赵文华^1,2, 王桂瑛^1,2, 荀文^1,2, 俞媛瑞^1,2, 葛长荣^,2, 廖国周^,21 云南农业大学食品科学技术学院,昆明 650201
2 云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,昆明 650201

Selection of Water-Soluble Compounds by Characteristic Flavor in Chahua Chicken Muscles Based on Metabolomics

ZHAO WenHua^1,2, WANG GuiYing^1,2, XUN Wen^1,2, YU YuanRui^1,2, GE ChangRong^,2, LIAO GuoZhou^,21 College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201
2 Livestock Product Processing and Engineering Technology Research Center of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201

通讯作者: 廖国周,E-mail: liaoguozhou@ynau.edu.cn 葛长荣,E-mail: gcrzal@126.com

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2019-10-17接受日期:2020-02-1网络出版日期:2020-04-16

基金资助:

云南省科技计划项目重大科技专项.2016ZA008 云南省科技计划项目国际科技合作专项.2018IA101 云南农大学第十二届学生科技创新创业基金.2019ZKY350

Received:2019-10-17Accepted:2020-02-1Online:2020-04-16
作者简介 About authors
赵文华,E-mail: 598363924@qq.com。








摘要
【目的】利用代谢组学结合多元统计学方法筛选热处理前后茶花鸡胸肌和腿肌中的生物标志物,旨在明确表征茶花鸡不同部位肌肉中特征风味的水溶性化合物,为建立优质地方鸡评价标准提供科学理论依据。【方法】以300日龄的云南茶花鸡为研究对象,采用液相色谱-四极杆静电场轨道阱-质谱法（LC-Q-Exactive-MS）检测热处理前后胸肌和腿肌中的水溶性化合物,基于数据库Metlin进行全谱鉴定,以2-氯苯丙氨酸浓度计算各物质相对含量,并对检测出的物质进行分析,利用正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）建立代谢物表达量与样本组之间的关系模型,来实现对样品类别的预测,通过S-plot图初步筛选具有代表性的生物标志物,观察置换200次检验图的直线斜率判定模型是否存在过拟合现象,并且通过计算变量投影重要度（variable important for the Projection,VIP）判别各代谢物表达模式下对各组样本分类判别的影响强度和解释能力,达到辅助筛选标志物的目的;通过相对含量结果计算滋味活性值（taste activity value,TAV）,结合感官评定结果评价茶花鸡肌肉的特征风味。【结果】茶花鸡肌肉在质谱正离子和负离子模式下,分别检测出106种和43种生物代谢物,其中主要成分包括氨基酸类、维生素类、核苷类、有机酸类、脂肪酸类等,其中肌酸、肌肽、氨基酸和核苷酸为茶花鸡肌肉热处理前后存在的差异性水溶性化合物,可作为特征滋味贡献物质的生物标志物;TAV值结果中显示,胸肌中TAV值最大的是γ-氨基丁酸（TAV=23.00）,其次是组氨酸（TAV=1.14）;腿肌中TAV值最大的是γ-氨基丁酸（TAV=37.50）,其次是甜菜碱（TAV=2.00）;通过感官评定发现胸肌和腿肌整体滋味以甜鲜味为主。【结论】利用代谢组学分析得出茶花鸡特征滋味物质,并结合滋味理论值和感官评定值确定茶花鸡胸肌和腿肌的整体滋味以甜鲜肉香味为主,且腿肌优于胸肌。
关键词： 茶花鸡;肌肉;液相色谱-四极杆静电场轨道阱-质谱法（LC-Q-Exactive-MS）;代谢组学;水溶性化合物

Abstract
【Objective】 The biomarkers in the chest and thigh muscles of Chahua Chicken before and after heat treatment were screened by using metabolomics combined with multivariate statistical methods, the aim of this study was to screen and characterize water-soluble compounds in different parts of Chahua Chicken, so as to provide scientific and theoretical basis for establishing evaluation standards of high-quality local chicken.【Method】Using liquid chromatography-quadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry (LC-Q-Exactive-MS) and 300-day-old Yunnan native Chahua Chicken, the water-soluble compounds in the chest and thigh muscles before and after heat treatment were tested. Also, the spectrum was identified based on the network database Metlin, the relative content of each substance were calculated by the concentration of DL-o-Chlorophenylalanine, and the multivariate statistical analysis was used to detect substances. The relationship model between metabolite expression and sample groups was established by using orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) to predict the sample category. The representative biomarkers was screened by S-plot to determine whether the model had over-fitting by observing the slope of the line of the 200 test plots of the permutations, and to discriminate the influence intensity and interpretation ability of each metabolite expression pattern on the classification and discrimination of each group of samples by the variable important of the projection (VIP). Therefore, the study achieved the purpose of screening markers: combining the calculation for Taste Activity Value (TAV) by relative content results with sensory evaluation results evaluate the characteristic flavor of Chahua Chicken muscles.【Result】The results showed that 106 species and 43 metabolites were detected in the chest and thigh muscles of Chahua Chicken before and after heat treatment in the positive ion mode and the negative ion mode, including amino acids, vitamins, nucleotides, organic acids, and fatty acids. Among them, creatine, carnosine, amino acid, and nucleotide were water-soluble compounds which had differences between before and after heat treatment of Chahua Chicken muscles, which could be used as a biomarker for the characteristics of the tribute. The TAV value results showed that the largest TAV value in the chest muscles was gamma-aminobutyric acid (TAV=23.00), and the followed by Histidine (TAV=1.14). The highest TAV value in the thigh muscles was gamma-aminobutyric acid (TAV=37.50), and the followed by Betaine (TAV=2.00). Through sensory evaluation, it was found that the overall taste of the chest muscles and thigh muscles was mainly sweet and umami.【Conclusion】After metabolomics analysis, the characteristic taste substances were obtained, and through the taste theory and sensory evaluation values, the study determined that the taste of the breast and leg muscles of Chahua chicken was mainly sweet and fresh meat, and the leg muscles were superior to the chest muscles.
Keywords：Chahua Chicken;muscles;liquid chromatography-quadrupole electrostatic field orbitrap-mass spectrometry (LC- Q-Exactive-MS);Metabonomics;water-soluble compound


