID Gene ID	参考基因组基因序列长度 Gene length of reference sequence (bp)	BAC克隆基因序列长度 Gene length of BAC clone (bp)	基因序列相似度 Similarity of gene sequences (%)	编码氨基酸序列相似度 Similarity of coding amino acid sequences (%)
Prupe.4G261700	1519	1545	94.24	99.49
Prupe.4G261800	1771	1751	98.52	98.98
Prupe.4G261900	3262	3225	96.36	99.75
Prupe.4G262000	1516	1552	83.30	79.22
Prupe.4G262100	2380	/	/	/
Prupe.4G262200	2660	/	/	/
Prupe.4G262300	2544	/	/	/
Prupe.4G262400	3648	/	/	/
Prupe.4G262500	4553	4547	99.08	99.75

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2.5 粘离核桃PCR验证

利用筛选到的特异引物,对已有粘离核桃各10个单株进行PCR验证,1%琼脂糖检测结果见图6。在表型为离核桃中均能扩增出目标片段,但在表型为粘核桃的单株中,仅‘中油桃4号’能扩增出目标条带。在已构建的遗传群体“96-5-1×中油桃4号”中发现后代有离核桃,且占一定比例。亲本‘96-5-1’为中晚熟粘核桃,7月下旬成熟;‘中油桃4号’为早熟粘核桃,6月中旬成熟。因此,推测‘中油桃4号’是遗传学意义即基因型为离核的品种。表明该引物对能明显区分开遗传学意义的离核桃与粘核桃。

图6

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图6PCR验证离/粘核桃

M：DL 2000 DNA Marker。1—10：以离核桃为模板,分别为春雪、枣油桃、中油22号、中桃6号、中桃24号、新中南12-14、新中南12-36、新中南12-44、新中南12-54、新中南13-10;11—20：以粘核桃为模板,分别为新中南12-55、新中南12-59、新中南12-60、新中南13-4、新中南13-14、87-7-1、中油8号、中油13号、中桃5号、中油桃4号;21：灭菌水
Fig. 6PCR confirmed positive clones freestone/clingstone peach

M: DL 2000 DNA Marker. 1-10: Freestone peach. Chunxue, Zaoyoutao, Zhongyou 22, Zhongtao 6, Xinzhongnan12-14, Xinzhongnan12-36, Xinzhongnan12-44, Xinzhongnan12-54, Xinzhongnan13-10, respectively; 11-20: Clingstone peach. Xinzhongnan12-55, Xinzhongnan12-59, Xinzhongnan12-60, Xinzhongnan13-4, Xinzhongnan13-14, 87-7-1, Zhongyou 8, Zhongyou 13, Zhongtao 5, Zhongyoutao 4, respectively; 21: The negative control uses sterilized water as the template

3 讨论

传统的一、二代测序需要将目的片段打断后再拼接,缺点是对于串联相似的序列不能十分准确地获得待测片段^[20,21]。GU等^[11]利用参考基因组设计了37对引物,扩增F-M基因座,发现粘核溶质型桃品种存在12.8 kb的缺失,其中包括EndoPGF（Prupe.4G262200）和NADH1（Prupe.4G262300）。PCR筛选BAC文库是鉴定缺失基因序列的一种有效方法^[22,23,24],本研究通过BAC克隆筛选并结合3代测序的方法,发现该区域实际丢失了34 kb的片段,从Prupe.4G262000基因的最后一个外显子到Prupe.4G262400基因区域。该结果比分段拼接的结果更加可靠,为后续F-M基因座相关分子标记的开发提供了有效数据。因此,BAC文库筛选结合3代测序对探究大段重复拷贝具有一定优势,能够更加准确地反映序列特征^[25,26]。

目前,围绕桃果实粘/离核已有很多研究^[27],同时,对于控制粘/离核的基因EndoPGF（Prupe.4G262200）也已经有了比较清晰的认识^[10-11,28]。然而,目前关于粘/离核的分子标记仍旧没能得到很好的应用^[8,29-30]。笔者认为原因可能主要有两点：（1）粘/离核表型受成熟期影响导致不易判断,实际上将核与果肉的粘离度分为离核、粘核和半粘核。半粘核品种一般被认为是遗传上的离核,生理上的粘核^[31,32]。控制溶质/不溶质的EndoPGM受乙烯调控,而EndoPGF主要受果实发育的影响,因此很多早熟桃品种果实已经变软,但还没来得及离核,会被误认为是粘核品种,如早熟离核桃品种比较少见。（2）在基因型上,由于粘/离核和溶质/不溶质定位F-M基因座,该基因座包含多拷贝PG,且控制粘/离核和溶质/不溶质的PG氨基酸高度相似,导致只有粘核溶质桃、粘核不溶质桃和离核溶质桃3种类型存在,离核不溶质类型目前尚未有报道。不溶质品种相比离核溶质型品种存在更大片段的缺失,可以算作粘/离核的另一种突变类型,同时,笔者通过基因组重测序结果发现不溶质品种可能不仅存在EndoPGF整段缺失,同时也存在片段缺失的情况。因此,简单的分子标记也很难将桃果实的粘/离核性状完全分离。

4 结论

本研究利用前期构建的粘核溶质桃‘87-7-1’的BAC文库,通过PCR筛选、单分子纳米孔测序、生物信息分析等技术,确定了粘核桃单株‘87-7-1’位于第4条染色体末端F-M基因座的变异情况,并通过与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,发现‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM;研究结果为粘离核分子标记的开发提供了参考。

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