李保玲^,, 李颖, 范鑫, 马文慧, 曹云刚^,陕西科技大学食品与生物工程学院,西安 710021

Synergistic Enhancement of Gelling Properties of Oxidatively Damaged Myofibrillar Protein by Sodium Pyrophosphate and Transglutaminase

LI BaoLing^,, LI Ying, FAN Xin, MA WenHui, CAO YunGang^,School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021

通讯作者: 曹云刚,E-mail： caoyungang@sust.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-11-5接受日期:2021-01-7

基金资助:

国家自然科学基金青年基金(31801480) 陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目(2019JQ-397)

Received:2020-11-5Accepted:2021-01-7
作者简介 About authors
李保玲,E-mail： 1650608180@qq.com。







摘要
【目的】探究焦磷酸钠（sodium pyrophosphate,PP）、谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TG）及其组合（PP+TG）对氧化损伤猪肉肌原纤维蛋白（myofibrillar protein,MP）凝胶性能的影响,为改善氧化损伤蛋白的功能特性提供理论依据。【方法】从猪背最长肌中提取MP,采用亚油酸-脂肪氧合酶氧化体系诱导MP发生氧化,然后分别添加PP（1 mmol∙L^-1）、TG（E﹕S=1﹕500）及其组合（PP+TG）。采用圆二色谱探究不同添加处理对氧化损伤MP溶液二级结构的影响;通过内源性色氨酸荧光测定探究MP三级结构的变化;通过粒度、溶解度及SDS-PAGE探究不同处理对MP交联聚集情况的影响;借助物性测试仪探究MP凝胶强度的变化;采用离心法测定凝胶持水性的变化;通过分光测色计测定其白度变化;借助扫描电镜观察MP凝胶的微观结构。【结果】PP处理明显改变了氧化损伤MP的构象,使氧化MP的平均粒径明显减小、溶解度显著增强,在增强凝胶强度的同时显著提高了其持水性能（P<0.05）,凝胶的微观结构也明显比氧化损伤MP凝胶更规则、均匀、细腻和致密。TG处理显著改善了MP凝胶强度,但对其持水性能并无积极影响;凝胶的微观结构孔径变小、结构致密的同时,仍存在形状不规则、表面粗糙等问题。综合来看,PP+TG协同使用效果最好,氧化损伤MP的凝胶强度及持水性显著增强,且明显好于未氧化MP的凝胶性能。【结论】焦磷酸钠与谷氨酰胺转氨酶的协同使用可以有效改善氧化损伤MP的凝胶性能。
关键词： 肌原纤维蛋白;焦磷酸钠;谷氨酰胺转氨酶;氧化;凝胶性能

Abstract
【Objective】 This study was designed to explore the effects of sodium pyrophosphate (PP), transglutaminase (TG), and their combination (PP+TG) on the gelling properties of oxidatively damaged pork myofibrillar protein (MP), which was expected to provide a theoretical basis for the enhancement of functional properties of oxidatively damaged proteins. 【Method】 MP was extracted from porcine longissimus lumborum muscle, and oxidized using a lipoxygenase-linoleic acid oxidation system. Subsequently, PP (1 mmol∙L^-1), TG (E:S=1:500) and their combination (PP+TG) were added and incorporated into the oxidatively damaged MP systems, respectively. The effects of different additive treatments on the secondary and tertiary structures of oxidatively damaged MP solution were investigated by circular dichroism spectroscopy and endogenous tryptophan fluorescence, respectively. The changes of cross-linking and aggregation of MP with different treatments were investigated through measuring particle size, solubility and SDS-PAGE. The textural properties of MP gels were measured by physical property tester, and the water holding capacity (WHC) was determined by centrifugation method. The whiteness of the MP gels was measured by spectrophotometer, and the microstructure of the MP gels was observed by a scanning electron microscopy. 【Result】 The results showed that PP treatment significantly changed the protein conformation, reduced the mean particle size and enhanced the solubility of oxidatively damaged MP, and obviously enhanced the gel strength and water holding capacity (P <0.05). The microstructure of gel with PP treatment was more regular, uniform and delicate than that of oxidatively damaged MP gel. TG treatment significantly improved the gel strength, but had no positive effect on the water holding capacity. While the MP gel with TG treatment had a compact microstructure with small pores, there were still irregular shape and rough surface. On the whole, the combination of PP and TG had the best synergistic effect. The gel strength and water holding capacity of oxidatively damaged MP under PP+TG treatment were significantly enhanced, and the gel performance was obviously better than that of non-oxidized MP. 【Conclusion】 The combination of PP and TG could effectively improve the gelling properties of oxidatively damaged MP.
Keywords：myofibrillar protein;sodium pyrophosphate;transglutaminase;oxidation;gelling properties


