马琳^,, 温红雨, 王学敏, 高洪文, 庞永珍^,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193

Cloning and Function Analysis of MsMAX2 Gene in Alfalfa (Medicago sativa L.)

MA Lin^,, WEN HongYu, WANG XueMin, GAO HongWen, PANG YongZhen^,Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

通讯作者: 庞永珍,E-mail： pangyongzhen@caas.cn。

责任编辑: 李莉
收稿日期:2021-03-5接受日期:2021-04-19

基金资助:

国家自然科学基金(31802118) 中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS10)

Received:2021-03-5Accepted:2021-04-19
作者简介 About authors
马琳,E-mail： malin@caas.cn。







摘要
【背景】分枝是重要的产量构成因子,在紫花苜蓿育种中至关重要。发掘紫花苜蓿分枝相关基因并明确其作用机理,有助于加快紫花苜蓿高产优质育种。MAX2是重要的分枝相关基因,参与多种植物的分枝调控。【目的】通过对紫花苜蓿MsMAX2功能的研究,为建立MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育分子机制奠定基础。【方法】利用同源克隆的方法从紫花苜蓿中获得MsMAX2的基因序列。通过Expy Protparatam、DNAMAN和MEGA-X等软件对MsMAX2进行序列分析并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法分析MsMAX2在紫花苜蓿中的组织表达特异性。运用烟草瞬时表达系统确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位。利用农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥,以明确MsMAX2的基因功能。用酵母双杂交技术探明与MsMAX2互作的蛋白。【结果】MsMAX2包含长度为2 136 bp的开放阅读框,编码由711个氨基酸构成的蛋白,属于F-box蛋白超家族。系统进化分析表明,MsMAX2及其同源基因的进化与物种的分化高度相似,表明其是一个功能保守的基因。MsMAX2在紫花苜蓿的颈部组织中表达量最高,苗期叶片和授粉当天的花序中表达量较高,根中次之,其他组织表达量相对较低,暗示其在紫花苜蓿多个组织中发挥作用。亚细胞定位试验表明MsMAX2蛋白定位于细胞核中。在拟南芥max2突变体中过表达MsMAX2可互补突变体的多分枝表型。酵母双杂交试验表明MsMAX2与激素受体D14存在依赖于独脚金内酯的相互作用。【结论】获得在紫花苜蓿颈部组织中高水平表达的MsMAX2,其编码的蛋白定位于细胞核中;MsMAX2在拟南芥多分枝突变体max2中过表达时,能够互补突变表型,表明MsMAX2参与植物的分枝调控,其功能保守。
关键词： 紫花苜蓿;MsMAX2;分枝;互补试验;酵母双杂交