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本文引用格式
赵文华, 王桂瑛, 荀文, 俞媛瑞, 葛长荣, 廖国周. 基于代谢组学筛选表征茶花鸡肌肉中特征风味的水溶性化合物[J]. 中国农业科学, 2020, 53(8): 1627-1642 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.012
ZHAO WenHua, WANG GuiYing, XUN Wen, YU YuanRui, GE ChangRong, LIAO GuoZhou. Selection of Water-Soluble Compounds by Characteristic Flavor in Chahua Chicken Muscles Based on Metabolomics[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(8): 1627-1642 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.012

0 引言

【研究意义】随着生活水平不断提高,人们从以往追求肉制品的安全、营养到如今对肉制品的种类多样化和风味品质的可口性需求占主导地位。肉品的风味主要由滋味和气味构成,气味成分主要是鸡肉在加工过程中由美拉德反应、脂肪氧化、硫胺素降解等产生的挥发性风味物质。而滋味是由肉中水溶性化合物及烹饪过程中发生系列复杂的化学反应形成的挥发性化合物组成,是鸡肉食用品质的特征指标,这类水溶性化合物小分子可以与人体口腔味蕾相互作用产生味感,因此,只有水溶性化合物能反映出食物的滋味变化。鸡肉在加热过程中有多种非挥发性化合物,是产生鸡肉特殊滋味的关键,主要由肽类物质、氨基酸及衍生物、核苷酸、肌酸、糖类和维生素类等物质构成,因此鸡肉中水溶性小分子化合物的种类及数量决定了鸡肉特殊的滋味,对肉品最后的风味形成起关键作用。对于肉品风味前提物质与肉品风味的关系,目前观点是,肉香特征主要来自瘦肉中水溶性化合物前体物中的含硫含氮化合物和脂肪热降解发生的氧化反应产物^[1];美拉德反应中还原糖与氨基酸之间发生的复杂反应产生的风味物质对整体风味的作用^[2]。鸡肉的鲜味主要来自如肌苷酸、氨基酸等水溶性前体物质。有研究认为,滋味前提物质在口腔内只有溶于唾液且能刺激味觉细胞最终才能产生滋味^[3,4],因此,水溶性化合物是肉品产生滋味的重要前提物质。【前人研究进展】国内外****对鸡肉进行了大量研究,其研究对象主要是CB-32商业肉鸡、Woorimatdag韩国本土鸡、Ross-308肉鸡、Avian鸡和AA鸡等快大型肉鸡^[5,6,7,8,9],研究表明,鸡肉中的鲜味成分来自水溶性前体物,如肌苷酸（IMP）和谷氨酸^[10]。JAYASENA等^[11]研究表明鸡的品种、饲养和烹饪条件等因素也会影响与滋味有关的水溶性化合物含量。云南茶花鸡是国家二级保护动物,在“六五”期间畜禽品种资源调查时被发现的特有珍惜小型原始鸡种,是由当地红色原鸡和野鸡经长期驯化选育而成的热带珍惜小型原始品种,其肉质鲜嫩,滋味鲜美,是云南省有名的“六大”名鸡之一,主要生活在南部边缘的热带雨林、季雨林等植被类型的地区,属于蛋肉兼用型品种。近年来,对于茶花鸡的研究主要集中在肉质理化特性与遗传特性方面^{[12,13,14,15]},对其肉质特性方面的研究欠缺。【本研究切入点】肉类的风味是热衍生的,烹饪对肉中几种与滋味相关的水溶性化合物含量的影响,可以被认为是肉类风味中最具影响力的因素^[11]。目前,我国关于云南茶花鸡产品缺少国家标准,市场上现有茶花鸡鸡肉产品没有执行统一标准,造成消费者难以判断其品质的优劣;另外,茶花鸡肌肉中表征特征风味相关的水溶性化合物与品质特性还有待进一步研究。【拟解决的关键问题】通过对云南茶花鸡不同部位肌肉进行热处理,以液相色谱-四极杆静电场轨道阱-质谱法（LC-Q-Exactive-MS）检测茶花鸡肌肉中的水溶性化合物,并分析热处理前后茶花鸡腿肌及胸肌中水溶性化合物的差异,探讨对滋味贡献较大的水溶性化合物,为茶花鸡的肉质特性研究和开发利用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验采用的茶花鸡,同一养殖条件下同一批次的300日龄的茶花鸡共60只,随机选取6只（3只公鸡和3只母鸡）,经屠宰后取其胸肌和腿肌并去除可见脂肪和筋膜组织后作为试验样品。乙腈色谱纯,德国Merck公司;甲醇色谱纯,德国Merck公司;超纯水,德国Merck公司;甲酸色谱纯,上海斯信生物科技有限公司;2-氯苯丙氨酸色谱纯,吉尔生化（上海）有限公司。

LICHEN移液枪,杭州利辰科技有限公司;BS224S电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;XMTD-4000电热恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器有限公司;TGL-16K离心机,湖南湘仪实验室仪器有限公司;VOTEX-5涡旋仪,其林贝尔有限公司;SCIENTZ-18N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Thermo, Ultimate 3000LC-Q-Exactive液相色谱-质谱联用仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将修整后的12块胸肌和12块腿肌进行随机分组,6个胸肌和6个腿肌不进行热处理作为对照组;其余的6个胸肌和6个腿肌分别放入蒸煮袋中,参考温斯颖^[16]的处理方法,在电热恒温水浴锅中沸水煮3 h至熟透^[17],放置常温后与原料肉一起置于-80℃下备用。LC-MS试验于2019年2—4月在上海敏心生物科技有限公司进行,感官评定试验于2019年2月在云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心感官品鉴室进行。