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本文引用格式
李保玲, 李颖, 范鑫, 马文慧, 曹云刚. 焦磷酸钠与谷氨酰胺转氨酶对氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶性能的协同改善效应[J]. 中国农业科学, 2021, 54(16): 3527-3536 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.014
LI BaoLing, LI Ying, FAN Xin, MA WenHui, CAO YunGang. Synergistic Enhancement of Gelling Properties of Oxidatively Damaged Myofibrillar Protein by Sodium Pyrophosphate and Transglutaminase[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(16): 3527-3536 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.014


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0 引言

【研究意义】原料肉富含脂肪和蛋白质,在长期储藏及加工过程中,氧化是不可避免的自然现象。蛋白氧化通常会导致肉蛋白溶解度下降,进而引起加工性能（乳化性和凝胶性等）劣变,最终导致产品得率降低、品质下降^[1,2,3]。因此,有效防控蛋白氧化或改善氧化损伤肉蛋白的功能特性具有重要的商业意义。【前人研究进展】现有研究聚焦于采用不同包装技术、添加抗氧化剂等手段降低储藏过程中原料肉的氧化损伤。真空包装能够降低脂肪和蛋白氧化速率,延长肉品货架期,但其对肉品的色泽及外观等影响较大^[4,5]。ZHANG等^[6]研究发现鱼糜加工水解物可有效延缓鱼糜的氧化,显著提高其初始凝胶性能,降低冻藏造成的胶凝性能损失。XU等^[7]研究发现在饲粮中添加番茄红素可以有效地抑制蛋白和脂质氧化,提高羊肉的贮藏品质。JONGBERG等^[8]研究发现在70% N₂/30% CO₂以及100% N₂条件下白葡萄提取物（WGE）可有效阻止肉饼中的脂质氧化,且对蛋白氧化有一定的抑制作用,但在高氧包装（70% O₂/30% CO₂）条件下却会促进蛋白氧化。李艳青^[9]研究发现在鱼糜漂洗时添加没食子酸丙酯可以抑制蛋白羰基的生成,但添加抗坏血酸钠反而促进了蛋白氧化的发生。CAO等^[10]研究发现适量绿原酸的添加能有效抑制蛋白羰基含量的上升,且有利于肌原纤维蛋白凝胶网络的形成,但高浓度绿原酸具有负面影响。这些策略在控制脂肪氧化方面非常有效,但是在控制蛋白氧化方面却存在一定局限性。肌原纤维蛋白是肉蛋白的主要成分,约占整个肌肉蛋白含量的55%—60%,对肉制品的凝胶性能及感官品质起决定性作用^[11]。原料肉中富含脂肪,脂肪氧化产物是诱导蛋白发生氧化的重要因素。大量研究表明,焦磷酸钠能有效改变肌原纤维蛋白的结构、解离肌动球蛋白、有效提高其溶解度并改善其凝胶性能和持水性^[12,13];谷氨酰胺转氨酶能高效催化蛋白共价交联提高蛋白凝胶性能^[14]。TG催化蛋白交联的效果取决于可利用反应底物谷氨酰胺和赖氨酸残基的含量,而蛋白质构象的变化通常导致可利用反应底物含量的改变。因此,推测焦磷酸钠结合谷氨酰胺转氨酶能协同改善氧化损伤肉蛋白的凝胶性能。【本研究切入点】虽然焦磷酸钠及谷氨酰胺转氨酶添加对MP凝胶性能的影响已有一些研究,但二者复配对氧化损伤MP凝胶性能的协同改善研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究使用脂肪氧化体系制造氧化损伤的肌原纤维蛋白,探究焦磷酸钠结合谷氨酰胺转氨酶改善氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶性能的协同作用,并探讨其内在机制,为改善损伤蛋白的功能特性提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2019年12月至2020年8月在陕西科技大学食品与生物工程学院实验楼进行。

