宋美洁^,1, 欧爱群^1,2, 薛晓锋¹, 吴黎明¹, 寿旗扬³, 王凯^,11中国农业科学院蜜蜂研究所,北京 100093
²福建农林大学动物科学学院（蜂学学院）,福州 350000
³浙江中医药大学第二临床医院,杭州 310027

Protective Effects of Chinese Propolis Extract Against Lipopolysaccharide- Induced Acute Mastitis and Mammary Barrier Functions in Mice

SONG MeiJie^,1, OU AiQun^1,2, XUE XiaoFeng¹, WU LiMing¹, SHOU QiYang³, WANG Kai^,11Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093
²College of Animal Sciences (College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350000
³Second Clinical Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310027

通讯作者: 王凯,E-mail：kaiwang628@gmail.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2020-05-6接受日期:2020-11-25网络出版日期:2021-06-16

基金资助:

国家自然科学青年科学基金项目.31702287

Received:2020-05-6Accepted:2020-11-25Online:2021-06-16
作者简介 About authors
宋美洁,E-mail：17853483688@163.com。








摘要
【背景】奶牛乳腺炎是一种常见、多发的奶牛疾病,不仅危害奶牛健康,同时也造成重大经济损失。传统治疗奶牛乳腺炎的药物主要是抗生素,极易造成抗生素耐药与滥用。开发替代抗生素的方法用于奶牛乳腺炎的防治具有现实意义。蜂胶是西方蜜蜂采集植物树脂,混合自身上颚腺、蜡腺的分泌物形成的具有良好抗炎、抗菌活性的天然产物,对防治奶牛乳腺炎具有潜在开发利用价值。尽管近年来国内外有一些有关蜂胶防治乳腺炎方面的报道,但蜂胶如何影响乳血屏障功能,目前国内外尚无相关研究报道。【目的】利用细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导的小鼠急性乳腺炎模型,评估中国蜂胶乙醇提取物对小鼠急性乳腺炎的保护作用及其对乳腺细胞紧密连接蛋白表达的影响,为后续利用蜂胶防治奶牛乳腺炎的深入研究奠定理论基础。【方法】采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-QqQ-MS/MS）对中国蜂胶乙醇提取物中主要的多酚类化合物进行种类和含量测定。试验分为空白对照组、LPS模型组、中国蜂胶提取物试验组以及地塞米松阳性对照组。ICR雌性小鼠连续灌胃中国蜂胶提取物或阳性对照药物7d后,模型组、试验组和阳性对照组经第四、五对乳头管注射1 mg·kg^-1体重 LPS,建立小鼠急性乳腺炎模型,24 h后处死,收集乳腺组织样本。以苏木精-伊红（H.E）染色法、天狼星红染色法评估小鼠乳腺组织病理变化;利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定炎症因子释放量;利用荧光定量PCR测定小鼠乳腺组织中紧密连接蛋白（Occludin、Cluadin-1、ZO-1） mRNA的表达情况;最后利用免疫组化技术研究小鼠乳腺紧密连接蛋白（Occludin和ZO-1）表达和分布情况,利用以上指标综合评判中国蜂胶乙醇提取物的抗乳腺炎活性及其对乳腺紧密连接蛋白的影响。【结果】基于UHPLC-QqQ-MS/MS,建立了中国蜂胶乙醇提取物中主要的17种多酚类化合物的精确定量方法,检测结果表明含量最高的5种化合物及其含量分别为：高良姜素（12.88±0.57 μg·mg^-1）、短叶松素3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg^-1）、松属素（8.56±0.27 μg·mg^-1）和短叶松素（8.52±0.25 μg·mg^-1）。动物试验结果表明,灌胃中国蜂胶提取物能够显著缓解LPS注射导致的乳腺组织中炎性细胞浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤;同LPS组相比,中国蜂胶提取物灌胃处理可有效抑制LPS导致的小鼠乳腺组织中炎症因子（IL-1β,IL-6和IL-10）的释放,并可提高小鼠乳腺中紧密连接蛋白的mRNA表达,缓解LPS注射所导致的乳腺上皮细胞紧密连接的破坏。【结论】中国蜂胶提取物对脂多糖诱导小鼠乳腺炎具有良好的预防效果,并可有效促进乳腺紧密连接蛋白的表达,维持乳腺中紧密连接结构完整性,保护血乳屏障,但蜂胶对紧密连接影响调控的分子机理还需进一步深入研究。
关键词： 中国蜂胶;脂多糖;乳腺炎;血乳屏障