1.2.2 样本制备 称取50 mg样本,加入800 μL甲醇和10 μL内标（DL-o-Chlorophenylalanine浓度：2.8 mg∙mL^-1）;将样本置于组织研磨仪中65 Hz条件下研磨90 s;冰浴超声30 min,-20℃静置1 h;随后将样本在4℃离心机中,12 000 r/min离心15 min;离心结束后,取200 μL上清液,转入进样小瓶中待检。

1.2.3 LC-MS分析过程 仪器分析平台：LC- MS（Thermo, Ultimate 3 000LC, Q Exactive）;色谱柱：C₁₈色谱柱（Hyper gold C18（100 mm×2.1 mm,照1.9 μm）;色谱分离条件为：柱温40℃;流速0.35 mL∙min^-1;流动相组成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸,B：乙腈+0.1%甲酸;进样量为10 μL,自动进样器温度4℃。

1.2.3.1 流动相梯度洗脱程序见表1。

Table 1
表1
表1流动相洗脱程序
Table 1The gradient of mobile phase

时间 Time (min)	流速 Flow rate (mL∙min-1)	A (%)	B (%)
0	0.3	100	0
0	0.3	100	0
1.5	0.3	80	20
9.5	0.3	0	100
14.5	0.3	0	100
14.6	0.3	100	0
18	0.3	100	0

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1.2.3.2 质谱检测参数：

正模式：加热器温度300℃;鞘气流速：45 arb;辅助气流速：15 arb;尾气流速：1 arb;电喷雾电压：3.0 kV;毛细管温度：350℃;S-Lens RF Level：30%。

负模式：加热器温度300℃;鞘气流速：45 arb;辅助气流速：15 arb;尾气流速：1 arb;电喷雾电压：3.2 kV;毛细管温度：350℃;S-Lens RF Level：60%。

1.2.4 感官评价 参考ZHONG等^[18]的方法并稍作修改,采用品尝法对茶花鸡的滋味进行评价。鸡肉的滋味由10名年龄在22—27岁的感官评定人员根据相关评分标准进行白味品尝后评价打分。感官评价标准按照滋味由淡到浓依次排列并打分,似有似无：0—1分,浓淡相宜：2—3分,浓：4—5分。

1.3 数据处理与分析

从LC-Q-Exactive-MS分析仪将采集到的信号和质谱数据导出,使用Compound Discoverer软件（Thermo公司）对导出的数据进行提取和预处理,基于数据库Metlin进行全谱鉴定,并在Microsoft Office Excel 2010软件中对数据进行归一化及后期编辑,以2-氯苯丙氨酸浓度计算各物质相对含量;并以SIMCA14.1（瑞典Umetrics AB公司）进行多元统计学分析;利用SPSS19.0进行方差分析;利用Origin软件绘制感官雷达图。

2 结果

2.1 茶花鸡肌肉样品的总离子流色谱图

图1是C₁₈色谱柱对样品进行测定的单个样本离子流图,对其信号和质谱数据进行提取和预处理,同时进行全谱鉴定,报告代谢物名称理论质量和观察到的质量之间的差异小于10 ppm。在正离子模式和负离子模式下300日龄的茶花鸡胸肌和腿肌中分别共检测出106种和43种代谢物（表2和表3）,主要包括氨基酸类、维生素类、核苷类、有机酸类、脂肪酸类、脂质类等。

图1

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图1茶花鸡肌肉单个样本的离子流色谱图

Fig. 1A Total ion chromatogram of the muscles samples of Chahua chicken



Table 2
表2
表2正离子模式下肌肉样本代谢产物
Table 2Metabolites of muscles samples in positive ion mode