Abstract
【Background】 Branching is one of the key yield components, which plays an important role in alfalfa (Medicago sativa L.) breeding. Exploring and functional characterization of key branching-related genes are of significance in accelerating breeding of alfalfa with high yield and quality. MAX2 is an important branching-related gene, which is involved in the regulation of branching in several plant species. 【Objective】 Our research on the functional characterization of MsMAX2 in alfalfa will lay a foundation for the molecular mechanism of MsMAX2 in regulating branch development in alfalfa. 【Method】 The gene sequence of MAX2 in alfalfa was isolated by using homologous cloning. Sequence characteristics and phylogenetic tree of MsMAX2 were analyzed by using bioinformatics tools including Expy Protparatam, DNAMAN, and MEGA-X. The real-time quantitative PCR (qPCR) was applied to detect the tissue-specific expression pattern of MsMAX2 in alfalfa. The subcellular localization of the MsMAX2 protein was determined by using transient expression system in tobacco. The biological function of MsMAX2 was clarified by transformation in the Arabidopsis mutant via Agrobacterium-mediated transformation. Proteins interacting with MsMAX2 were determined by using yeast two-hybrid assay. 【Result】The length of MsMAX2 CDS is 2 136 bp, encoding a protein of 711 amino acids, and it belongs to the F-box protein super-family. Phylogenetic analysis showed that the evolution of MAX2 homologs was highly similar to the differentiation of species, indicating that MsMAX2 was a functionally conserved gene. It was showed that MsMAX2 was expressed in the neck at the highest level, followed by in the leaves of seedling, the inflorescences on pollination day and the roots; the expression level of MsMAX2 was relatively low in other tissues, indicating it functions in multiple tissues. Subcellular localization assay showed that the MsMAX2 protein was localized in the nucleus. Complementation assay in Arabidopsis max2 mutant showed that the multi-branch phenotype was recovered by the ectopic expression of MsMAX2. Yeast two hybrid assay demonstrated that the interaction between MsMAX2 and hormone receptor D14 depended on the existence of strigolactones. 【Conclusion】The MsMAX2 was obtained from alfalfa and it was highly expressed in the neck and the encoding MsMAX2 protein was localized in nucleus. When the MsMAX2 was over-expressed in the Arabidopsis max2 mutant, its multi-branch phenotype was recovered, indicating that MsMAX2 regulates branch development in alfalfa plant, and its function was conserved.
Keywords：alfalfa;MsMAX2;branching;complementation assay;yeast two hybrid assay


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本文引用格式
马琳, 温红雨, 王学敏, 高洪文, 庞永珍. 紫花苜蓿MsMAX2的克隆及功能研究. 中国农业科学, 2021, 54(19): 4061-4069 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.003
MA Lin, WEN HongYu, WANG XueMin, GAO HongWen, PANG YongZhen. Cloning and Function Analysis of MsMAX2 Gene in Alfalfa (Medicago sativa L.). Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(19): 4061-4069 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.003


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0 引言

【研究意义】紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是优质的多年生豆科牧草,在现代畜牧业发展中具有举足轻重的地位^[1,2]。近5年来（2016—2020年）,中国紫花苜蓿干草年平均进口量为137.647万t,进口金额达4.5213亿美元（数据来源：中国海关 http://online.customs.gov.cn/）。加快提高紫花苜蓿产量对于减少对进口饲草的依赖,促进中国畜牧业发展具有重要意义^[3]。分枝是紫花苜蓿重要的产量构成因子,较多的分枝往往代表着较高的牧草产量和品质^[4,5]。因此,发掘紫花苜蓿分枝发育相关基因,明确其作用机理,对培育高产优质的紫花苜蓿至关重要。【前人研究进展】植物的分枝起源于顶端分生组织和侧生分生组织,其大致可分为2个过程,即叶腋分生组织的形成和腋芽的生长发育;处于休眠状态的腋芽能否活化进而生长是植物能否形成分枝的关键因素^[6]。研究表明,腋芽的活化生长是生长素（auxin,IAA）、细胞分裂素（cytokinin,CK）、独脚金内酯及其衍生物（strigolactones,SLs）协同作用的结果^[7,8]。而F-box蛋白MAX2/D3/RSM4在腋芽的活化生长中发挥重要作用^[9,10,11]。MAX2首次在拟南芥中被报道,其突变体表现为分枝多而密,对独脚金内酯不敏感^[12]。进一步对MAX2参与SLs调控分枝发育的研究表明,当SLs存在时,受体D14结合并水解SLs,进一步发生构象变化形成SCF^MAX2-D14-D53复合体,促使D53/SMXL6-8等转录抑制因子进入26S蛋白酶体降解途径,解除对分枝调控基因TEOSINTE BRANCHED1、CYCLOIDEA及BRANCHED1（BRC1）等因子的抑制,从而激活下游分枝发育基因的表达^{[13,14,15,16]}。此外,近年来,研究表明MAX2同样参与根及根毛的发育^[17]、叶片衰老^[18]、种子萌发^[19]、下胚轴伸长^[20]、生物和非生物胁迫^[21,22]以及光形态建成^[23]等生物学过程,进一步表明MAX2在植物生长发育中具有关键作用。【本研究切入点】虽然目前已在模式植物中建立了MAX2调控分枝发育的分子模型^[15,16]。但是MsMAX2是否调控紫花苜蓿的分枝发育及其调控机理尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究克隆了紫花苜蓿的MsMAX2,明确该基因在紫花苜蓿中的组织表达特异性,确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位;在拟南芥max2突变体中过表达MsMAX2,阐明该基因的功能;此外,利用酵母双杂交明确MsMAX2的作用机制,为深入研究MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育的机理奠定基础,同时也为紫花苜蓿高产优质育种提供优异的基因资源和材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为紫花苜蓿品种中苜1号以及本氏烟草,载体为植物表达载体pBI121△GUS及亚细胞定位载体pCAMBIA1300,菌株为大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101以及酵母菌株AH109,以上试验材料均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存。拟南芥max2突变体购于AraShare平台。试验引物由北京六合华大合成（电子附表1）。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