1.1 主要材料与试剂

猪外脊肉（Longissimus lumborum）分3个批次购于西安市未央区润家超市（n=3）,置于冰盒中运至实验室,每批次分别剔除肉眼可见的脂肪和结缔组织,逆肌纤维走向切成约100 g肉片,真空包装后置于-20℃冰箱备用。

脂肪氧合酶（soybean lipoxidase）、水溶性维生素E（Trolox）购于Sigma公司,亚油酸（>95%）购于上海阿拉丁试剂有限公司,谷氨酰胺转氨酶（TG,1 000 U∙g^-1）购于北京索莱宝科技有限公司,焦磷酸钠（PP）购于上海源叶生物科技有限公司。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HR/T20MM立式高速冷冻离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;UV2900紫外可见分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;TA.Plus物性测试仪,英国Stable Micro System公司;Fluoro Max-4荧光分光光度计,日本Horiba公司;CM-5分光测色计,柯尼卡美能达（中国）投资有限公司;Mastersizer 2000激光粒度分析仪,英国Malvern Instruments有限公司;FEI Q45+EDAX Octane Prime环境扫描电子显微镜,美国FEI公司;圆二色光谱仪,英国Applied Photophysics公司。

1.3 试验方法

1.3.1 MP的提取 将冷冻样品在4℃解冻,切成长条后参照PARK等^[15]的方法进行MP的提取,提取过程温度保持在0—4℃,将提取的MP置于碎冰中并在48 h内用完。

1.3.2 MP的氧化以及PP和TG处理 使用25 mmol∙L^-1磷酸盐缓冲液（含0.4 mol∙L^-1 NaCl,pH 6.2）将MP膏稀释并添加脂肪氧化体系（LOS：3 750 U∙mL^-1的脂肪氧合酶,10 mmol∙L^-1亚油酸）于4℃氧化12 h。氧化反应通过添加Trolox（1 mmol∙L^-1）终止,随后将PP（1 mmol∙L^-1）、TG（E﹕S=1﹕500）以及PP+TG添加到氧化后的MP（30 mg∙mL^-1）分散液中并在4℃反应2 h待用,所提及浓度均为最终浓度。未氧化以及氧化后未经PP和TG处理的MP分散液分别作为空白对照（NonOx）和氧化对照（Ox）。

1.3.3 圆二色谱测定 不同处理MP二级结构的变化采用圆二色谱光谱仪进行分析。使用25 mmol∙L^-1磷酸盐缓冲液（含0.4 mol∙L^-1 NaCl,pH 6.2）将MP样品稀释至0.2 mg∙mL^-1,以120 nm∙min^-1的速率从200 nm扫描至260 nm,累计扫描3次取其平均值并扣除缓冲液背景,使用CDNN软件计算蛋白二级结构含量。

1.3.4 内源性色氨酸荧光测定 使用25 mmol∙L^-1磷酸盐缓冲液（含0.4 mol∙L^-1 NaCl,pH 6.2）将MP样品稀释为0.4 mg∙mL^-1,以283 nm作为激发波长利用Fluoro Max-4 荧光分光光度仪记录290—400 nm的发射光谱,激发和发射狭缝宽度均为1.5 nm。相同条件下记录样品缓冲液发射光谱,并从样品发射光谱中扣除,以排除干扰。

1.3.5 粒度测定 在25℃下使用Mastersizer 2000采用静态光散射法对不同处理的MP样品（2 mg∙mL^-1）的平均粒径进行分析,将稀释后的MP样品分散在蒸馏水（分散介质）中,直至遮光效果达到10%—13%,以避免多次散射。设置MP颗粒折射率为1.434,分散剂折射率为1.330,重复测定3次,取其平均值。