Abstract
【Background】 Dairy cow mastitis is a common and frequent dairy cow disease, which not only threatens the health of dairy cows, but also causes significant economic losses. The traditional medicine for the treatment of dairy cow mastitis is largely dependent on the usage of antibiotics, which easily caused antibiotic resistance/abuse. Therefore, it is with practical significance to develop an alternative approach of antibiotics for the prevention and treatment of mastitis in dairy cows. Propolis is a natural product with good anti-inflammatory and antibacterial activities. Propolis is collected by western honeybees from plant resin and mixing with bees’ maxillary gland and wax gland secretions. Accordingly, propolis has great potential for the prevention and treatment of mastitis in dairy cows. Despite that there have some previous reports on the prevention and treatment of mastitis using propolis, scant information is available on the effects of propolis on the breast blood barrier function. 【Objective】The aim of this study was to evaluate the protective effect of ethanol extract of Chinese propolis, EECP, against bacterial lipopolysaccharide- induced mouse acute mastitis, and we focused on its effect on the expression of tight junction proteins in mammary epithelial cells. This outcome of this study would lay a foundation for the in-depth study for the usage of propolis for prevention and treatment on dairy cow mastitis. 【Method】 The type and content of the main polyphenolic compounds in EECP were determined by ultra-performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-QqQ-MS/MS). Female ICR mice were divided into four groups, including the normal control group, model group (injecting LPS into the mammary gland, 1mg·kg^-1 b.w.), EECP group and positive control group (dexamethasone). The female mice were subjected to continuous gavage by EECP or positive control drugs for seven days. The LPS model group, EECP group and positive control group were injected with 1 mg·kg^-1 LPS through the fourth and the fifth pair of nipple tubes, to induce acute mastitis in mice. After 24 h, they were killed for collecting the mammary tissue samples. Hematoxylin-Eosin (HE) staining method and Sirius red staining method were used to evaluate pathological changes in mouse mammary tissue. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the release of inflammatory factors and quantitative real-time PCR was applied to determine mouse mammary tissue gene expressions of tight junction proteins (Occludin, Cluadin-1, ZO-1). Finally, the immunohistochemical technology was used to study the expression and distribution of mouse mammary tight junction proteins (Occludin and ZO-1). These above indicators were applied to comprehensively evaluate the anti-mastitis activity and its effect on mammary tight junction proteins by EECP. 【Result】 Based on UHPLC-QqQ-MS/MS, an accurate quantitative method was established for the 17 main polyphenolic compounds in EECP. The results showed that the five compounds with the higher content and their contents were: galangin (12.88 ±0.57 μg·mg^-1), 3-O-Acetylpinobanksin (12.93±0.59 μg·mg^-1), pinocembrin (8.56±0.27 μg·mg^-1) and pinobanksin (8.52±0.25 μg·mg^-1). Animal study results showed that after a week of regular oral administration of EECP reduced on the infiltrations of inflammatory cells in mammary gland under LPS stimulation, and the structural damages were alleviated by EECP. Moreover, Chinese propolis administration inhibited the overexpression of inflammatory factors (IL-1β, IL-6, IL-10) in mouse mammary gland tissue, and increased the transcription level of tight junction protein genes (Occludin, Claudin-1, ZO-1) mRNA, and enhanced the expression of tight junction protein Occludin, ZO-1. 【Conclusion】EECP showed good preventive effect against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice, with potent anti-inflammatory effects. It also increased the expressions of tight junction proteins in the mammary gland, which maintained the integrity of the tight junction structure in the mammary gland and protected the blood-milk barrier. Nevertheless, the molecular mechanism of Chinese propolis on the regulation of tight junctions needed to be clarified in the future research.
Keywords：Chinese propolis;lipopolysaccharide;mastitis;blood-milk barrier


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宋美洁, 欧爱群, 薛晓锋, 吴黎明, 寿旗扬, 王凯. 蜂胶提取物对脂多糖诱导小鼠急性乳腺炎及乳腺屏障功能的保护作用[J]. 中国农业科学, 2021, 54(12): 2675-2688 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.12.017
SONG MeiJie, OU AiQun, XUE XiaoFeng, WU LiMing, SHOU QiYang, WANG Kai. Protective Effects of Chinese Propolis Extract Against Lipopolysaccharide- Induced Acute Mastitis and Mammary Barrier Functions in Mice[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(12): 2675-2688 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.12.017