编号 No.	代谢物 Metabolite	编号 No.	代谢物 Metabolite	编号 No.	代谢物 Metabolite
1	肌酸 Creatine	501	氨基丁酸 gamma-Aminobutyric acid	1156	黄嘌呤 Xanthine
3	L-鹅肌肽 L-Anserine	517	泛酸 Pantothenic Acid	1213	α-亚麻酸 α-Linolenic Acid
11	肌酐 Creatinine	525	L-异亮氨酸 L-Isoleucine	1236	高香草基酸Homovanillic acid
13	左旋肉碱 L-Carnitine	546	磷酸胆碱Phosphocholine	1259	鸟嘌呤 Guanine
15	甜菜碱 Betaine	553	5'-甲基硫腺苷 5'-Methylthioadenosine	1296	聚氧乙烯辛烷基苯酚醚 9-OxoODE
37	乙酰肉碱 Acetylcarnitine	557	鞘氨醇 Sphingosine	1308	烟酰胺 Niacinamide
44	N-[4-(乙酰基氨基)苯基]-3-氧代丁酰胺 Hydrouracil	561	叔亮氨酸 Butyrylcarnitine	1363	二氢鞘氨醇 Sphinganine
65	亚油酸肉碱 Linoleylcarnitine	563	甘油磷酸胆碱 Glycerophosphocholine	1403	1-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱LysoPC(14:0)
88	1-甲基组氨酸 1-Methylhistidine	579	L-精氨酸 L-Arginine	1431	丙氨酰 - 脯氨酸 Alanyl-Proline
108	次黄嘌呤 Hypoxanthine	591	1-十六烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 LysoPE (0:0/16:0)	1446	鸟嘌呤核苷 Guanosine
124	L-氯化棕榈酰肉碱 L-Palmitoylcarnitine	617	二十四碳六烯酸 tetracosahexaenoic acid	1458	苯乙酸 Phenylacetic acid
146	L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine	618	L-丝氨酸 L-Serine	1472	硬脂酸酰胺 Stearamide
148	1-十五烷氧基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 LysoPC(15:0)	625	N-十四碳酰-L-丝氨酸 Decanoylcarnitine	1513	腺苷酸 Adenosine monophosphate
219	异亮脯氨酸 Isoleucylproline	641	牛磺胆酸 Taurocholic acid	1518	油酸 Oleic Acid
228	L-组氨酸 L-Histidine	676	高肌肽 Homocarnosine	1558	N6-乙酰-L-赖氨酸 N6-Acetyl-L-lysine
233	乙酰胆碱 Acetylcholine	692	植物鞘氨醇 Phytosphingosine	1594	α-维生素E α-Tocopherol
237	N-乙酰-L-组氨酸 N-Acetyl-L-Histidine	694	DL-2-氨基正辛酸 DL-2-Aminooctanoic acid	1607	亚油酸 Linoleic acid
242	肌苷 Inosine	712	苯丙酮酸 Phenylpyruvic acid	1608	维生素 ARetinol
247	胆碱 Choline	733	L-脯氨酰基-L-苯丙氨酸L-prolyl-L-phenylalanine	1611	腺嘌呤Adenine
255	3-(硬脂酰氧基)-4-(三甲基铵基)丁酸酯 DL-Stearoylcarnitine	753	顺-13-二十二烯酰胺 13Z-Docosenamide	1633	油酸酰胺 Oleamide
282	L-谷氨酰胺 L-Glutamine	809	腺苷 Adenosine	1717	1-磷酸鞘氨醇 Sphingosine 1-phosphate
283	1-苯乙胺 1-Phenylethylamine	829	2-苯基乙酰胺 2-Phenylacetamide	1861	尿嘧啶 Uracil
288	谷胱甘肽 Glutathione	835	花生酸 Arachidonic Acid	1877	谷酰氨基-色氨酸 Glutaminyl-Tryptophan
302	十四左旋肉碱 Tetradecanoylcarnitine	897	L-谷氨酸 L-Glutamate	1929	烟酸 Niacin
303	L-色氨酸 L-Tryptophan	922	二十二酰胺 Docosanamide	1944	十八酰胺乙醇 Stearoylethanolamide
332	1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 LysoPC(16:0)	927	组织胺 Histamine	1991	脱氧胞苷 Deoxycytidine
357	β-丙氨酸 β-Alanine	936	肌苷酸 IMP	1994	苹果酸 Malic acid
386	磺熊去氧胆酸 Tauroursodeoxycholic acid	959	L-2-氨乙基丝氨酸磷酸酯 L-2-Aminoethyl seryl phosphate	2099	脱氧腺嘌呤核苷 Deoxyadenosine
414	辛酰基肉碱 L-Octanoylcarnitine	1005	L-苏氨酸 L-Threonine	2103	甘氨酰-L-亮氨酸 Glycyl-L-leucine
427	焦谷氨酸 Pyroglutamic acid	1017	吡哆胺 Pyridoxamine	2104	尿刊酸 Urocanic acid
446	L-酪氨酸 L-Tyrosine	1056	2-哌啶甲酸 DL-pipecolic acid	2138	脯氨酸甜菜碱 Prolinebetaine
459	牛磺酸 Taurine	1067	乙酰双氢硫辛酸酰胺 S-Acetyldihydrolipoamide	2143	尿酸 Uric acid
465	棕榈酸酰胺 Palmitic amide	1078	邻苯二甲酸二丁酯 Alpha-CEHC	2203	亚油酰胺 Linoleamide
467	L-脯氨酸 L-Proline	1092	3Α-羟基-7-氧代-5Β-胆烷酸 Nutriacholic acid	2291	维生素A酸 Retinoic acid
476	磷酸羟基丙酮酸Phosphohydroxypyruvic acid	1114	蛋氨酸亚矾 Methionine sulfoxide	2296	苯甲酸 Benzoic acid
2036	5-L-谷氨酰-L-半胱氨酸 γ-Glu-Cys

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Table 3
表3
表3负离子模式下肌肉样本代谢产物
Table 3Metabolites of muscles samples in negative ion mode

编号 No.	代谢物 Metabolite	编号 No.	代谢物 Metabolite
356	尿苷 Uridine	1102	L-谷氨酰基5-磷酸 L-Glutamyl 5-phosphate
499	十一烷二酸 Undecanedioic acid	1083	吲哚乳酸 Indolelactic acid
1762	血栓素 B3TXB3	1793	谷氨酰二肽 Glutamylphenylalanine
258	苏糖酸 Threonic acid	1019	谷氨酰丙氨酸 Glutamylalanine
1454	四氢皮质醇 Tetrahydrocortisol	318	γ-谷氨酰谷氨酸 Gamma Glutamylglutamic acid
533	四氢皮质甾酮 Tetrahydrocorticosterone	1778	二十烷二酸 Eicosanedioic acid
1323	硬脂肪酸 Stearic acid	1343	脱氧尿苷一磷酸 dUMP
875	鞘氨醇1-磷酸 Sphingosine 1-phosphate	1814	十二烷二酸 Dodecanedioic acid
139	景天庚酮糖 Sedoheptulose	198	D-葡萄糖-6-磷酸二钠 D-Glucose 6-phosphate
276	脯氨酰羟脯氨酸 Prolylhydroxyproline	482	脱氧胆酸 Deoxycholic acid
1658	苯乙酮酸 Phenylglyoxylic acid	1609	D-生物素 D-Biotin
1756	苯丁酰谷氨酰胺 Phenylbutyrylglutamine	1811	皮质醇 Cortisol
721	第三类前列腺素 PGE3	1514	顺-11-二十碳烯酸 cis-gondoic acid
1495	前列腺素 PGE2	1366	顺式-11-二十碳烯酸 cis-9-palmitoleic acid
1435	前列腺素 E1PGE1	454	胆酸 Cholic acid
1661	棕榈酸 Palmitic acid	1758	肾上腺酸 Adrenic Acid
1375	十八烷二酸 Octadecanedioic acid	769	(5Z,7E,11Z,14Z)-9-羟基-5,7,11,14-二十碳四烯酸 9-HETE
1705	肉豆蔻油酸 Myristoleic acid	534	（8R）-8-氢过氧基亚油酸 8R-HpODE
1821	1-羟基-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 LysoPE(0:0/14:0)	680	L-4-羟基色氨酸 4-Hydroxy-L-threonine
1109	L-脯氨酰-L-苯丙氨酸 L-prolyl-L-phenylalanine	1859	3-吲哚丙酸3-Indolepropionic acid
467	1-（1Z十六碳烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸 LPA(P-16:0e/0:0)	1177	3-吲哚丁酸 3-Indolebutyric acid
1106	2棕榈酰甘油-3-磷酸 LPA(0:0/16:0)