1.3.6 SDS-PAGE 使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对MP组分的氧化交联、聚合或降解情况进行分析。参考CAO等^[10]的方法并适当修改,使用4%浓缩胶和12%分离胶在还原（+DTT）和非还原（-DTT）条件下进行凝胶电泳,每孔上样量为20 µg,染色脱色后拍照,对电泳条带进行分析。

1.3.7 溶解度测定 使用25 mmol∙L^-1磷酸盐缓冲液（含0.4 mol∙L^-1 NaCl,pH 6.2）将MP样品稀释至2 mg∙mL^-1,在5 000×g条件下离心15 min,采用双缩脲法测定上清液的蛋白浓度,溶解度计算公式如下所示：

$ \text { 蛋白溶解度 }(\%)=\left(\frac{\text { 上清液中的蛋白含量 }}{\text { 原蛋白液中的蛋白含量 }}\right) \times 100$

1.3.8 MP热诱导凝胶的制备 准确称取5 g脱气后的MP样品（30 mg∙mL^-1）于玻璃瓶中,封口后置于水浴锅中以1℃∙min^-1的升温速率从20℃加热至75℃,并在75℃保温10 min,取出后立刻置于冰水混合物中冷却30 min,随后放入4℃冰箱冷藏过夜。在测定MP样品凝胶性能之前,需将样品提前取出在室温下平衡2 h。

1.3.9 MP凝胶白度的测定 参照XIA等^[16]的方法,分光测色计经自检及零点、白板校正后,进行样品测定。每个样品3组平行,取平均值。凝胶白度值按下式计算：

$ \mathrm{W}=100-\sqrt{\left(100-\mathrm{L}^{*}\right)^{2}+\mathrm{a}^{* 2}+\mathrm{b}^{* 2}}$

式中,L*为亮度值;a*为红度值（正值表示偏红,负值表示偏绿）;b*为黄度值（正值表示偏黄,负值表示偏蓝）。

1.3.10 MP凝胶持水性能的测定 将凝胶置于离心管中于4℃下离心（6 000×g,15 min）,记录离心管质量（m）以及离心前离心管和凝胶总重量（m₁）和离心后去除离心管中水分后总重量（m₂）。持水性的计算公式如下：

$ \mathrm{WHC}(\%)=\frac{\mathrm{m}_{2}-\mathrm{m}}{\mathrm{m}_{1}-\mathrm{m}} \times 100$

1.3.11 MP凝胶强度的测定 样品凝胶强度用TA-XT Plus物性分析仪进行测定。测定模式：测前速率为5 mm∙s^-1,测中速率为1 mm∙s^-1,测后速率为5 mm∙s^-1;下压距离为8 mm,探头型号为P/0.5。凝胶强度定义为刺破凝胶所需的初始压力（N）。

1.3.12 MP凝胶微观结构的观察 参照张兴等^[17]的方法并略做修改。将MP凝胶样品切成小方块后使用含2.5%（v/v）戊二醛的磷酸盐缓冲液（0.1 mol∙L^-1,pH 7.4）固定4 h,使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗数次,然后通过一系列浓度的乙醇溶液（50%、70%、90%、95%、100%）进行梯度脱水,每次30 min。在-70℃对样品进行冷冻干燥,将干燥的样品喷金后使用扫描电镜观察其微观结构,加速电压15 kV,放大倍数为4 000。

1.4 统计分析

使用Statistix 9.0分析软件通用线性模型程序（Analytical software, Tallahassee, FL, USA）对试验数据进行方差分析。采用LSD全配对多重比较方法进行显著性分析,P值设置为0.05。试验数据以平均数±标准差（SD）表示,使用SigmaPlot 12.5软件绘图。

