罗牡康^1,2, 贾栩超², 张瑞芬², 刘磊², 董丽红², 池建伟², 白亚娟², 张名位²1. 长江大学生命科学学院,湖北荆州 434020
2. 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/ 广东省农产品加工重点实验室,广州 510610

Phenolic Content, Bioavailability and Antioxidant Activity of Carambola

LUO MuKang^1,2, JIA XuChao², ZHANG RuiFen², LIU Lei², DONG LiHong², CHI JianWei², BAI YaJuan², ZHANG MingWei²1. College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434020, Hubei
2. Sericultura & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2019-08-21接受日期:2019-10-22网络出版日期:2020-04-01

基金资助:

广东省自然科学基金.2018A030310199 广东省农业科学院院长基金.201904

Editor: ZHAOLing-li
Received:2019-08-21Accepted:2019-10-22Online:2020-04-01
作者简介 About authors
罗牡康,E-mail： luomk1127@163.com。










摘要
【目的】 探讨杨桃果实中酚类物质的组成、含量、生物可及性及其抗氧化活性,为杨桃的鲜食消费和深加工利用提供参考。 【方法】 以广州红杨桃（GZ）、香蜜杨桃（XM）、台湾蜜丝杨桃（TW）3个品种的果实为材料,采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测杨桃果实中主要的酚类物质,选用ABTS ⁺自由基清除能力和氧自由基吸收能力（ORAC）两种方法测定其抗氧化能力,采取体外模拟胃肠消化法分析各杨桃品种果实在消化过程中消化液总酚、总黄酮、单体酚物质及抗氧化能力的变化,并计算其酚类物质生物可及性。 【结果】 从杨桃果实提取物中检测到了3种酚酸（原儿茶酸、对香豆酸和阿魏酸）和3种黄酮类物质（原花青素B2、表儿茶素和异槲皮苷）,其中原花青素B2和表儿茶素是含量最高的单体酚。供试杨桃品种的总酚、总黄酮含量的变异范围分别为234.41—293.30 mg GAE/100g FW和165.75—278.97 mg CE/100g FW。模拟胃消化后,杨桃消化液中生物可及性多酚和黄酮的总含量分别为151.57—180.45 mg GAE/100 g FW和113.06—164.45 mg CE/100 g FW,总酚和总黄酮的生物可及性分别为54.05%—76.98%和47.58%—93.88%。进一步经肠消化后,释放入消化液中的生物可及性酚类成分有所减少,生物可及性多酚和黄酮的总含量分别为116.64—155.76 mg GAE/100 g FW和78.47—148.44 mg CE/100 g FW,总酚和总黄酮的生物可及性分别为46.57%—66.45%和40.12%—84.75%。胃消化释放入消化液的原花青素B2和表儿茶素分别达到56.60%—87.54%和65.33%—85.92%,而胃肠消化液中检测到的原花青素B2和表儿茶素含量分别为杨桃果实提取物的51.90%—80.94%和32.81%—37.50%。杨桃胃消化液的ABTS和ORAC抗氧化值分别为杨桃果实提取物的97.56%、102.42%、92.36%和122.73%、118.50%、107.14%,而经进一步肠消化后消化液的ABTS和ORAC值分别降低12.33%—26.60%和37.95%—43.28%。 【结论】 杨桃中主要的酚类物质包括原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、原花青素B2、表儿茶素和异槲皮苷,其中原花青素B2和表儿茶素的含量显著高于其他4种酚类物质。杨桃果实经模拟胃液消化后消化液中有较高的酚类物质含量,而肠消化过程使生物可及性的酚类物质含量显著降低。
关键词： 杨桃;酚类物质;黄酮;生物可及性;抗氧化