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2.2 热处理对茶花鸡肉中水溶性化合物影响与主成分分析

图2为茶花鸡肌肉热处理前后胸肌和腿肌样本（分别为12个样本）在非监督类的模式识别方法PCA-X的得分散点图,从图中可以看出,样本可信度全部处于95%置信区间内,从图中可以看出不同性别不同部分的样本之间没有分开趋势,样本之间有明显分开趋势,说明样本组之间代谢物质轮廓具有差异性。

图2

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图2正离子（A）和负离子（B）模式下样本组间PCA-X得分图

YX：原料肉胸肌;YT：原料肉腿肌;SX：熟肉胸肌;ST：熟肉腿肌。下同
Fig. 2Positive ion (A) and negative ion (B) modes sample groups of PCA-X scores

YX: Raw meat chest muscle; YT: Raw meat thigh muscle; SX: Cooked meat chest muscles; ST: Cooked meat thigh muscles. The same as below


2.2.1 正离子模式下热处理对鸡肉中水溶性化合物影响与主成分分析 图3为茶花鸡胸肌和腿肌在正离子模式下对水溶性化合物进行多元统计分析的正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）得分散点图（A和D）、S-plot图（B和E）、置换检验200次Permutations图（C和F）,计算变量投影重要度VIP预测值见表4,通过该方法建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,来实现对样品类别的预测和标志代谢物的筛选（一般认为VIP>1的变量作为两组的差异代谢物筛选标准）。从OPLS-DA模型下散点得分图可以看出,加热前后胸肌和腿肌两组样本非常明显地分开,样本可信度全部处于95%置信区间内。

图3

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图3肌肉OPLS-DA得分图（A和D）、S-plot图（B和E）和Permutations图（C和F）

A、B和C：茶花鸡胸肌;D、E和F：茶花鸡腿肌。图中编号所指同表4
Fig. 3Muscles OPLS-DA score plots (A and D), S-plot plots (B and E), and Permutations plots (C and F)

A, B, and C: Chahua chicken breast muscle; D, E, and F: Chahua chicken thigh muscle. The contents of numbers in the figure same as table 4


Table 4
表4
表4正离子模式下VIP得分表
Table 4VIP score table in positive ion mode (VIP>1)

编号 No.	胸肌Breast muscle		编号 No.	腿肌Thigh muscle
	Var ID (Primary)	VIP pred		Var ID (Primary)	VIP pred
1	肌酸 Creatine	7.01967	1	肌酸 Creatine	6.56079
2	L-鹅肌肽 L-Anserine	4.57094	2	肌酐 Creatinine	3.23688
3	甜菜碱 Betaine	2.84563	3	左旋肉碱 L-Carnitine	3.22422
4	1-甲基组氨酸1-Methylhistidine	1.83296	4	甜菜碱 Betaine	3.20225
5	N-[4-(乙酰基氨基)苯基]-3-氧代丁酰胺Hydrouracil	1.64535	5	L-鹅肌肽 L-Anserine	3.00584
6	1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 LysoPC(16:0)	1.48292	6	3-(硬脂酰氧基)-4-(三甲基铵基)丁酸酯DL-Stearoylcarnitine	1.81764
7	肌苷 Inosine	1.39204	7	L-谷氨酰胺 L-Glutamine	1.63342
8	L-色氨酸 L-Tryptophan	1.37077	8	次黄嘌呤 Hypoxanthine	1.52174
9	5'-甲基硫腺苷5'-Methylthioadenosine	1.23907	9	N-乙酰-L-组氨酸N-Acetyl-L-Histidine	1.44579
10	N-乙酰-L-组氨酸N-Acetyl-L-Histidine	1.22247	10	L-组氨酸 L-Histidine	1.31488
11	异亮脯氨酸 Isoleucylproline	1.20120	11	乙酰肉碱Acetylcarnitine	1.22599
12	肌酐 Creatinine	1.11686	12	1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱LysoPC(16:0)	1.14697

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通过观察加热前后胸肌样本的S-plot图,S形的两个角上的变量可能就是本研究所寻找的生物标志物,对其进行红色标记分别有肌酸（Creatine）、L-鹅肌肽（L-Anserine）、甜菜碱（Betaine）、1-甲基组氨酸（1-Methylhistidine）、N-[4-(乙酰基氨基)苯基]-3-氧代丁酰胺（Hydrouracil）、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（LysoPC（16:0））、肌苷（Inosine）、L-色氨酸（L-Tryptophan）、5'-甲基硫腺苷（5'- Methylthioadenosine）、N-乙酰-L-组氨酸（N-Acetyl- L-Histidine）、异亮酰脯氨酸（Isoleucylproline）和肌酐（Creatinine）。通过S-plot并不能完全确定胸肌加热前后的生物标志物,为了检验模型是否存在过度拟合,建立200次OPLS-DA模型进行置换检验,图3-C是胸肌样本OPLS-DA模型中置换检验200次的统计图,置换检验验证结果为R²Y（cum）=0.963,Q²（cum）=-1.13,图中两条虚线分别表示RY和Q的回归线。直线的斜率越大,说明原模型具有良好的稳健性,不存在过拟合现象。