2 结果

2.1 PP和TG处理对氧化损伤MP二级结构的影响

使用圆二色谱对不同处理MP二级结构的变化进行测定,结果如图1所示。未氧化MP的CD图谱在208和222 nm处有两个负峰,表明样品中α-螺旋含量丰富。氧化后这两个峰明显变小,这是因为氧化使肌球蛋白尾部的超螺旋结构解开,导致其α-螺旋含量下降^[11]。不同添加剂处理对氧化损伤MP的CD图谱和二级结构含量产生了明显影响,PP处理下氧化损伤MP样品的α-螺旋含量显著提高（P<0.05）,TG和PP+TG处理下氧化损伤MP的两个负峰大小进一步降低,同时α-螺旋含量也进一步降低,表明TG交联导致MP二级结构的变化。

图1

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图1不同处理对MP溶液结构的影响

NonOx：未氧化 Non-oxidized;Ox：氧化 Oxidized;Ox+PP：氧化+焦磷酸钠 Oxidized+sodium pyrophosphate;Ox+TG：氧化+谷氨酰胺转氨酶 Oxidized+transglutaminase;Ox+PP+TG：氧化+焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶 Oxidized+sodium pyrophosphate+transglutaminase。下同 The same as below
Fig. 1Effects of different treatments on the structure of MP solution

2.2 PP和TG处理对氧化损伤MP三级结构的影响

蛋白质色氨酸残基的荧光特性对其所处的微环境极其敏感,经常被用来反映蛋白质三级结构的变化。如图2所示,未氧化MP处于折叠状态,色氨酸残基被包围在MP内部疏水性环境中,具有较大的荧光强度。与之相比,氧化损伤MP样品的荧光强度显著降低,说明氧化导致MP结构展开;TG处理促进了氧化损伤MP荧光强度的降低,PP和PP+TG处理均使氧化损伤MP的荧光强度显著增强,说明添加PP引起了氧化损伤MP构象的变化,但这种构象变化明显区别于TG引起的变化。

图2

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图2不同处理对MP内源性色氨酸荧光的影响

Fig. 2Effects of different treatments on endogenous tryptophan fluorescence of MP

2.3 PP和TG处理对氧化损伤MP粒径的影响

与未氧化的MP相比,氧化损伤MP的d_3,2值和d_4,3值均显著增加15%以上（P<0.05）。PP的加入使氧化损伤MP的d_3,2值和d_4,3值分别降低了28.0%和32.9%;TG处理使氧化损伤MP的d_3,2值和d_4,3值分别下降7.0%和8.3%;PP+TG处理下的氧化损伤MP的平均粒径值分别下降11.6%和19.2%（图3）。上述结果表明,PP能显著降低氧化损伤MP的粒径,这主要是因为PP能解离肌动球蛋白为肌球蛋白和肌动蛋白。TG对氧化MP粒径的影响可能要归因于其对MP构象的影响（图1、图2）。

图3

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图3不同处理对MP溶液粒径的影响

不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同
Fig. 3Effects of different treatments on the particle size of MP solution

Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same as below

2.4 PP和TG处理对氧化损伤MP交联聚集行为的影响

在非还原条件下（图4-A）,与未氧化MP相比,氧化MP的肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）和肌动蛋白（Actin）的条带强度明显降低,同时在浓缩胶的顶端出现了蛋白聚集体;在还原条件下（图4-B）,氧化损伤MP的MHC和Actin条带损失完全恢复,说明氧化诱导的聚合物主要与肌球蛋白重链和肌动蛋白有关^[6,18],同时也表明这些聚合物主要通过二硫键的交联形成^[19]。PP和TG单独使用时均未对氧化损伤MP的MHC和Actin条带强度产生显著影响,PP+TG处理下的MHC和Actin条带强度显著减弱。在还原条件下,PP处理下的氧化损伤MP顶端聚集物完全消失,而TG和PP+TG处理的MP顶端聚集物未完全消失,这表明部分聚集体是由TG催化形成的非S-S共价键连接产生,如ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸异肽键^[20]。

图4

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图4不同处理对MP交联聚集情况的影响

Fig. 4Effects of different treatments on the crosslinking and aggregation of MP

2.5 PP和TG处理对氧化损伤MP溶解度的影响

溶解度可以间接反映蛋白分子间以及蛋白与水分子间的相互作用力。如图5所示,与未氧化MP相比,氧化处理后MP的溶解度下降了40.0%以上。与氧化损伤MP相比,PP处理后氧化损伤MP的溶解度显著增加31.5%（P<0.05）,这一结果与图3中PP处理后显著降低的MP粒径相符;TG处理下氧化损伤MP的溶解度显著降低,而PP+TG处理因PP的存在使得氧化损伤MP溶解度增长约20.0%。