Abstract
【Objective】 The aim of this study was to explore the phenolic composition, content, bioaccessibility and antioxidant activity of phenolic compounds in different carambola fruit varieties, so as to provide reference for the fresh consumption and deep processing of carambola. 【Method】 Phenolic compounds of three cultivars, including Guangzhou Hong cultivar (GZ), Xiangmi cultivar (XM), and Taiwan Misi cultivar (TW), were determined by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Their antioxidant capacity was evaluated by ABTS ⁺ radical scavenging capacity (ABTS) and oxygen radical absorbance capacity assay (ORAC). The change of total phenol, flavonoids, mono-phenol and their antioxidant capacity, as well as their bioaccessibility were analyzed during in vitro simulated gastrointestinal digestion. 【Result】 Three phenolic acids (protocatechuic acid, p-coumaric acid and ferulic acid) and three flavonoids (procyanidin B2, epicatechin and isoquercetin) were detected from the extracts of carambola fruit, among which proanthocyanin B2 and epicatechin were the predominant phenolics. The variation ranges of total phenolics and total flavonoids in tested varieties were 234.41-293.30 mg GAE/100 g and 165.75-278.97 mg CE/100 g, respectively. After simulated gastric digestion, the contents of phenolics and flavonoids in carambola digestive juice were 151.57-180.45 mg GAE/100 g FW and 113.06-164.45 mg CE/100 g FW, respectively. And their bioaccessibility were 54.05%-76.98% and 47.58%- 93.88%, respectively. After further intestinal digestion, the content of phenolic compounds released into the digestive fluid was reduced. The phenolics and flavonoids contents were 116.64-155.76 mg GAE/100 g FW and 78.47-148.44 mg CE/100 g FW, respectively, and their bioaccessibility were 46.57%-66.45% and 40.12%-84.75%, respectively. The contents of procyanidins B2 and epicatechin released into digestive fluid were 56.60%-87.54% and 65.33%-85.92% with gastrointestinal digestion and these only accounted for 51.90%-80.94% and 32.81%-37.50% of carambola fruit extract, respectively. The antioxidant capacity of ABTS and ORAC of digestive juice of three carambola fruit with gastric digestion were 97.56%, 102.42%, 92.36% and 122.73%, 118.50% and 107.14%, respectively. After further intestinal digestion, their antioxidant capacity of ABTS and ORAC were reduced by 12.33%-26.60% and 37.95%-43.28%, respectively. 【Conclusion】 Protocatechuic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, procyanidin B2, epicatechin and isoquercetin were the main phenolic substances in carambola, and the contents of procyanidin B2 and epicatechin were the highest among them. After simulated gastric digestion, a high content of phenolic compounds in the digestive juice were detected, while their contents were significantly reduced with intestinal digestion.
Keywords：carambola;phenolic substances;flavonoid;bioaccessibility;antioxidant


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本文引用格式
罗牡康, 贾栩超, 张瑞芬, 刘磊, 董丽红, 池建伟, 白亚娟, 张名位. 杨桃的酚类成分含量及其生物可及性与抗氧化活性[J]. 中国农业科学, 2020, 53(7): 1459-1472 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.014
LUO MuKang, JIA XuChao, ZHANG RuiFen, LIU Lei, DONG LiHong, CHI JianWei, BAI YaJuan, ZHANG MingWei. Phenolic Content, Bioavailability and Antioxidant Activity of Carambola[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(7): 1459-1472 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.014