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0 引言

【研究意义】奶牛乳腺炎是由多种因素引起并严重影响奶牛业发展的重要疾病,造成了世界范围内乳业的巨大经济损失,如产奶量下降,牛奶品质降低,疾病治疗费用的增加等,至今尚未有彻底解决的办法^[1,2]。乳腺炎的发生取决于宿主、病原和环境因素的相互作用,而病原微生物侵染是导致奶牛乳腺炎的主要原因,其中环境性致病菌的危害尤以大肠杆菌感染突出,可导致奶牛食欲不振、死亡率升高等,严重损害奶牛群体健康^[3,4,5]。而大肠杆菌中的脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）可引起乳腺的严重炎症反应^[6],是大肠杆菌的关键毒力因子^[7]。当前,采用抗生素治疗奶牛乳腺炎而导致的细菌耐药性增强及抗生素残留,给人类健康带来巨大威胁^[8]。因此,有必要探索一种绿色、安全、高效的防治乳腺炎的方法。【前人研究进展】蜂胶是由西方蜜蜂（Apis mellifera L.）工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性物质,其富含酚酸和黄酮类化合物,具有多种生物学活性与药理作用^[9,10]。多种研究表明蜂胶可有效杀灭乳腺炎致病菌,可作为佐剂以增强疫苗的免疫力,且一些研究将蜂胶用于制作乳腺擦剂和乳头保护膜来抵御乳腺炎,已被应用于兽医临床^{[11,12,13,14]}。另一方面,乳腺上皮细胞间紧密连接结构形成的屏障结构是乳腺炎在发生过程中防止有害物质进入血液和选择性释放细胞因子进入乳汁腔的重要关卡,也是血液和乳汁腔内有机交互的关键,对于奶牛的泌乳启动、维持和退化均有重要意义^[15],血乳屏障功能主要依靠上皮细胞完整性及细胞间连接方式协同实现。紧密连接是构成血乳屏障完整结构的主要成分,其主要由咬合蛋白（occludin）、紧密连接蛋白（claudin-1）等连接而成,并与闭锁小带紧密连接蛋白-1（ZO-1）及细胞骨架蛋白直接或间接结合,形成稳定的连接结构,任何蛋白的丢失均可导致其结构完整性的破坏^[16]。【本研究切入点】尽管笔者前期研究证实蜂胶对于各种病原微生物引起的乳腺上皮细胞炎症有明显的改善作用^[11,17],但蜂胶抗乳腺炎的系统研究仍很匮乏,对抗乳腺炎的作用机制仍未清楚,特别是蜂胶与乳腺屏障功能和紧密连接间的作用机制也需在体内试验层面上进一步探究。系统挖掘蜂胶对乳腺炎的保护作用机制和药效物质基础,将对蜂胶在奶牛乳腺炎防治中的应用产生重大的指导意义。【拟解决的关键问题】富含生物活性化合物的低蜡蜂胶提取物最常用乙醇作为溶剂进行提取^[18,19,20]。此外,小鼠乳腺炎模型已被证明可模拟牛乳腺炎,并且可用于研究乳腺炎病原体在乳腺内感染的特异性宿主免疫应答,是一种有效、可重复的体内替代方法^[21,22]。故本次研究通过建立LPS诱导的小鼠乳腺组织炎性损伤模型,在明确中国蜂胶乙醇提取物中主要活性组分的基础上,从体内试验的层面上来探索、阐明中国蜂胶乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis, EECP）对LPS诱导乳腺炎的作用机制,以期为蜂胶在防治奶牛乳腺炎的应用上提供新的思路和潜在药物靶点,进一步并为后续研究提供理论依据。

1 材料与方法

动物试验于2019年10—11月在浙江中医药大学动物实验中心完成。其余试验于2019年7月至2020年1月、2020年10月在中国农业科学院蜜蜂研究所完成。

1.1 主要材料与试剂

蜂胶样品为中国杨树型蜂胶,于2017年11月采自山东省泰安市实验蜂场。

实验动物与饲养条件：动物试验在浙江中医药大学实验动物中心实施（试验设施执照为SYXK-JING- 2015-0046）。32只雌性 ICR 小鼠（10周龄,30—32 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物质量认证号为SCXK-JING-2016-0006）。8只/笼饲养于光照（12 h昼夜循环）和温度（20—23℃）稳定的房间内,并持续供应经过滤的无病原菌的空气,保持室内相对湿度为50%。小鼠自由采食饮水,饮食供应为商业化无污染（SPF级）饲料。试验严格遵守浙江中医药大学实验动物中心实验动物福利规章制度,并通过浙江中医药大学实验动物中心实验动物研究伦理学委员会批准执行。

主要试剂：咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、桑色素、咖啡酸苯乙基酯、柚皮素、芹菜素、柯因、杨梅素、槲皮素、高良姜素、松属素、香草酸、短叶松素、短叶松素三乙酸酯、3,4-二甲氧基肉桂酸、没食子酸、芦丁等标准品（美国Sigma 公司）;色谱纯甲醇、乙醇、乙腈（美国MREDA technology 公司）;脂多糖 （Lipopo1ysaccharide 来源于大肠杆菌 0111：B4,美国Sigma公司）;黄蓍胶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;无水乙醇、二甲苯、石炭酸 （国药集团化学试剂有限公司）;4%多聚甲醛、地塞米松（Dexamethasone, DEX）（北京索莱宝科技有限公司）;苏木素染液、伊红染液 （上海碧云天生物技术有限公司）、天狼星红染色液（杭州浩克生物科技有限公司）; Occludin 抗体 、ZO-1 抗体（美国Proteintech公司）;ELISA检测试剂盒（武汉华美生物有限公司）;DAB显色试剂盒（美国Abcam公司）;CarryHelix RNA 提取试剂盒（北京佳利恒达生物科技有限公司）、PrimeScript RT Master kit反转录试剂盒 、TB Green? Premix Ex Taq II试剂盒（日本Takara 公司）;RT-qPCR引物（生工生物工程技术服务有限公司）;一抗（Occludin、ZO-1）、羊抗兔二抗（HRP）（美国proteintech 公司）。