图5

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图5不同处理对MP溶解度的影响

Fig. 5Effects of different treatments on solubility of MP

2.6 PP和TG处理对氧化损伤MP凝胶性能的影响

凝胶的持水性指凝胶在外力作用下保持自身水分或者补充水分的能力^[21],它与凝胶内部微观结构紧密相关。与未氧化MP相比,氧化后MP的凝胶白度有所降低,凝胶的持水性能和凝胶强度分别下降了16.0%和23.8%,推测是MP氧化变性导致。PP、TG和PP+TG处理对氧化损伤MP凝胶的白度均无显著影响,但是PP以及PP+TG的加入使氧化损伤MP凝胶的持水性分别上升了28.6%和10.4%,单独添加TG对氧化损伤MP凝胶的持水性无显著影响。PP、TG和PP+TG处理分别使氧化损伤MP的凝胶强度提高了18.8%、58.3%和97.9%（图6）。

图6

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图6不同处理对MP凝胶性能的影响

Fig. 6Effects of different treatments on the properties of MP gel

2.7 PP和TG处理对氧化损伤MP凝胶微观结构的影响

凝胶的微观结构与其持水性和凝胶强度密切相关,不同处理MP凝胶的微观结构特征如图7所示。未氧化MP凝胶呈现出一种致密、均匀、连续的三维网状结构,而氧化MP凝胶的微观结构粗糙多孔、不规则、不均匀,这也导致氧化MP凝胶的持水性降低（图6）。与氧化MP凝胶相比,PP和PP+TG处理均使凝胶的微观结构更加细腻、均匀,这很好地解释了二者明显增强的凝胶强度及持水性能（图6）。单独添加TG使氧化损伤MP的凝胶结构更加紧致,但蛋白不规则聚集体分布并不均匀,伴有“沟壑”的形成。因此,TG处理下氧化损伤MP凝胶拥有较好的凝胶强度,但持水性能却未得到明显改善（图6）。

图7

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图7不同处理对MP凝胶微观结构的影响

Fig. 7Effects of different treatments on the microstructure of MP gel

3 讨论

3.1 PP和TG处理改变了氧化损伤MP的结构

MP的结构与功能性质密切相关,氧化导致MP的构象发生变化,表现为CD图谱及内源性色氨酸荧光强度的变化。本研究中氧化损伤MP的α-螺旋含量减少,同时伴随着β-折叠、β-转角以及无规则卷曲含量的上升。与之类似,CAO等^[22]发现羟自由基氧化体系诱导MP构象改变以及α-螺旋含量降低。王策等^[23]研究发现羟自由基诱导牛血清蛋白氧化也导致其二级结构发生变化。PP处理下氧化损伤MP的α-螺旋含量显著上升,孙悦^[24]研究也发现在羟自由基氧化体系下PP的加入会引起MP样品的α-螺旋含量上升。TG和PP+TG处理导致氧化损伤MP的α-螺旋含量稍有下降,推测是TG处理催化了MP分子内及分子间的共价交联,导致MP二级结构的变化,这与HERRERO等^[25]的研究结果一致。

由于色氨酸残基对其周围微环境非常敏感,内源性色氨酸荧光特性通常用于反映蛋白质构象的变化^[26,27]。与CD结果相对应,氧化后MP因其结构的展开导致荧光强度降低,TG处理引起MP中氨基酸残基间的共价交联使荧光强度进一步下降,而PP和PP+TG处理因为PP对氧化MP构象的影响导致荧光强度显著增强。CAO等^[28]研究发现在羟自由基氧化体系下,PP的加入反而促进了氧化引起的MP荧光强度的降低,不一致的原因可能是由氧化诱导体系、PP添加浓度以及添加顺序等的不同造成。