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0 引言

【研究意义】杨桃（Averrhoa carambola L.）又名阳桃或洋桃,其横截面呈星形而得名“星果”,因其特殊的风味和口感,在我国以及东南亚深受欢迎^[1,2]。杨桃是一种有效的天然抗氧化食品,含有丰富的酚类成分^[3,4,5],其酚类含量在20种热带水果中排名第四^[6]。杨桃酚类物质具有抗氧化^[2]、抑制脂肪酶^[7]、抑制脂肪生成^[8]和抑制脂肪肝变性^[9]等生物活性,对维持人体健康具有重要意义。通常情况下,酚类物质从食品基质中的释放决定着其被吸收、利用的可能性,摄入富含酚类物质的食物并不一定意味着有着较多的酚类物质被人体所吸收^[10,11]。前人研究表明水果多酚与自身食物基质的其他成分有很强的自然联系和相互作用,这些相互作用限制了多酚在胃肠消化过程中从食物基质中完全释放^[12],进而影响多酚类物质的吸收代谢和生理功效的发挥。综上所述,酚类物质的生物可及性是多酚发挥人体健康效应的前提。因此,探究杨桃果实的酚类构成谱、生物可及性及其抗氧化活性,对研究杨桃果实多酚生物利用度和体内吸收代谢具有重要意义,也为杨桃的品质育种和精深加工提供理论指导。【前人研究进展】近年来,杨桃酚类物质的研究主要集中在其化学结构表征和生物活性评价等方面。ZAINUDIN等^[13]研究发现杨桃果实中总酚含量高达（234.89±19.85）mg GAE/100 g FW;PANG等^[14]对4个杨桃品种中的游离酚、结合酚和总酚含量进行了测定,并通过高效液相色谱鉴定到表儿茶素等7个单体酚类成分;也有****通过分离纯化结合核磁共振等波谱手段对杨桃中的酚类成分进行了结构表征,报道的成分主要包括花青素类^[15]、查尔酮类^[2,8-9]、木脂素类和酚酸^[16]等。杨桃中的酚类物质也被报道具有良好的生物活性。MAHATTANATAWEE等^[17]研究了14种热带水果的抗氧化活性,发现杨桃具有最高的DPPH抗氧化活性,其ORAC抗氧化活性仅次于番石榴;庞道瑞^[7]研究发现杨桃游离酚提取物对3T3-L1细胞分化脂滴的产生有一定的抑制作用,对脂肪酸诱导的L02肝细胞脂肪变性也有一定的缓解作用,并通过db/db小鼠模型进一步确证了杨桃游离酚提取物有较好的降血脂和降肝脂活性;AZEEM等^[18]通过对白化小鼠腹腔注射CCl₄诱导肝毒性模型发现,杨桃水提物对四氯化碳所致小鼠肝损伤具有良好的保护作用;JIA等^[16]研究结果表明从新鲜杨桃中分离出的11种酚类化合物具有良好的ABTS和FRAP抗氧化活性,其中部分化合物还表现出中等强度的猪胰脂肪酶抑制活性。【本研究切入点】目前杨桃果实酚类物质的结构表征及生物活性已有研究报道,但缺少关于杨桃酚类物质在消化过程中的释放与生物可及性的研究。【拟解决的关键问题】以广州红杨桃（GZ）、香蜜杨桃（XM）、台湾蜜丝杨桃（TW）3个品种的杨桃果实为材料,利用HPLC-MS/MS对杨桃果实提取物的酚类物质组成及含量进行测定,并采用体外模拟胃肠消化的方法研究杨桃酚类物质的生物可及性,以了解杨桃果实在模拟胃肠消化过程中活性成分及其抗氧化能力的变化规律,为杨桃的功能活性研究和

相关营养保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2019年3—7月在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室进行。

1.1 试验材料

3个品种的新鲜杨桃见图1,广州红杨桃（GZ）产自广东省东莞市大朗镇,地处东经113.52°,北纬22.65°。香蜜杨桃（XM）产自福建省云霄县下河村,地处东经117.33°,北纬23.95°。台湾蜜丝杨桃（TW）产自台湾省彰化县二林镇,地处东经120.50°,北纬24.06°。选取成熟度相同的果实,储存在-20℃备用。

图1

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图1三个品种杨桃的照片

Fig. 1Photographs of three varieties of carambola



胃蛋白酶（400 U∙mg^-1）、胰蛋白酶（4×USP）、胆盐、2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、荧光素钠、2, 2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH）、福林酚试剂购于美国Sigma公司;没食子酸、儿茶素、水溶性维生素E（Trolox）、对香豆酸、异槲皮苷、原花青素B2、表儿茶素、原儿茶酸、阿魏酸购于上海源叶生物科技有限公司;色谱级乙腈购于美国Fisher公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BIOFUGE Stratos Sorvall高速冷冻离心机、ULT2586-4-V超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）,Vortex-Genie2多用途涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）,Infinite M200pro酶标仪（瑞士Tecan公司）,LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）,Ultimate 3000超高压液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）,TSQ Endura三重四级杆质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）,THZ-82A水浴恒温振荡器（常州荣华仪器制造有限公司）,PHSJ-5型实验室PH计（上海雷磁仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 杨桃果实酚类物质的提取 采用传统的有机试剂浸提法提取杨桃果实中的酚类物质,作为杨桃中的总酚。准确称取10.0 g杨桃样品,加入甲醇30 mL,高速匀浆3 min后置于50 mL离心管内,用37℃恒温水浴摇床120 r/min振摇提取2 h,然后4℃离心（10 000 r/min）10 min,取上清液,残渣按上述过程重复提取两次,合并上清液,于45℃下减压旋蒸浓缩,浓缩液用去离子水定容至30 mL,得到杨桃酚类提取液,分装后置于-80℃备用。