使用改良CTAB法提取紫花苜蓿的DNA,经Nanodrop检测质量后,稀释至50 ng·μL^-1备用。收集紫花苜蓿苗期、分枝期、开花期、荚果期的13个不同组织,使用Eastep® Super Total RNA Extraction Kit试剂盒（上海普洛麦格生物科技有限公司）提取总RNA。使用TransScript Green One-Step qRT-PCR mix（北京全式金生物科技有限公司）将4 μg的总RNA反转录为cDNA,稀释8倍后备用。

1.3 PCR及实时荧光定量PCR（qPCR）

试验涉及2种PCR体系,一种为50 μL PCR体系,包含100—200 ng DNA、5 μL PCR buffer、5 μL dNTPs、2.5 μL Mg²⁺、3 μL引物以及1.5 μL KOD plus酶（北京百灵克生物技术有限公司）;另一种为20 μL PCR体系,包含50—100 ng DNA、10 μL 2×Taq PCR mix（北京天根生化科技有限公司）以及1 μL引物。PCR程序为94℃ 180 s;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 90 s,共35个循环;72℃ 300 s。

实时荧光定量PCR体系为20 μL,包含20—50 ng模板、10 μL qPCR mix（北京康润生物科技有限公司）以及1 μL引物。采用两步法,使用ABI7500 Real-Time PCR system（美国ABI公司）进行扩增。qPCR程序为94℃ 60 s;94℃ 34 s,60℃ 34 s,共45个循环。

1.4 基因克隆及序列分析

以紫花苜蓿13个组织（苗期的叶片、根、颈部、枝、顶部;分枝期的茎、叶片、顶部;开花期的茎、叶片、花序;授粉当天的花序;授粉5 d的果荚）混合的cDNA为模板,使用KOD plus酶,引物MsMAX2-F/R进行扩增,产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后连接入pEASY-Blunt克隆载体并转入大肠杆菌菌株DH5α,挑取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

利用Expy Protparatam（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件分析MsMAX2的开放阅读框及编码蛋白的氨基酸序列,同时分析MsMAX2蛋白的理化性质。使用DNAMAN对MAX2的同源基因进行多序列比对,用MEGA-X软件选择最大似然法（maximum likelihood,ML）法构建系统发育树,Bootstrap 值设定为1 000。

1.5 载体构建及农杆菌转化

构建植物过表达载体pBI121△GUS::MsMAX2用于转化拟南芥,具体步骤为：使用限制性内切酶XbaⅠ及SmaⅠ线性化载体pBI121△GUS并纯化;利用引物pBI121MsMAX2-F/R扩增获得MsMAX2的编码区。使用无缝克隆试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）连接线性化的载体及MsMAX2,经测序验证后获得重组的植物过表达载体。