1.2 主要仪器

N-EVAP112氮吹仪购自美国Organomation公司;SY-2000旋转蒸发仪购自南京昕仪生物科技有限公司;KQ-500超声清洗仪购自杭州法特超声波科技有限公司;6470B UHPLC-QqQ-MS/MS购自美国Agilent公司;Milii-Q纯水机购自美国Millinpore公司;Nanodrop 2000型分光光度计、PCR扩增仪和荧光定量PCR仪均购自美国Thermo Fisher公司;DYY-6D型电泳仪购自上海华科实验器材有限公司;SpectraMax iD5酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司;微孔板恒温振荡仪购自上海虔钧科学仪器有限公司;组织脱水机购自北京世纪科信科学仪器有限公司;石蜡包埋机购自辅光精密仪器（上海）有限公司;石蜡切片机购自杭州艾普仪器设备有限公司;光学显微镜购自北京博恒远科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中国蜂胶乙醇提取物的制备 参考文献[23]的方法,将采集到的蜂胶敲碎,称取100 g的粗蜂胶粉末,加入 95% 乙醇1L,放在超声仪中40℃超声3 h,取出烧杯静置过夜后取上清。将获得的上清液旋转蒸发至恒重,放入冰箱中-20℃保存待用。

1.3.2 超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-QqQ-MS/MS）分析EECP多酚类化合物 采用超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对EECP中多酚类物质进行成分分析,在负离子模式下用色谱柱proshell 120 SB-C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm,2.7 μm）进行提取物分离。流动相由甲酸水（0.1% v / v）溶液（A）和乙腈（B）组成,流速为0.25 mL·min ^-1,40℃下梯度洗脱。梯度洗脱程序如下：0—1 min,5% B;1—6 min,5%—55% B;6—20 min,55%—95% B;20—27 min,95% B。进样体积为2 μL,后运行时间为3 min。质谱条件如下：气体温度为300℃;气体流速为11 L·min ^-1;喷雾器压力为40 psi;毛细管电压为3 500 v;鞘气温度为350℃;鞘气流速为10 L·min^-1。

使用Mass Hunter软件（版本B 8.0,Agilent Technologies）进行分析并获得LC-MS数据。试验重复3次,试验结果以平均值±标准差（mean±SD）表示。

1.3.3 小鼠乳腺炎模型建立 将32只ICR母鼠随机分为4组,每组8只,试验分组与设计如下：

空白对照组：灌胃7d黄蓍胶溶液（0.5%）,最后一天灌胃1 h后经呼吸麻醉机异氟烷气体,麻醉后进行仰卧保定,将其第四、五对乳区用75%的酒精进行消毒,用灭菌后的眼科剪剪去乳头尖端 1mm,暴露出乳导管,之后用圆钝型微量注射器吸取生理盐水缓慢注入到乳导管中,经注射处理后,置于笼中饲养24 h后,仰卧保定;摘除眼球处死,用75%的酒精对小鼠腹部进行消毒,收集乳腺组织;部分组织置于4%的多聚甲醛,剩余组织-80℃保存待用。处死前4 h最后一次灌胃0.5%的黄蓍胶溶液（图1）。

图1

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图1小鼠乳腺注射脂多糖

Fig. 1Mouse mammary lipopolysaccharide injection



模型组：灌胃7 d黄蓍胶溶液（0.5%）,最后一天灌胃1 h后经呼吸麻醉机异氟烷气体,麻醉后进行仰卧保定,将其第四、五对乳区用75%的酒精进行消毒,用灭菌后的眼科剪剪去乳头尖端1 mm,暴露出乳导管,之后用圆钝型微量注射器吸取LPS缓慢注入到乳导管中,经LPS（1 mg·kg^-1）注射处理后,置于笼中饲养24 h后,仰卧保定;摘除眼球处死,用75%的酒精对小鼠腹部进行消毒,收集乳腺组织;部分组织置于4%的多聚甲醛,剩余组织-80℃保存待用。处死前4 h最后一次灌胃0.5%的黄蓍胶溶液。

中国蜂胶乙醇提取物试验组：灌胃7 d 100 mg·kg^-1的中国蜂胶乙醇提取物,最后一天灌胃1 h后经呼吸麻醉机异氟烷气体,麻醉小鼠,第四、五对乳头管灌注1mg·kg^-1的LPS,24 h后处死,处死前4 h最后一次灌胃中国蜂胶乙醇提取物。

阳性对照组：灌胃7 d 5 mg·kg^-1的地塞米松（dexamethasone, DEX）,最后一天灌胃1 h后后经呼吸麻醉机异氟烷气体,麻醉小鼠,第四、五对乳头管灌注1 mg·kg^-1的LPS,24 h后处死,处死前4 h最后一次灌胃DEX。

1.3.4 乳腺病理切片的制作及观察 将乳腺组织从小鼠体内分离,立即用4%的多聚甲醛进行固定,12 h后换相同固定液,继续固定12 h,后石蜡包埋,切片。将制作好的石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗。

苏木精-伊红染色：将切片放入苏木素染液中染色20 min;用分化液分化30s;自来水浸泡15 min;用伊红染液复染2 min;用自来水浸泡2 min。用95%乙醇脱水2次,再用100%乙醇脱水2次,每次为1 min。经脱水后的切片放入二甲苯石炭酸（3﹕1）中1 min,再放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各1 min,用中性树胶封固,镜下观察。