1.3.2 模拟体外消化及生物可及性分析 参照LIANG等^[19]的方法,通过模拟体外胃肠消化法测定杨桃果实中酚类物质生物可及性,略作修改。消化过程分为两个阶段。第一阶段胃液消化（gastric digestion,GD）。称取10.0 g杨桃样品,置于50 mL离心管内,加入去离子水30 mL,高速匀浆3 min后,用6.0 mol·L^-1 HCl将混合液pH调至2.0,混匀,然后加入胃蛋白酶（12 000 U）,混匀,置于37℃恒温水浴摇床中120 r/min振摇2 h,快速冰浴冷却后在4℃离心（10 000 r/min）10 min,取2 mL上清液作为胃液消化的样品储存在-80℃。第二阶段肠消化（intestinal digestion,ID）。用1.0 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液将胃液消化后的混合液pH调节至7.5,然后加入胰蛋白酶（1 mL,4 g·L^-1）和胆盐（1 mL,25 g·L^-1）,混匀,置于37℃恒温水浴摇床中120 r/min振摇2 h。消化结束后,立即取出,冰浴使其冷却,将混合液的pH调节至2,然后4℃离心（10 000 r/min）10 min,取上清液作为胃肠消化的样品（GID）。

生物可及性是模拟消化过程中释放的化合物含量与样品中化合物含量的比值,根据以下公式计算^[20]：

$生物可及性（%）=\frac{模拟消化过程中释放出的化合物的含量}{样品中化合物的含量}×100$

1.3.3 总酚含量的测定 总酚含量测定采用Folin- Ciocalteu法^[21]。分别取125 μL适当稀释（适当稀释是指：使样品反应液的吸光值在标曲范围内,下同）的样品溶液加到含有0.5 mL去离子水的试管中,加入125 μL福林酚试剂,混匀后反应6 min。再向试管中加入1.25 mL 7%（w﹕v）Na₂CO₃溶液和1 mL水,使整个反应体系总体积为3 mL。将混合液混匀后避光静置90 min,每管吸取200 μL至透明96孔板,在酶标仪760 nm下测定各孔的吸光值,每个样品平行操作3次。用没食子酸标准品做标准曲线,各样品的总酚含量以每100 g新鲜杨桃果肉中所含没食子酸当量表示（mg GAE/100 g FW）。

1.3.4 总黄酮含量的测定 总黄酮含量测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法^[22]。将250 μL适当稀释的样品溶液加入到含有1.25 mL去离子水的试管中,加入75 μL 5%（w﹕v）NaNO₂溶液,充分混匀后反应6 min。向混合液中加入150 μL（w﹕v）AlCl₃·6H₂O（10%）溶液,静置5 min后,再加入0.5 mL NaOH（1 mol·L^-1）溶液和275 μL去离子水,每管吸取200 μL至透明96孔板,在酶标仪510 nm下测定各孔的吸光值,每个样品平行操作3次。用儿茶素标准品做标准曲线,各样品的总黄酮含量以每100 g新鲜杨桃果肉中所含儿茶素当量表示（mg CE/100 g FW）。

1.3.5 杨桃酚类物质的定性分析 采用UPLC- ESI-QqQ液质联用仪结合标准品对杨桃提取物中的部分酚类物质进行定性分析。液相条件：超高压液相（Ultimate 3000,美国Thermo Fisher Scientific公司）;色谱柱：Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）;柱温：35℃;流速：0.3 mL·min^-1;进样量：5 μL;检测波长：280 nm;DAD扫描波长范围：190—600 nm;流动相：A：0.1%乙酸水溶液,B：甲醇;流动相梯度：0—10 min,10%—20% B;10—15 min,20%—45% B;15—20 min,45%—70% B;20—23 min,70%—75% B。

质谱条件：三重四级杆质谱仪（TSQ Endura,美国Thermo Fisher Scientific公司）;电喷雾离子源（ESI）,负离子（NI）模式;喷雾电压2 500 V;扫描区间：m/z 0—600;雾化压力：30 psi;干燥气体流速：9.0 L·min^-1;雾化器温度：300℃;锥孔电压：135 V;使用兼顾选择性和灵敏度的选择反应监测模式（SRM）对杨桃提取物中的色谱峰进行定性分析。