通过观察加热前后腿肌样本的S-plot图（图3-E）、置换检验200次验证图（图3-F）结果R²Y（cum）=0.589,Q²（cum）=-0.574和VIP（表4）,对S形的两个角上的生物标志物变量进行红色标记和VIP值>1得分图,可以确定热处理前后腿肌样本中有12种物质对组间差异做出了重要贡献,包括肌酸（Creatine）、肌酐（Creatinine）、左旋肉碱（L-Carnitine）、甜菜碱（Betaine）、L-鹅肌肽（L-Anserine）、3-(硬脂酰氧基)-4-(三甲基铵基)丁酸酯（DL-Stearoylcarnitine）、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）、次黄嘌呤（Hypoxanthine）、N-乙酰-L-组氨酸（N-Acetyl-L-Histidine）、L-组氨酸（L-Histidine）、乙酰肉碱（Acetylcarnitine）和1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（LysoPC(16:0)）。

2.2.2 负离子模式下热处理对鸡肉中水溶性化合物影响与主成分分析 从图4-A和4-D可以看出,热处理前后胸肌、腿肌两组样本区分非常显著,样本可信度全部处于95%置信区间内。通过观察热处理前后胸肌样本的S-plot图（4-B）和VIP得分表（表5）可以确定热处理前后胸肌样本中水溶性化合物在负离子模式下有10种物质对组间差异做出了重要贡献,包括苏糖酸（Threonic acid）、景天庚酮糖（Sedoheptulose）、L-4-羟基色氨酸（4-Hydroxy-L-threonine）、尿苷（Uridine）、D-葡萄糖-6-磷酸二钠（D-Glucose 6- phosphate）、γ-谷氨酰谷氨酸（Gamma Glutamylglutamic acid）、1-（1Z十六碳烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸（LPA(P-16:0e/0:0)）、吲哚乳酸（Indolelactic acid）、脯氨酰羟脯氨酸（Prolylhydroxyproline）和十一烷二酸（Undecanedioic acid）,通过置换检验200次验证图4-C结果为R²Y（cum）=0.705,Q²（cum）= -0.729,说明原模型具有良好的稳健性,不存在过拟合现象。通过观察热处理前后腿肌样本的S-plot图4-E和VIP得分表（表5）可以确定热处理前后腿肌样本中水溶性化合物在负离子模式下有11种物质对组间差异做出了重要贡献,包括L-4-羟基色氨酸（4- Hydroxy-L-threonine）、L-谷氨酰5-磷酸酯（L-Glutamyl 5-phosphate）、景天庚酮糖（Sedoheptulose）、苏糖酸（Threonic acid）、3-吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid）、D-葡萄糖-6-磷酸二钠（D-Glucose-6-phosphate）、前列腺素（PGE2）、脯氨酰羟脯氨酸（Prolylhydroxyproline）、γ-谷氨酰谷氨酸（Gamma Glutamylglutamic acid）、1-（1Z十六碳烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸LPA(P-16:0e/0:0)和谷氨酰丙氨酸（Glutamylalanine）。通过置换检验200次验证图（F）结果为R²Y（cum）=0.957,Q²（cum）=-0.463,说明原模型具有良好的稳健性,不存在过拟合现象。

图4

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图4肌肉OPLS-DA得分图（A和D）、S-plot图（B和E）和Permutations图（C和F）

A、B和C：茶花鸡胸肌,D、E和F：茶花鸡腿肌。图中编号所指同表5
Fig. 4Muscles OPLS-DA score plots (A and D), S-plot plots (B and E), and Permutations plots (C and F)

A, B, and C: Chahua chicken breast muscle; D, E, and F: Chahua chicken thigh muscle. The contents of numbers in the figure same as table 5


Table 5
表5
表5负离子模式下VIP得分表
Table 5VIP score table in negative ion mode (VIP>1)

编号 No.	胸肌Breast muscle		编号 No.	腿肌Thigh muscle
	Var ID (Primary)	VIP pred		Var ID (Primary)	VIP pred
1	苏糖酸 Threonic acid	2.77134	1	L-4-羟基色氨酸4-Hydroxy-L-threonine	2.76987
2	景天庚酮糖 Sedoheptulose	2.69728	2	L-谷氨酰5-磷酸酯 L-Glutamyl 5-phosphate	2.14000
3	L-4-羟基色氨酸4-Hydroxy-L-threonine	2.38874	3	景天庚酮糖 Sedoheptulose	2.04383
4	尿苷 Uridine	2.21336	4	苏糖酸 Threonic acid	1.94052
5	D-葡萄糖-6-磷酸二钠D-Glucose 6-phosphate	1.51438	5	3-吲哚丁酸 3-Indolebutyric acid	1.58979
6	γ-谷氨酰谷氨酸 Gamma Glutamylglutamic acid	1.31314	6	D-葡萄糖 6-磷酸二钠D-Glucose 6-phosphate	1.57744
7	1-（1Z十六碳烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸LPA(P-16:0e/0:0)	1.30657	7	前列腺素 PGE2	1.3055
8	吲哚乳酸 Indolelactic acid	1.12537	8	脯氨酰羟脯氨酸Prolylhydroxyproline	1.27561
9	脯氨酰羟脯氨酸Prolylhydroxyproline	1.08437	9	γ-谷氨酰谷氨酸 Gamma Glutamylglutamic acid	1.19071
10	十一烷二酸 Undecanedioic acid	1.01416	10	1-（1Z十六碳烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸LPA(P-16:0e/0:0)	1.01964
			11	谷氨酰丙氨酸 Glutamylalanine	1.00139