天狼猩红染色液染色： 切片入饱和苦味酸天狼猩红染色液内染色8min,后将切片入无水酒精漂洗数分钟,用中性树胶封固,镜下观察。

1.3.5 乳腺组织炎症因子IL-1β、IL-6和IL-10的检测 称取小鼠乳腺组织100 mg,剪成小块放入1.5 mL的离心管中,按照ELISA试剂盒说明书要求进行操作。

1.3.6 乳腺组织紧密连接蛋白基因mRNA表达测定

（1）RNA提取 称取20 mg左右的乳腺组织,加600 μL的组织裂解液,用电动匀浆仪匀浆。将组织匀浆均匀接种到六孔板中,每个处理3个重复。先往组织匀浆中加入15 μg·mL^-1的EECP预处理2 h,接着加LPS（1 μg·mL^-1）处理12 h,收集处理好的组织。参考王蓓等^[25]的方法,采用 CarryHelix RNA 提取试剂盒进行乳腺组织总RNA的提取。

（2）cDNA合成 按照 PrimeScript RT Master kit 反转录试剂盒要求操作加样,反应体系如表1所示。 37℃反应15 min、85℃反应5 s,反转录的cDNA保存在-20℃。

Table 1
表1
表1RNA反转录反应体系
Table 1RNA reverse transcription reaction system

试剂 Re agent	体积 Volume (μL)
PrimeScript RT Enzyme Mix	2
Total RNA	2
RNase Free DH2O	加至10 Add up to 10

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（3）引物设计与合成 试验所用引物均由上海生工生物有限公司合成,引物序列信息见表2。

Table 2
表2
表2实时荧光定量PCR相关引物序列
Table 2The primer sequence of related genes in RT-qPCR

基因 Genes	引物序列 Primer sequence （5′-3′）	产物长度 Product length (bp)
Occludin	F: TCTGCTTCATCGCTTCCTTAG R: GTCGGGTTCACTCCCATTA	160
ZO-1	F: ACTCCCACTTCCCCAAAAAC R: CCACAGCTGAAGGACTCACA	166
Cluadin-1	F: AGACCTGGATTTGCATCTTGGTG R: TGCAACATAGGCAGGACAAGAGTTA	126
GAPDH	F: GAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC R: TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG	212

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（4）荧光定量PCR 以cDNA为模板,按照 TB Green? Premix Ex Taq II试剂盒要求操作加样,反应体系如表3所示。以GAPDH作为管家基因,利用相对定量（ΔΔCт）法进行基因相对表达量的计算。

1.3.7 乳腺组织紧密连接蛋白免疫组织化学染色 病理切片的制作参照1.3.4,-20℃冷冻保存。取出切片室温放置30 min,丙酮固定30 min,用PBS清洗;用3% H₂O₂甲醇液孵育30 min,然后,PBS清洗;用一抗工作液（Occludin：1﹕100;ZO-1﹕1﹕50）37℃孵育1 h后4℃过夜;PBS清洗,用二抗工作液（1﹕1 000）37℃ 孵育1 h;PBS清洗,滴加辣根酶标记链霉卵白素,在37℃下孵育30 min;PBS清洗,用DAB试剂显色;最后,脱水,透明,中性树胶封闭,在显微镜下拍照观察。

Table 3
表3
表3实时荧光定量PCR反应体系
Table 3Real-time fluorescent quantitative PCR reaction system

成分 Components	体积 Volume (μL)
TB green	5
PCR上游引物 Forward primers	0.2
PCR下游引物 Reverse primers	0.2
cDNA	0.2
ddH2O	4.4
Total	10

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1.4 数据处理与分析

结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示,利用one-way ANOVA法进行数据差异显著性分析,经统计分析软件SPSS 21.0处理数据并作图。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC- QqQ-MS/MS）分析多酚类化合物方法学评价

蜂胶提取物中的功能活性成分与多酚类化合物的种类和含量相关,试验首先基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-QqQ-MS/MS）,对色谱条件及质谱参数进行了优化,建立了相应的液相色谱串联质谱方法,具体试验参数详见1.3.2。通过添加回收率来验证方法准确性。在 5、10、20 μg·mg^-1共3个添加水平下,进行蜂胶提取物的添加回收试验,结果表明：蜂胶提取物中17种多酚类化合物的添加回收率在70.2%—120.1%范围内（表4）,可实现EECP中多酚类成分的精确定量。

Table 4
表4
表4中国蜂胶乙醇提取物中代表性多酚类化合物的回收率和精密度
Table 4Recoveries and precisions of the 17 polyphenols in Chinese poplar propolis