构建带有GFP标签的瞬时表达载体pCAMBIA1300:: MsMAX2用于亚细胞定位分析,具体步骤为：使用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ线性化载体pCAMBIA1300并纯化;利用引物p1300MsMAX2-F/R扩增获得MsMAX2编码区。使用无缝克隆试剂盒连接MsMAX2和线性化载体,经测序验证获得重组的瞬时表达载体。

将以上2个重组载体利用冻融法转入农杆菌菌株GV3101,并分别用于拟南芥和烟草转化。

1.6 转基因阳性拟南芥植株的获得

利用花序浸染法转化拟南芥,具体步骤为：挑取包含重组载体pBI121△GUS::MsMAX2的阳性农杆菌菌落至100 mL LB液体培养基（50 mg·L^-1卡那霉素,25 mg·L^-1利福平）中,28℃,220 r/min培养20 h至OD₆₀₀=0.8,重悬菌体于等体积的5%的蔗糖溶液中,加入0.02%的表面活性剂,浸染拟南芥花序;浸染后的拟南芥正常生长至收获种子（T₀代）。在MS固体培养基（25 mg·L^-1卡那霉素）上筛选收获的种子最终获得T₃代纯合种子用于表型分析。

1.7 亚细胞定位

挑取包含重组载体pCAMBIA1300::MsMAX2的阳性农杆菌菌落至LB液体培养基（含50 mg·L^-1卡那霉素,25 mg·L^-1利福平）中培养,28℃,250 r/min培养14 h至OD₆₀₀=0.8;4 000 r/min离心10 min后收集菌体,重悬于等体积的乙酰丁香酮溶液中,静置3 h后注射至长势一致的本氏烟草叶片中。注射后的烟草于温室中培养2 d,使用LEICA TCS SP8共聚焦显微镜观察侵染的叶片,确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位。

1.8 酵母双杂交试验

构建包含结合结构域（binding domain,BD）的载体pGBDKT7::MsMAX2及包含激活结构域（activating domain,AD）的载体pGADT7::AtD14,pGADT7:: AtSMXL7酵母重组质粒。共转pGBDKT7:: MsMAX2和pGADT7::AtD14,pGBDKT7::MsMAX2和pGADT7:: AtSMXL7以及pGBDKT7::AtD14和pGADT7::AtSMXL7至酵母菌株AH109感受态中,涂布于SD/-Trp/-Leu二缺平板上进行筛选。挑取阳性转化子至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上,观察酵母生长状态,确定蛋白之间的两两互作关系。

1.9 数据分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS11.5软件对试验数据进行整理和统计分析。

2 结果

2.1 紫花苜蓿MsMAX2的克隆与序列分析

分别以紫花苜蓿品种中苜1号的混合cDNA（1.4部分所述的13个组织）和DNA为模板,引物MsMAX2-F/MsMAX2-R进行PCR扩增,均获得长度为2 500 bp左右的条带。将产物纯化、连接克隆载体并测序,获得紫花苜蓿MsMAX2的cDNA和基因序列。比对发现该基因仅包含一个外显子,其CDS长度为2 136 bp;编码蛋白711 aa,分子量为80.01 kD,等电点为5.61,不稳定系数为42.69,属于不稳定蛋白,亲水性系数为-0.187,属于疏水性蛋白。

利用DNAMAN将MsMAX2与其他植物中的同源蛋白进行多重序列比对和保守结构域预测,发现MAX2同源蛋白含有典型的F-box保守结构域（PF11234）,属于F-box蛋白超家族,同时还包含典型的Leucine-rice repeat（LRR）结构域（图1）。利用MEGA构建系统进化树进一步明确MsMAX2在物种中的进化位置和亲缘关系。结果表明,植物中MAX2蛋白的进化关系和物种的亲缘关系一致,即单子叶植物中的MAX2蛋白聚为一类,双子叶植物中的MAX2蛋白聚为另一类。与MsMAX2亲缘关系最近的是蒺藜苜蓿中的同源蛋白,亲缘关系最远的双子叶植物是拟南芥（图2）。