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2.2.3 肌肉中呈味特性及TAV分析 游离氨基酸是肉制品中重要的呈味水溶性化合物,茶花鸡肌肉中含有丰富的游离氨基酸类化合物,肌肉中17种游离氨基酸含量及TAV值如表6所示,其中苦味氨基酸7类、甜味氨基酸5类、鲜味氨基酸3类和其他类氨基酸2类。通过计算各物质的含量可知,在茶花鸡熟肉中,腿肌中的甜味物质与酸涩味物质显著高于胸肌中的含量（P<0.05）,而苦味物质要显著低于胸肌中的含量（P<0.05）,鲜味物质无显著性差别。其中甜味氨基酸总量最高,在熟胸肉和熟腿肉中分别是16.36 mmoL∙L^-1和43.30 mmoL∙L^-1。通过计算TAV值进一步评价各物质对整体滋味做出的贡献可以看出,熟胸肌中的γ-氨基丁酸和组氨酸大于1,熟腿肌中的γ-氨基丁酸和甜菜碱大于1,说明其对整体风味具有重要贡献作用。

Table 6
表6
表6茶花鸡肌肉中呈味物质和TAV值
Table 6Taste substance and TAV value in muscles of Chahua chicken

呈味 Taste	名称 Name	阈值[19,20,21] Threshold (mmoL∙L-1)	原料胸肉 Raw breast muscle		熟胸肉 Cooked breast muscle		原料腿肉 Raw thigh muscle		熟腿肉 Cooked thigh muscle
			含量 (mmoL∙L-1)	TAV	含量 (mmoL∙L-1)	TAV	含量 (mmoL∙L-1)	TAV	含量 (mmoL∙L-1)	TAV
酸涩味Sour	苹果酸Malic acid	3.70	0.03±0.00a	0.01	0.02±0.00b	0.01	0.02±0.00b	0.01	0.02±0.00b	0.01
酸涩味Sour	γ-氨基丁酸 γ-Aminobutyric acid	0.02	0.24±0.05c	12.00	0.46±0.06b	23.00	0.70±0.10a	35.00	0.75±0.13a	37.50
	其他氨基酸OAA		0.27±0.05c		0.48±0.07b		0.72±0.10a		0.77±0.13a
苦味Bitter	色氨酸 L-Tryptophan	5.00	1.50±0.30a	0.30	1.18±0.19a	0.24	1.17±0.15a	0.23	0.32±0.03b	0.06
苦味Bitter	次黄嘌呤Hypoxanthine	9.00	1.21±0.14b	0.13	5.91±2.08a	0.66	2.47±0.02b	0.27	2.45±0.62b	0.27
苦味Bitter	异亮氨酸L-Isoleucine	11.00	0.52±0.15b	0.05	0.56±0.13b	0.05	0.80±0.22a	0.07	0.24±0.02c	0.02
苦味Bitter	酪氨酸L-Tyrosine	5.00	0.89±0.05	0.18	0.69±0.10	0.14	0.71±0.10	0.14	0.94±0.27	0.19
苦味Bitter	精氨酸L-Arginine	2.87	0.38±0.11a	0.13	0.21±0.03b	0.07	0.43±0.06a	0.15	0.39±0.11a	0.14
苦味Bitter	组氨酸L-Histidine	3.22	3.03±0.02ab	0.94	3.69±0.86a	1.14	2.46±0.62bc	0.76	1.82±0.54c	0.56
苦味Bitter	苯丙氨酸L-Phenylalanine	3.03	0.32±0.07a	0.11	0.43±0.08a	0.14	0.36±0.10a	0.12	0.11±0.06b	0.04
	苦味氨基酸BFA		7.89±0.43b		12.14±2.00a		8.77±0.88b		6.27±1.25b
甜味Sweet	脯氨酸L-Proline	26.00	0.67±0.18b	0.03	0.82±0.12b	0.03	0.81±0.11b	0.03	1.54±0.50a	0.06
甜味Sweet	丝氨酸L-Serine	30.00	0.08±0.01b	0.00	0.02±0.00c	0.00	0.66±0.06a	0.02	0.08±0.02b	0.00
甜味Sweet	苏氨酸L-Threonine	40.00	0.12±0.03	0.00	0.11±0.03	0.00	0.11±0.01	0.00	0.12±0.05	0.00
甜味Sweet	D-葡萄糖6-磷酸 D-Glucose 6-phosphate	48.00	9.21±2.29a	0.19	9.42±1.96a	0.20	1.65±0.19b	0.03	1.59±0.52b	0.03
甜味Sweet	甜菜碱Betaine	20.01	4.58±1.02c	0.23	5.90±0.89c	0.29	14.03±3.66b	0.70	39.98±6.38a	2.00
	甜味氨基酸SFA		14.74±2.1b		16.36±1.37b		17.34±3.81b		43.30±7.22a
鲜味Umami	腺甘酸 Adenosine monophosphate	4.00	0.01±0.00	0.00	0.01±0.00	0.00	0.01±0.00	0.00	0.01±0.00	0.00
鲜味Umami	谷氨酸盐L-Glutamate	3.40	0.03±0.01b	0.01	0.07±0.01a	0.02	0.08±0.02a	0.02	0.04±0.02b	0.01
鲜味Umami	肌苷酸IMP	0.68	0.11±0.02ab	0.16	0.07±0.02b	0.10	0.12±0.03a	0.18	0.08±0.03ab	0.12
	鲜味氨基酸UFA		0.14±0.02b		0.15±0.02b		0.22±0.05a		0.13±0.05b

同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05)

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2.2.4 感官评价分析 茶花鸡胸肌和腿肌经过热处理后感官评价结果如图5所示。其中胸肌的鲜度最高（3.7）,其次是甜度（2.4）、酸度（0.4）、咸度（0.4）,苦度（0.3）最低;腿肌中鲜度最高（4.5）,其次是甜度（4.1）、苦度（0.8）、酸度（0.2）,咸度（0.0）最低。因此,根据感官评定结果,热处理后的胸肌和腿肌主要以甜鲜滋味为主,并且腿肌要优于胸肌,而酸度、苦度和咸度在整体滋味水平中具有协调作用。