多酚类化合物 Polyphenolic compound	平均回收率（RSD,n=5） Recovery rate (RSD, n-5) (%)
咖啡酸Caffeic Acid	100.6-105.6（1.35-3.87）
p-香豆酸 p-Coumaric acid	84.6-96.3（0.70-2.10）
阿魏酸 Ferulic Acid	92.7-100.4（1.42-3.90）
咖啡酸苯乙酯 Caffeic acid phenethyl ester	83.2-101.7（0.96-2.89）
芹菜素 Apigenin	86.8-93.4（0.62-3.13）
柯因Chrysin	90.3-97.8（0.93-1.91）
槲皮素 Quercetin	95.9-98.1（1.01-3.15）
高良姜素 Galangin	98.2-117.4（1.23-1.49）
桑色素 Morin	70.2-91.7（2.02-6.30）
松属素 Pinocembrin	104.5-120.1（0.61-1.73）
短叶松素 Pinobanksin	99.1-100.4（0.45-5.11）
芦丁Rutin	78.3-85.7（2.03-4.12）
短叶松素三乙酸酯 Pinobanksin-3-acetate	96.6-111.2（3.13-6.12）
杨梅素 Myricetin	74.6-80.8（2.87-4.40）
香草酸 Vanillic acid	81.5-94.2（0.61-3.16）
柚皮素 Naringenin	105.2-113.0（0.71-2.72）
3,4-二甲氧基肉桂酸 3,4-Dimethoxycinnamic acid	99.4-102.6（0.99-4.67）

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2.2 UHPLC-QqQ-MS/MS法测定中国蜂胶乙醇提取物中主要多酚类成分

课题组前期采用福林酚法和硝酸铝法测定EECP中总酚酸和总黄酮含量,测得该中国山东杨树型蜂胶乙醇提取物中总酚酸含量为106.35 mg GAE·g^-1,总黄酮含量为320.85 mg RE·g^{-1 [17]}。本研究进一步利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱对EECP中主要的化学成分进行分析,结果如表5所示,EECP中的多酚类成分主要包括咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、柯因、高良姜素、松属素、短叶松素、3, 4-二甲氧基肉桂酸以及短叶松素三乙酸酯,其中又以高良姜素（12.88±0.57 μg·mg^-1）、短叶松素3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg^-1）、松属素（8.56±0.27 μg·mg^-1）和短叶松素（8.52±0.25 μg·mg^-1）的含量最高。

Table 5
表5
表5中国蜂胶乙醇提取物中主要的多酚类物质成分
Table 5Major polyphenolic constituents in EECP

多酚类化合物 Polyphenolic compound	分子式 Molecular formula	保留时间 Rt (min)	母离子 Parention	含量 Content (μg·mg-1)
咖啡酸Caffeic Acid	C9H8O4	5.487	179.035	3.23±0.03
p-香豆酸 p-Coumaric acid	C9H8O3	6.109	163.0401	-
阿魏酸 Ferulic Acid	C10H10O4	6.304	193.0506	-
咖啡酸苯乙酯 Caffeic acid phenethyl ester	C17H16O4	9.503	283.0976	2.49±0.06
芹菜素 Apigenin	C15H10O5	7.718	269.0455	1.68±0.08
柯因Chrysin	C15H10O4	9.363	253.0506	7.71±1.01
槲皮素 Quercetin	C15H10O7	7.225	301.0354	1.51±0.05
高良姜素 Galangin	C15H10O5	9.547	269.0455	12.88±0.57
桑色素 Morin	C15H10O7	6.919	301.0354	-
松属素 Pinocembrin	C15H12O4	9.461	255.0663	8.56±0.27
短叶松素 Pinobanksin	C15H12O5	8.000	271.0612	8.52±0.25
芦丁Rutin	C27H30O16	5.599	609.1461	-
短叶松素三乙酸酯 Pinobanksin-3-acetate	C17H14O6	9.609	313.0718	12.93±0.59
杨梅素 Myricetin	C15H10O8	6.580	317.0303	0.81±0.06
香草酸 Vanillic acid	C8H8O4	5.597	167.035	0.72±0.01
柚皮素 Naringenin	C15H12O5	7.767	271.0612	-
3,4-二甲氧基肉桂酸 3,4-Dimethoxycinnamic acid	C11H12O4	7.120	207.0663	3.49±1.23

“-”表示测定结果低于检测限
Indicates that the determination result is below the detection limit

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2.3 中国蜂胶乙醇提取物对LPS诱导小鼠乳腺炎乳腺组织病理变化的影响

中国蜂胶乙醇提取物对LPS诱导小鼠乳腺炎乳腺组织病理切片观察结果如图2、3所示,H.E染色结果表明,对照组乳腺组织腺泡结构完整,无肉眼可见的病理变化,乳腺管和腺泡中没有观察到嗜中性粒细胞、巨噬细胞浸润。LPS处理组可观察到乳腺组织腺泡结构完整性遭到破坏,且伴随有炎性细胞的浸润。与LPS处理组相比,中国蜂胶乙醇提取物处理组和阳性对照组能够有效减轻LPS刺激下的炎性症状,如腺泡结构、大小较为正常,炎性细胞浸润乳腺管和腺泡的数量减少。利用天狼星红染色可见,乳腺管等胶原纤维被染成红色,肌纤维被染成黄色,LPS刺激导致胶原阳性细胞数量减少,即药物处理可有效提示胶原染色阳性细胞数量。这些结果也清楚说明中国蜂胶乙醇提取物对LPS诱导的小鼠乳腺细胞炎症病理变化具有显著的保护作用。