图1

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图1紫花苜蓿MsMAX2、拟南芥AtMAX2和水稻OsD3蛋白的氨基酸序列比对

橙色框与黑色线标出的分别为F-box结构域和LRR重复
Fig. 1Alignment of the predicted amino acid sequences of MsMAX2 with AtMAX2 and OsD3

The F-box domain (in orange frame) and leucine-rich repeat (in black lines)

图2

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图2植物MAX2蛋白的系统进化分析

AtMAX2：拟南芥,NP_565979.1;GmMAX2：大豆,XP_003540983.1;RMS4：豌豆,ABD67495.1;CaMAX2：鹰嘴豆,XP_004505491.1;TpMAX2：红三叶,PNX93440.1;MtMAX2：蒺藜苜蓿,XP_003607592.1;OsD3：水稻,NP_001174608.1;BdMAX2：短柄草,XP_003564315.1;TaMAX2：小麦,AZS54115.1;ZmMAX2：玉米,AQL02030.1;SbMAX2：高粱,XP_002436499.1;SiMAX2：谷子,XP_004964817.1。红色阴影为双子叶植物,蓝色阴影为单子叶植物
Fig. 2Phylogenetic analysis of MAX2 proteins from 13 plant species

AtMAX2: Arabidopsis thaliana, NP_565979.1; GmMAX2: Glycine max, XP_003540983.1; RMS4: Pisum sativum, ABD67495.1; CaMAX2: Cicer arietinum, XP_004505491.1; TpMAX2: Trifolium pratense, PNX93440.1; MtMAX2: Medicago truncatula, XP_003607592.1; OsD3: Orzya sativa, NP_001174608.1; BdMAX2: Brachypodium distachyon, XP_003564315.1; TaMAX2: Triticum aestivum, AZS54115.1; ZmMAX2: Zea may, AQL02030.1; SbMAX2: Sorghum bicolor, XP_002436499.1; SiMAX2: Setaria italica, XP_004964817.1. Proteins for dicotyledons are highlighted with red shadow, and monocotyledons with blue shadow

2.2 MsMAX2的组织表达特异性

采用qPCR研究MsMAX2在紫花苜蓿苗期、分枝期、开花期、荚果期的根、颈部、茎、叶、花序、荚果等13个组织中相对表达量（图3）。结果表明,MsMAX2在紫花苜蓿的不同组织中均有表达,但其相对表达丰度却具有组织特异性。MsMAX2在颈部的表达量最高,苗期叶片、授粉当天的花序次之,其次是苗期的其他组织;相对表达量最低的组织是茎,次之是叶片。MsMAX2在紫花苜蓿颈部的高丰度表达与该基因参与分枝发育密切相关;而在其他组织中的表达则暗示MsMAX2功能的多样性,参与紫花苜蓿的多个生长发育过程。

图3

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图3MsMAX2的组织特异性表达模式

1：苗期叶片;2：苗期根;3：苗期颈部;4：苗期枝;5：苗期顶部;6：分枝期茎;7：分枝期叶片;8：分枝期顶部;9：开花期茎;10：开花期叶片;11：开花期花序;12：授粉当天的花序;13：授粉5 d的果荚
Fig. 3Expression levels of MsMAX2 in various tissues

1: Leaf at seedling stage; 2: Root at seedling stage; 3: Neck at seedling stage; 4: Branch at seedling stage; 5: Head at seedling stage; 6: Stem at branching stage; 7: Leaf at branching stage; 8: Head at branching stage; 9: Stem at flowering stage; 10: Leaf at flowering stage; 11: Inflorescence at flowering stage; 12: Capsule at 0 day after pollination; 13: Capsule at 5 day after pollination