1.3.6 酚类物质含量测定 杨桃中单体酚的鉴定参考PANG等^[14]的测定方法稍作修改。色谱柱为Shimadzu（C18,S-5 μm,12 nm,250 mm×4.6 mm）,流动相A为0.2%的乙酸水溶液（v/v）,流动相B为乙腈。流速为1.0 mL·min^-1,进样体积为10 μL。梯度洗脱程序如下：0—30 min,10%—20% B;30—35 min,20% B;35—45 min,20%—45% B;45—60 min,45%—70% B;60—68 min,70%—75% B。检测波长为280 nm。通过与标准品比对保留时间对酚类物质进行指认。通过高效液相色谱建立标准曲线对提取物中的6个单体酚进行含量测定。单体酚的含量以mg/100 g FW表示。每个样品平行操作3次。

1.3.7 ABTS⁺清除能力的测定 2.6 mmol·L^-1过硫酸钾溶液和7.4 mmol·L^-1 ABTS⁺溶液体积比1﹕1混合,室温避光放置12 h后,稀释至吸光度值为0.7±0.05,作为ABTS⁺工作液。取200 μL适当稀释的样品加入到含有5.8 mL ABTS⁺工作液的试管中,混匀后反应6 min,每管吸取200 μL至透明96孔板,在酶标仪734 nm下测定各孔的吸光值,每个样品平行操作3次。用Trolox标准品做标准曲线,各样品的ABTS⁺清除能力以每g新鲜杨桃果肉中所含Trolox当量表示（mg TE/g FW）。

1.3.8 ORAC抗氧化活性分析 ORAC抗氧化活性分析参照OU^[23]和ZULUETA等^[24]报道的方法并稍作修改。样品用75 mmol·L^-1 pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释到适当浓度后,各取20 μL加到黑色96孔板中,另设空白孔、对照孔、不同浓度的标准溶液孔（Trolox）和阳性对照孔（没食子酸）,各处理均设3个复孔。将96孔板放入提前调节温度至37℃的酶标仪中孵育10 min,每孔加入200 μL 0.96 μmol·L^-1荧光素钠工作液,继续孵育20 min后,除对照孔外,每孔再加入20 μL新鲜配置的119 mmol·L^-1 AAPH溶液。最后,将96孔板立即放入酶标仪中,激发波长485 nm、发射波长520 nm下测定各孔荧光值,每4.5 min测定一次,共35个循环。计算各孔荧光强度曲线下的面积（AUG）,减掉空白孔的AUG,即得到各孔的net AUG,根据不同浓度Trolox的net AUG做标准曲线,计算各样品的ORAC值,以Trolox当量表示（μmol TE/g FW）。

1.3.9 统计分析 试验所得结果以均数±标准差表示。使用Origin 8.0软件绘图,使用SPSS 24.0软件进行Duncan’s多重比较分析。不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2 结果

2.1 杨桃果实主要酚类成分的鉴定

采用超高压液相色谱三重四级杆质谱联用仪首先对单体酚的标准品进行能量优化,筛选其对应的特征离子对,并确定标准品的保留时间。为提高定性的准确性,6个单体酚标准品选择两对特征离子对进行分析,优化结果如表1所示。随后采用选择性反应监测模式对杨桃提取物中进行分析,根据保留时间和特征离子对提取物进行匹配指认。结果如图2所示,共从杨桃甲醇提取物中指认出6种酚类物质,分别为原儿茶酸、原花青素B2、表儿茶素、对香豆酸、阿魏酸和异槲皮苷。

Table 1
表1
表1单体酚类物质的优化离子碎片
Table 1Precursor and products ions of authentic standards used in the LC-MS/MS analysis

化合物 Compound	保留时间 Retention time (min)	特征离子Characteristic ion (m/z)		碰撞能量Collision energy (V)
		1	2	1	2
原儿茶酸 Protocatechuic acid	2.59	153.06→109.11	153.06→91.18	12.99	23.90
原花青素B2 Proanthocyanidin B2	5.90	577.15→407.04	577.15→425.06	20.87	12.98
表儿茶素 Epicatechin	7.88	289.15→245.04	289.15→203.04	13.49	17.74
对香豆酸 p-Coumaric acid	9.66	163.06→119.11	163.06→93.15	12.33	29.47
阿魏酸 Ferulic acid	12.13	193.06→134.11	193.06→178.00	14.75	11.47
异槲皮苷 Isoquercitrin	15.23	463.15→300.00	463.15→301.01	25.27	19.96