图2

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图2苏木精-伊红染色检测细菌脂多糖（LPS）诱导小鼠乳腺组织病理改变

A：空白对照组;B：脂多糖注射模型组;C：阳性对照（地塞米松）组;D：中国蜂胶乙醇提取物处理组。图3、6、7同
Fig. 2Histopathological changes of mouse mammary glands induced by LPS based on H&E staining (×100)

A: Normal control group; B: LPS injection model group; C: Positive control (Dexamethasone) group; D: Chinese propolis ethanolic extract treatment group. The same as Fig.3, Fig.6 and Fig.7

图3

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图3天狼星红染色检测细菌脂多糖（LPS）诱导小鼠乳腺组织病理改变

Fig. 3Histopathological changes of mouse mammary glands induced by LPS based on picrosirius red staining (×100)

2.4 中国蜂胶乙醇提取物对LPS诱导小鼠乳腺炎组织中炎症因子表达的影响

利用ELISA法对LPS诱导小鼠乳腺炎乳腺组织中炎症因子的表达量进行检测。由图4可知,LPS处理组乳腺组织中IL-1β, IL-6和IL-10的表达量显著高于空白对照组（P＜0.05）,而连续灌胃一周中国蜂胶乙醇提取物的小鼠乳腺组织中,其炎症因子的表达水平显著低于LPS处理组（P＜0.05）。此外,阳性对照组与LPS处理组相比,对炎症因子的抑制作用优于中国蜂胶乙醇提取物处理组;单因素差异分析发现,与阳性对照组相比,EECP处理组未表现出显著差异（P＞0.05）。以上的结果说明,中国蜂胶乙醇提取物能够抑制LPS刺激小鼠乳腺组织中炎症因子的释放。

图4

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图4ELISA法检测乳腺炎小鼠乳腺组织中炎症因子的表达量

同行数据后所标字母相异表示差异显著（P＜0.05）,所标字母相同表示差异不显著（P＞0.05）。图中数据为平均值±标准差,采用单因素方差分析。图5同
Fig. 4Inflammatory cytokines in the mammary gland with mastitis by ELISA

Data in the figure are the mean±SD, One-way ANOVA. * Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P＜0.05), same letter in the same row means not significant difference between treatments (P＞0.05). The same as Fig.5

2.5 中国蜂胶乙醇提取物对乳腺组织紧密连接蛋白mRNA转录水平的影响

由图5可得,与空白组相比,LPS处理组显著降低了乳腺组织中紧密连接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1 mRNA的转录水平（P＜0.05）。对检测连续灌胃一周100 mg·mL^-1 EECP小鼠其乳腺组织中紧密连接蛋白基因Occludin、Cluadin-1 、ZO-1 mRNA的转录水平显著高于LPS处理组（P＜0.05）。此外,阳性对照组（DEX处理组）与LPS处理组相比,紧密连接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1 mRNA的转录量也显著上升（P＜0.05）。而中国蜂胶提取物试验组（EECP处理组）与阳性对照组（DEX处理组）的紧密连接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1 mRNA的转录量差异不显著,且其效果与阳性药物地塞米松（5 mg·kg^-1）相类似。

图5

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图5中国蜂胶乙醇提取物对紧密连接蛋白mRNA转录水平的作用

Fig. 5Effect of EECP on mRNA transcription levels of tight junction genes

2.6 中国蜂胶乙醇提取物对乳腺组织紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达的影响

对免疫组化结果（图6,7）分析可得,在正常的乳腺组织中Occludin和ZO-1定位于细胞膜上,且细胞之间的紧密连接结构完整。但经乳头管灌注1 mg·kg^-1的LPS后两种蛋白的表达量显著下降,细胞边界变模糊且细胞间的空隙变大。与LPS处理组相比,中国蜂胶乙醇提取物处理组跟DEX处理组乳腺组织中两种紧密连接蛋白的表达量增加,细胞边界变得清晰,细胞结构也较为完整。结果表明,中国蜂胶乙醇提取物能够有效减弱LPS降低乳腺组织中紧密连接蛋白表达的作用效果,进而达到保护乳腺组织紧密连接的作用。

图6

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图6中国蜂胶乙醇提取物对紧密连接蛋白Occludin表达的影响

Fig. 6IHC analysis on the Occludin expression of mouse mammary glands induced by LPS (×100)

图7

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图7中国蜂胶乙醇提取物对紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

Fig. 7IHC analysis on the ZO-1 expression of mouse mammary glands induced by LPS (×100)

3 讨论

近年来,本课题组一直致力于蜂胶在预防或治疗炎症性疾病方面的研究^{[11,17,23-27]}。植物化学成分分析研究结果表明,本研究所使用的中国蜂胶乙醇提物（EECP）中主要活性组分包括柯因、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、槲皮素和松属素等多酚类化合物,此结果与前期有关蜂胶化学组成的研究报道基本一致^[11,28-29]。这也为后续进一步研究单一组分对奶牛乳腺炎的预防治疗作用及相关药物研制提供参考。