图5

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图5胸肌和腿肌感官评价雷达图

Fig. 5Sensory evaluation radar of chest and thigh muscles

3 讨论

肉的嫩度、肉色、脂肪含量、蛋白含量等多个物理化学特性影响着肉的品质优劣和消费者对肉的接受程度^{[22,23,24,25]}。肉中的脂肪受热氧化和肉在加工过程中的美拉德反应对肉的挥发性风味起到主要的作用,但生肉和熟肉中的一些非挥发性物质如氨基酸类、维生素类、核苷类、有机酸类、脂肪酸类、脂质类等也是风味物质中重要的前提物质^[26],它们也会影响肉以及肉制品的口感、风味、嫩度和多汁性^[27,28]。而滋味成分来源于鸡肉中的水溶性物质,如氨基酸及氨基酸衍生物、核酸代谢物、小肽和有机酸等^{[29,30,31,32]},这类代谢化合物决定着肉质的滋味。鸡肉在烹饪过程中鲜味相关化合物由于其高水溶性特性并受高温影响从肌肉中浸出,降解为肌苷、次黄嘌呤^[33]、谷氨酸等,从而产生肉中的鲜味。本研究通过OPLS-DA主成分分析,并经过置换200次验证后,筛选出VIP>1得分的生物标志物。

从胸肌和腿肌在正离子和负离子模式下筛选出来的物质中发现,茶花鸡肌肉中的鲜味主要来源于核酸和氨基酸及其衍生物,其中D-葡萄糖-6-磷酸二钠是已报道过的具有风味形成潜力的主要碳水化合物^[27],甜菜碱可以提高肌肉中的脂肪含量和风味氨基酸的含量,改善其组成成分进一步达到改善风味品质^[34]。从以往的研究发现,无论是不同的鸡肉品种或者采用不同烹饪方法,胸肌中的IMP浓度显著高于腿肌,其原因可能是胸肌中90%以上是IIB型白肌纤维组成,而腿肌中则含有I型红肌纤维较多^[35],I型纤维肌肉中含有更高的5'-核苷酸酶（5'-NT）活性,导致IMP降解成肌苷。值得注意的是,本研究中腿肌中IMP的含量略高于胸肌（P>0.5）,也说明IMP没有被5'-NT过多的水解,并且从已知的报告中证明它具有令人愉快的味道,并有助于鲜味^[36],赋予熟肉肉类香味。

对代谢物进行分类后发现,在胸肌和腿肌中肌酸的VIP得分最高,分别是6.98816和6.53099,说明样本经过热处理后其贡献率很大,而肌酸是鸡肉中含有的一种重要化合物,对肌肉能量代谢和鸡肉性能起重要作用^[37,38]。哺乳动物在宰后肌肉中肌酸含量的增加可能会延迟肌肉中pH下降,因此可以提高肌肉的系水力^[39,40]。在胸肌中肌肽的VIP得分是4.55044,腿肌中肌肽的VIP得分是2.99239,说明其在胸肌中做出的贡献率要高于腿肌。鹅肌肽存在于大多数脊椎动物的肌肉组织中,具有特殊的抗氧化作用^[41]。肌肽、鹅肌肽和高肌肽都是具有生物活性的内源性化合物,具有很强的缓冲及抗氧化作用^[42,43],这一类物质可称为肉的额外营养因子^[44]。CHRISTMAN等^[45]的研究显示,骨骼肌中的肌肽和鹅肌肽的比例随着年龄的增加而增长,对治疗高尿血酸症、痛风和阿尔茨海默症都有一定作用^[46,47]。对于肉的风味而言,肉的鲜味主要来自核苷酸和氨基酸,而核苷酸中重要的鲜味由肌苷酸、鸟苷酸和腺苷酸提供^[48],因此在食物中添加少量的肌苷酸就能让食物获得鲜味和甜味^[36,49]。本研究中,正离子模式和负离子模式下筛选出的代谢差异物中氨基酸类和核苷酸类最多,占主导位置,从VIP得分图可以看出对肌肉的鲜美具有很大的贡献,说明茶花鸡肌肉的味道鲜美。

评价肉品滋味不能由单一种类氨基酸决定,它与食品中呈味氨基酸的组成和含量以及滋味阈值有关^[50],并且不同种类游离氨基酸之间相互平衡和影响是决定滋味产生的关键^[51]。根据滋味活性阈值和各游离氨基酸成分的含量,计算TAV值后发现γ-氨基丁酸值在胸肌和腿肌中最大,说明其对整体滋味的影响作用很大,γ-氨基丁酸是一种重要的抑制神经递质,在口腔中呈酸涩味,有口腔包衣感觉,在整体风味方面对鲜味和苦味具有调节活性的作用^[19];在熟肉中,胸肌TAV值大于1的有组氨酸,熟肉腿肌中有甜菜碱,从理论上充分说明胸肌的整体肉香味较好,腿肌的甜鲜味较好,这与陈怡颖等^[52]研究的鸡汤中游离氨基酸呈味特性相一致。同时肌苷酸和部分呈味氨基酸具有协同增效作用,增加整体的滋味^[53],为了更好的评价茶花鸡鸡肉的滋味特性,结合感官评定分析雷达图更直观性的可知,胸肌和腿肌在经过热处理后,整体滋味是甜鲜味,且腿肌优于胸肌,这与TAV值结果相一致。

4 结论

茶花鸡胸肌和腿肌在经过热处理后的差异化合物主要有肌酸、肌肽、氨基酸、核苷酸和糖类,其中肌酸和鹅肌肽在肌肉中浓度最高,氨基酸和核苷酸的种类最多。从OPLS-DA分析后发现样本全部处于95%置信区间内,同时置换检验200次的结果说明原模型具有良好的稳健性,不存在过拟合现象,VIP得分表可以看出肌酸、鹅肌肽、氨基酸类和核苷酸类的贡献最高,且在不同样本之间呈显著性差异,有望成为判定茶花鸡肌肉特征风味的重要指标。通过TAV值和感官评定值确定了茶花鸡胸肌和腿肌的整体滋味以甜鲜肉香味为主,且腿肌优于胸肌。

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