2.3 MsMAX2蛋白的亚细胞定位

利用烟草瞬时表达系统研究了MsMAX2蛋白的亚细胞定位（图4）,结果表明,在包含空载体pCAMBIA1300的烟草表皮细胞中,其绿色荧光信号分布于细胞膜、细胞核和细胞质中（图4-A—图4-D）。而包含重组载体pCAMBIA1300::MsMAX2的烟草细胞,其绿色荧光信号则仅分布于细胞核中（图4-E—图4-H）,表明MsMAX2定位于细胞核中。

图4

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图4MsMAX2蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位

Fig. 4Subcellular localization of MsMAX2 in epidermal cells of Nicotiana benthamiana

2.4 MsMAX2互补拟南芥max2突变体的表型

拟南芥MAX2的缺失突变体max2表现为初级分枝和次级分枝增多（图5-A）。利用qPCR检测转基因阳性拟南芥中MAX2的表达量,结果表明,转基因植株中MsMAX2的表达量显著高于野生型,而内源AtMAX2的表达水平则与背景植株相似（图5-B）。对野生型拟南芥（WT）、突变体max2以及过表达植株MsMAX2-OE进行分枝表型的观察比较,发现与WT相比,max2突变体的初级分枝和次级分枝显著增多,而在max2背景下过表达MsMAX2使得其分枝增多的表型丢失,初级分枝和次级分枝的数量与野生型相比没有显著性差异,即MsMAX2可以互补拟南芥max2的突变表型（图5-C）。

图5

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图5MsMAX2在拟南芥max2突变体中的互补试验

野生型、max2及max2背景下过表达MsMAX2拟南芥植株的表型（A）、基因表达量（B）和分枝数（C）
Fig. 5Complementation assays of MsMAX2 in the Arabidopsis max2 mutant

The phenotypes (A), MsMAX2 and AtMAX2 relatively expression levels (B) and brunch numbers (C) of WT, max2 and max2 transformed with 35S::MsMAX2 constructs

2.5 MsMAX2与AtD14、AtSMXL7的相互作用

为了明确MsMAX2互补拟南芥max2突变体表型的作用机理,进而研究MsMAX2在紫花苜蓿分枝调控中的作用机制,利用酵母双杂交验证MsMAX2与AtD14、AtSMXL7的相互作用关系。结果显示,含有pGBDKT7::MsMAX2和pGADT7::AtD14重组质粒的酵母菌株能够在添加GR24（一种SLs的人工合成替代品）的缺陷培养基上生长,但不能在未添加GR24的缺陷培养基上生长;而含有pGBDKT7::MsMAX2和pGADT7::AtSMXL7重组质粒的酵母菌株在2种培养基上均不能生长（图6）。以上结果表明,MsMAX2与AtD14的相互作用依赖于独脚金内酯激素的存在,而MsMAX2与AtSMXL7之间则不存在相互作用。这一结果表明MsMAX2与其他模式物种中的MAX2类似,也是通过参与独脚金内酯激素介导的分枝调控参与植物的分枝发育。

图6

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图6MsMAX2与AtD14、AtSMXL7的酵母双杂交分析

GR24是SLs的人工合成替代品
Fig. 6Yeast two-hybrid assays of MsMAX2 with AtD14 and AtSMXL7

GR24 is a synthetic substitute of SLs

3 讨论

3.1 MAX2参与调控植物的分枝发育

MAX2参与多种生物学过程,其中调控分枝发育的功能被研究得较为深入。MAX2的突变导致拟南芥（max2）、水稻（d3）和豌豆（rms4）的突变体分枝增多^[9-10,24]。目前,已在拟南芥、水稻和豌豆中建立了MAX2调控分枝发育的分子模型,而MAX2是否参与紫花苜蓿的分枝发育调控尚不明确。

本研究通过对紫花苜蓿MsMAX2系统发育分析发现MAX2在物种中的进化与物种的分化高度相似（图1和图2）,表明其是一个功能较为保守的基因^[25],这为后续MsMAX2的功能研究奠定基础。组织表达特异性分析发现MsMAX2在紫花苜蓿的颈部高丰度表达,这与该基因参与分枝发育密切相关;通过在拟南芥max2突变体中过表达MsMAX2,发现MsMAX2能够互补拟南芥max2突变体的多分枝表型（图5）,表明MAX2在调控植物分枝发育中的保守性。