乳腺炎是由乳房组织感染引起的炎症反应,造成乳腺组织感染的因素复杂多样,主要包括有外界刺激、生活环境、病原微生物和乳腺组织遭到机械损伤,而绝大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺组织引起^[1,3]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成成分,据报道,LPS刺激乳腺组织后,会造成腺泡上皮细胞脱落、形状和大小发生改变,并伴随有炎性细胞（中性粒细胞）的大量浸润以及乳腺组织发生充血,前人研究发现,灌胃高剂量蒲公英甾醇可使大鼠乳腺组织中乳腺腺泡上皮细胞脱落、组织出血等状况显著改善^[30]。在本研究中,乳腺组织病理切片结果表明,EECP同样能够显著减轻LPS诱导小鼠乳腺组织所引起的腺泡结构破坏及炎性细胞浸润等病理损伤,表明EECP具有良好的抗乳腺炎效果。

此外,细胞因子是细胞间信息交换的关键信使分子,参与调节免疫稳态和炎症反应。大量研究表明,蜂胶中的多酚类化合物能够显著抑制LPS刺激下乳腺组织中炎症因子的表达^[31,32]。而本研究中乳腺组织上清ELISA检测结果表明,EECP可显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6和IL-10的表达。故本研究进一步证实了EECP可通过减轻乳腺组织病理损伤和降低炎症因子的表达来达到保护小鼠免受LPS侵害的作用。

上皮和内皮屏障的完整性是体内平衡所必需的,它是由称为紧密连接的细边缘结构维持的。在危重症疾病中,紧密连接可能被破坏,导致屏障功能障碍,表现为毛细血管渗漏、肺水肿和多器官衰竭等。咬合蛋白存在于上皮和内皮之间的紧密连接中,是第一个被鉴定的完整膜紧密连接蛋白^[33]。众多研究表明咬合蛋白对紧密连接功能至关重要：咬合蛋白在Madin-Darby犬肾脏（MDCK）细胞中的过表达可增强跨上皮电阻^[34];在敲除了咬合蛋白的小鼠中,发现紧密连接自身形态未受影响,经检测其肠上皮屏障功能正常;然而,在胃、脑、肺以及睾丸等组织中发现了异常;结果表明咬合蛋白在维持紧密连接稳定和屏障功能正常等过程中发挥重要作用^[35]。通常情况下,咬合蛋白的表达量一旦降低会造成血脑屏障、血睾屏障、肺上皮屏障以及肠上皮屏障等的破坏,继而引发多种疾病的发生^[36]。ZO-1 即闭锁小带蛋白1,也是构成紧密连接的重要结构蛋白之一。它是膜相关信号分子家族的成员,可以充当分子支架,将跨膜蛋白组织到离散的质膜结构域,如上皮细胞间连接和神经突触^[37]。其次,紧密连接蛋白Claudins是构成紧密连接复合物的主要成分,它的异常表达可导致上皮细胞、内皮细胞的结构破坏及功能受损^[38]。在本研究中,EECP处理组可显著提升紧密连接蛋白基因（Occludin、ZO-1、Cluadin-1）mRNA的转录水平。基于荧光定量分析的结果,采用免疫组化实验方法对Occludin和ZO-1蛋白进行定位和定量分析,发现EECP组能显著增强紧密连接蛋白在细胞膜的分布和表达。课题组前期通过体外细胞试验证明,EECP可抑制炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达,上调乳腺上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的转录量并增加其在细胞间的分布^[17];桑色素已被证明能显著降低LPS诱导的TNF-α, IL-1β, IL-6, CCL2和CXCL2 mRNA的表达,并抑制LPS降低的Claudin-3、Occludin的表达^[39],本试验结果与之相一致。综合以上研究结果表明,EECP能显著减轻LPS刺激所引起的乳腺组织紧密连接的破坏,证实了EECP对血乳屏障具有良好的保护作用。

4 结论

蜂胶作为一种动植物双源性天然物质,具有包括抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性^[40],本研究表明,中国蜂胶乙醇提取物对细菌内毒素LPS诱导的小鼠乳腺炎具有良好的作用效果,具有替代传统抗生素应用于奶牛乳腺炎防治的潜力。灌胃中国蜂胶提取物能够显著缓解LPS注射导致的小鼠乳腺组织中炎性细胞浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤;同LPS组相比,中国蜂胶提取物灌胃处理可有效抑制LPS导致的小鼠乳腺组织中炎症因子的释放,并可提高小鼠乳腺中紧密连接蛋白的mRNA表达,缓解LPS注射所导致的乳腺上皮细胞紧密连接的破坏。基于本研究结果,未来可进一步深入探索蜂胶抗乳腺炎的作用机理,这也将全面揭示蜂胶对乳腺炎的保护作用,并为蜂胶在制备奶牛乳腺炎预防药品和开发蜂胶饲料添加剂中的实际应用提供理论指导。

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