3.2 PP和TG处理改变了氧化损伤MP的交联聚集效应、提高了其溶解度

氧化会对MP分子内及分子间的共价交联类型以及交联程度造成影响,进而对MP的溶解度、凝胶及乳化性能造成影响。本研究中,脂肪氧化体系诱导MP结构展开,MP分子间S-S形成及疏水相互作用增强、蛋白质交联聚集加剧,导致MP的平均粒径显著增大、溶解度显著降低。前人使用次氯酸钠、羟自由基等不同体系诱导MP氧化也得到了类似的研究结果^[29,30,31]。TG处理导致氧化损伤MP粒径略微变小,这可能与TG引起的蛋白分子内及分子间共价交联导致的MP构象变化有关。值得关注的是,本研究中TG对氧化MP的SDS-PAGE图谱影响不明显,但使氧化MP溶解度明显降低。类似地,LI等^[32]在羟基自由基生成系统中研究发现TG处理导致氧化肌球蛋白溶解度进一步损失。PP处理对氧化损伤MP的SDS-PAGE无明显影响,但导致其平均粒径显著降低,这主要是由于PP的加入引起了肌动球蛋白解离为肌球蛋白和肌动蛋白,进而导致MP样品的颗粒尺寸减小、溶解度增大（图3、图5）。CAO等^[28]在羟自由基氧化体系中研究发现,当H₂O₂ 浓度在0—3 mmol∙L^-1时,PP添加对MHC和Actin条带强度无明显影响;当H₂O₂ 浓度为10 mmol∙L^-1时,添加PP显著促进了蛋白的共价交联;但在所有H₂O₂浓度条件下,添加PP均显著提高了MP的溶解度。PP+TG处理导致氧化损伤MP中MHC和Actin条带强度显著降低（图4）,说明PP的存在促进了TG引起的蛋白组分间的共价交联;但同时PP的存在使其蛋白粒径仍低于氧化损伤对照,因此溶解度增大（图5）。

3.3 PP和TG处理增强了氧化损伤MP的凝胶性能

氧化后MP的凝胶白度有所下降,推测是蛋白氧化变性导致,HWANG等^[33]研究发现蛋白的凝胶白度与蛋白质的变性程度有关。PP、TG和PP+TG处理均未对氧化损伤MP的凝胶白度产生负面影响。与未氧化MP相比,氧化后MP凝胶的微观结构变得粗糙、多孔、松散、不规则,因而其凝胶强度及持水性也显著下降。类似氧化导致MP凝胶蒸煮损失增大,持水性能下降的结论已有诸多研究报道^[34,35,36]。这可能是由于氧化导致蛋白分子内和分子间相互作用增强,进而形成蛋白大分子聚集体,导致加热成胶过程中蛋白展开速度低于交联速度,难以形成稳定有序的三维网络结构,从而降低了氧化MP的凝胶性能。PP处理后的氧化损伤MP凝胶的微观结构变得更加细腻、光滑、规则,孔径也较小,持水性能也显著增强,凝胶强度也有一定提升,这可能与PP引起的肌动球蛋白解离和溶解度增加有关^[28,37-38]。PP与TG复配处理时,氧化损伤MP凝胶的微观结构致密均匀、凝胶性能增强效果也更好,进一步解释了 PP与TG间的协同作用。

4 结论

焦磷酸钠（PP）处理使氧化损伤猪肉肌原纤维蛋白（MP）凝胶的微观结构更加均匀、细腻,持水性能显著增强,但凝胶强度增加幅度有限;谷氨酰胺转氨酶（TG）处理显著改善了氧化损伤MP的凝胶强度,但其持水性无明显改善,其凝胶微观结构存在粗糙、不规则、不均匀等问题;PP+TG处理使氧化损伤MP凝胶性能显著改善,表现为凝胶三维网络结构更加细密、均匀,凝胶强度和持水性能均显著增加。综上,PP和TG协同使用效果最好,可以有效改善氧化损伤肌原纤维蛋白的凝胶性能。因此,在肉品加工业中,PP和TG复配有望改善氧化损伤原料肉的加工性能,提高肉品品质和企业经济效益。

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