在MAX2调控分枝发育的分子模型中,SLs受体D14同时具有结合SLs和水解SLs的作用,发生构象变化的D14一方面结合可以SCF^MAX2复合体,另一方面可以招募D53、SMXL6、SMXL7和SMXL8等蛋白进入26S蛋白酶体降解。这些蛋白结合了BRC1等转录因子,它们的降解直接释放了以上转录因子,促进下游抑制分枝基因的表达^{[13,14,15,16,17,18]}。同时,D14对SLs的降解使得SLs信号中断,平衡分枝的发育^[13]。进一步的研究还表明,MAX2通过参与SLs信号转导而非合成途径参与植物的分枝发育^[26]。本研究利用酵母双杂交技术,证实了MsMAX2与AtD14同样存在SLs依赖的相互作用,而MsMAX2则不存在与AtSMXL7的相互作用,推测MsMAX2在紫花苜蓿中同样存在保守的调控机制（图6）。后续可进一步对MsMAX2在紫花苜蓿中进行基因沉默或编辑,并利用RNA-seq等手段检测沉默/编辑植株中差异表达的基因,进而明确MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育的分子机制。

3.2 MsMAX2在紫花苜蓿育种中的应用潜力

紫花苜蓿是优良的豆科牧草,近年来,随着中国畜牧业的发展,国内对于优质高产的紫花苜蓿品种需求量越来越大。而目前国内紫花苜蓿育种多采用群体育种、杂交育种等传统育种方式,育种周期长,品种更新换代速度慢^[27,28]。紫花苜蓿作为典型的同源四倍体物种,又具有自交衰退的不足,这些特征导致了紫花苜蓿功能基因组学研究滞后,分子设计育种进程远远滞后于其他重要作物^[29,30]。

然而,随着紫花苜蓿基因组的公布,紫花苜蓿分子设计育种进入了新的纪元^[31,32]。利用基因编辑的手段对某个特定的功能基因进行编辑,进而创制紫花苜蓿新种质,将会有针对性地对某一特定性状进行改良,进而加快紫花苜蓿的育种进程。因此,对于紫花苜蓿功能基因的研究势必会越来越深入,而建立紫花苜蓿中基因功能的分子模型/分子机制也同样重要。

本研究根据同源基因功能的保守性推测分枝相关基因MAX2在紫花苜蓿中同样可以调控分枝发育,该基因可以互补拟南芥max2多分枝突变体的试验也初步证实了这一猜想（图5）。在单子叶模式植物水稻中也发现了与双子叶植物拟南芥类似的现象,即MAX2同源基因（OsD3）的沉默也产生了分蘖增多的表型^[10]。同样地,在另一个与紫花苜蓿同属豆科的模式植物豌豆中,MAX2同源基因（RMS4）的沉默也产生了多分枝,生物量增大的表型^[25]。根据这些模式植物中的相关结果,可以推测紫花苜蓿中MsMAX2的沉默也将产生分枝增多的表型。如将这一策略运用在紫花苜蓿中,即对该基因进行定向基因编辑,产生分枝显著增多的表型,创制该基因编辑后的新材料,可以为紫花苜蓿高产优质育种提供优异的种质资源,在紫花苜蓿分子育种中具有巨大的潜力。

4 结论

利用同源克隆的方法获得紫花苜蓿MsMAX2,该基因高丰度地表达于紫花苜蓿的颈部组织中,其编码蛋白定位于细胞核中;在拟南芥多分枝max2突变体中过表达MsMAX2,能够互补其分枝增多的突变表型,表明MsMAX2保守地参与植物的分枝调控。

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被引期刊影响因子

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