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图2

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图2杨桃甲醇提取物及指认酚类物质的LC-MS图谱

Fig. 2The LC-ESI-MS spectra of carambola methanol extracts and some identified phenolic compounds

2.2 杨桃果实酚类成分的含量

供试品种总酚含量范围为234.41—293.30 mg GAE/100 g FW,其中XM的含量显著高于其他品种（P<0.05）,TW次之,GZ的含量最低（（234.41±7.88）mg GAE/100 g FW）。总黄酮含量范围为165.75— 278.97 mg CE/100 g FW,XM的含量高达（278.97± 5.50）mg CE/100 g FW,显著高于其他品种。GZ和TW的总酚、总黄酮含量无显著差异（P>0.05）（图3）。

图3

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图33个品种杨桃的总酚和总黄酮含量

GZ：广州红杨桃Guangzhou Hong carambola;XM：香蜜杨桃 Xiangmi carambola;TW：台湾蜜丝杨桃Taiwan Misi carambola。不同字母表示差异显著（P<0.05）。下同
Fig. 3The total contents of phenolics and flavonoids in three varieties of carambola Different letters mean significant differences (P<0.05). The same as below



除原儿茶酸外,原花青素B2、表儿茶素、对香豆酸、阿魏酸、异槲皮苷在所有供试品种中均能检测到。原花青素B2是供试杨桃中含量最丰富的一种单体酚,其中XM的含量最高,分别为GZ和TW的1.26和1.41倍。XM的表儿茶素含量显著高于其他品种,分别为GZ和TW的1.25和1.93倍。XM中异槲皮苷的含量显著低于GZ和TW,仅分别为GZ和TW的47.2%和58.6%。原儿茶酸在TW中含量最高,但在XM中未检测到。对香豆酸和阿魏酸的含量分别为0.89—1.23 mg/100 g FW和1.20—1.40 mg/100 g FW（表2）。

Table 2
表2
表2杨桃果实中单体酚的含量
Table 2The Content of monomeric phenols in carambola

品种 Variety		含量 Content (mg/100 g FW)
		广州红杨桃 GZ	香蜜杨桃 XM	台湾蜜丝杨桃 TW
酚酸 Phenolic acid	原儿茶酸 Protocatechuic acid	1.25±0.30b	ND	1.49±0.00b
	对香豆酸 p-Coumaric acid	0.98±0.02a	1.23±0.05b	0.89±0.02a
	阿魏酸 Ferulic acid	1.28±0.02ab	1.40±0.03b	1.20±0.01a
黄酮 Flavone	原花青素B2 Proanthocyanidin B2	14.93±0.51a	18.86±0.90b	13.41±0.81a
	表儿茶素 Epicatechin	9.23±0.10b	11.55±1.55c	5.97±0.33a
	异槲皮苷 Isoquercitrin	2.16±0.06b	1.02±0.03a	1.74±0.10b

同一行不同字母表示差异显著（P<0.05）。ND：未检测到。下同
Different letters within the same row indicate significant difference (P<0.05). ND: Not detected. The same as below

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2.3 杨桃的生物可及性

如表3所示,经胃消化后,供试杨桃果实生物可及性多酚的释放量变异范围为151.57—180.46 mg GAE/ 100 g FW,总酚的生物可及性为54.05%—76.98%。胃肠消化后生物可及性黄酮的释放量为113.06— 164.45 mg CE/100 g FW,总黄酮的生物可及性为47.58%— 93.88%。进一步经肠消化后,消化液中的生物可及性多酚和黄酮的含量较胃消化阶段显著性减少（P<0.05）,其生物可及性酚类含量为116.64—155.76 mg GAE/100 g FW,较胃消化后降低了13.69%—23.05%,总酚的生物可及性为46.57%—66.45%。生物可及性黄酮含量变异范围为78.47—148.44 mg CE/100 g FW,较胃消化后降低9.74%—30.59%,总黄酮的生物可及性为40.12% —84.75%。供试品种中,多酚和黄酮生物可及性最高的是GZ,分别为93.88%和84.75%,XM和TW总酚的可及性相当,但TW黄酮的生物可及性较XM高。

胃、肠消化对单体酚的含量也有一定影响。如表4所示,经过模拟胃液消化后,杨桃释放的原花青素B2生物可及性为56.60%—87.54%,表儿茶素生物可及性为65.33%—85.92%,异槲皮苷生物可及性为61.11%—74.71%。胃消化后,GZ和TW杨桃释放的原儿茶酸含量仅为果实中含量的29.60%和14.77%。阿魏酸的生物可及性为59.38%—66.67%,对香豆酸的生物可及性高达72.6%—117.35%。进一步经肠消化后,除原儿茶酸外,消化液中所有被检单体酚的含量都有所减少。其中,消化液中检测到的原花青素B2生物可及性为51.90%—80.94%。表儿茶素生物可及性为32.81%—37.50%。异槲皮苷生物可及性为33.80%—49.43%。阿魏酸生物可及性为53.57%—56.67%。胃、肠消化后,GZ和XM杨桃的对香豆酸生物可及性分别为59.18%和47.15%,但是对香豆酸在TW杨桃的消化液中并未检测到;GZ和TW杨桃的原儿茶酸生物可及性分别为34.40%和28.86%,而XM杨桃经胃、肠消化后第一次检测到原儿茶酸。

Table 3
表3
表3杨桃体外消化过程中释放入消化液中的总酚和总黄酮含量及其生物可及性
Table 3Contents of total phenolics and flavonoids released into digestive fluid and their bioaccessibility during in vitro digestion of carambola

	总酚 Total phenolic（mg GAE/100 g FW）			总黄酮 Total flavonoid（mg CE/100 g FW）
	广州红杨桃 GZ	香蜜杨桃 XM	台湾蜜丝杨桃 TW	广州红杨桃 GZ	香蜜杨桃 XM	台湾蜜丝杨桃 TW
果肉中含量 Contents in fruit	234.41±7.88a	293.30±2.16b	244.29±6.98a	175.16±8.57a	278.97±5.50b	165.75±21.16a
胃消化释放量 Content released during GD	180.46±16.89b	158.52±4.26a	151.57±10.94a	164.45±2.58c	132.74±13.83b	113.06±16.92a
胃消化生物可及性 Bioaccessibility during GD (%)	76.98	54.05	62.05	93.88	47.58	68.21
胃肠消化释放量 Content released during GID	155.76±17.85c	136.59±1.11b	116.64±10.84a	148.44±11.53c	111.93±12.01b	78.47±12.63a
胃肠消化生物可及性Bioaccessibility during GID (%)	66.45	46.57	47.75	84.75	40.12	47.34

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2.4 杨桃果实在体外消化过程中的抗氧化活性变化

图4显示杨桃果实提取液具有良好的抑制ABTS⁺自由基形成的能力,其变异范围为49.98— 56.30 mg TE/g FW,其中ABTS抗氧化能力最强的品种是XM,显著高于其他品种（P<0.05）,最弱的是TW。经过模拟胃消化后,上清液的ABTS抗氧化能力为46.16—57.66 mg TE/g FW,是杨桃果实提取液的92.36%—102.42%,其中XM杨桃消化液的ABTS抗氧化能力最高,为（57.66±0.73）mg TE/g FW。进一步经肠消化后,消化上清液的ABTS抗氧化能力为33.88—49.39 mg TE/g FW,是杨桃果实提取液的67.79%—87.73%,其中ABTS抗氧化能力最强的仍然是XM杨桃的消化液,为（49.39±3.62）mg TE/g FW。

图4

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图4杨桃果实在体外消化过程中ABTS⁺自由基清除能力的变化

AC：杨桃果实提取液;GD：胃消化液;GID：胃肠消化液。下同
Fig. 4ABTS⁺ free radical scavenging ability of carambola during simulated digestion

AC: Carambola extract; GD: Gastric digestive fluid; GID: Gastrointestinal digestive fluid. The same as below


杨桃果实提取液具有良好的ORAC抗氧化能力（图5）,其变化范围为30.67—37.09 μmol TE/g FW。经模拟胃液消化后,上清液的ORAC抗氧化能力为32.86—43.95 μmol TE/g FW,是杨桃果实提取液的107.14%—122.73%,其中XM杨桃消化液的ORAC抗氧化能力最高。进一步经肠消化后,消化上清液的ORAC抗氧化能力为19.51—26.67 μmol TE/g FW,是杨桃果实提取液的63.61%—76.13%,其中ORAC抗氧化能力最强的是GZ杨桃消化液,最弱的是TW。

Table 4
表4
表4杨桃果实中单体酚含量及其在体外消化过程中的释放情况
Table 4Changes of monomeric phenols content in carambola during in vitro digestion

单体酚种类 Monomeric phenols	品种 Variety	果实中含量 Content in fruit	胃消化释放量 Content released during GD	胃肠消化释放量 Content released during GID
原儿茶酸 Protocatechuic acid	广州红杨桃 GZ	1.25±0.30b	0.37±0.22a	0.43±0.07a
	香蜜杨桃 XM	ND	ND	0.24±0.02b
	台湾蜜丝杨桃 TW	1.49±0.00c	0.22±0.06a	0.43±0.07b
对香豆酸 Para-Coumaric acid	广州红杨桃 GZ	0.98±0.02b	1.15±0.24c	0.58±0.01a
	香蜜杨桃 XM	1.23±0.05c	0.89±0.08b	0.58±0.00a
	台湾蜜丝杨桃 TW	0.89±0.02b	0.86±0.01b	ND
阿魏酸 Ferulic acid	广州红杨桃 GZ	1.28±0.02b	0.76±0.04a	0.72±0.00a
	香蜜杨桃 XM	1.40±0.03b	0.87±0.03a	0.75±0.06a
	台湾蜜丝杨桃 TW	1.20±0.01c	0.80±0.01b	0.68±0.07a
原花青素 B2 Proanthocyanidin B2	广州红杨桃 GZ	14.93±0.51b	13.07±2.96b	8.45±1.41a
	香蜜杨桃 XM	18.86±0.90c	11.88±0.63b	9.58±0.96a
	台湾蜜丝杨桃 TW	13.41±0.81c	9.88±0.30b	6.96±0.39a
表儿茶素 Epicatechin	广州红杨桃 GZ	9.23±0.10c	7.93±2.02b	3.32±0.76a
	香蜜杨桃 XM	11.55±1.55c	5.86±0.56b	3.79±0.24a
	台湾蜜丝杨桃 TW	5.97±0.33c	3.90±0.03b	2.22±0.06a
异槲皮苷 Isoquercitrin	广州红杨桃 GZ	2.16±0.06c	1.32±0.42b	0.73±0.05a
	香蜜杨桃 XM	1.02±0.03c	0.63±0.04b	0.39±0.03a
	台湾蜜丝杨桃 TW	1.74±0.10c	1.30±0.20b	0.86±0.14a

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图5

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图5杨桃果实在体外消化过程中ORAC总抗氧化能力的变化

Fig. 5ORAC antioxidant capacity of carambola during simulated digestion

3 讨论

3.1 杨桃果实酚类物质组成及含量特征

大量研究表明,酚类物质的组成与含量因果实种类而异。RAMFUL等^[25]测定了36种柑橘类水果的酚类物质,发现总酚为28.2—692.3 mg GAE/100 g FW,总黄酮为78.1—561.5 mg QE/100 g FW。ZHANG等^[26]发现不同品种荔枝果肉中酚类物质含量差异显著,总酚含量变幅为101.51—259.18 mg GAE/100 g FW。DERRADJI等^[27]曾报道各品种葡萄果肉中总酚含量为121—335 mg GAE/100 g FW,总黄酮含量为40—109 mg CE/100g FW。本研究测定了3个品种杨桃果实的酚类物质组成及含量,3个品种中总酚、总黄酮分别为234.41—293.30 mg GAE/100 g FW和165.75—278.97 mg CE/100 g FW,可见杨桃果实的酚类物质含量低于部分柑橘类水果,高于大部分荔枝,其黄酮含量甚至高于葡萄。在受试品种中酚类物质含量最高的品种是XM,稍高于庞道瑞^[7]测得的结果,这可能是由于原料产地、原料成熟度等因素造成的结果差异。

在3个品种的杨桃果实中都检测到了原花青素B2、表儿茶素、异槲皮苷、原儿茶酸、对香豆酸和阿魏酸,与前人研究报道一致^[28,29,30]。其中原花青素B2和表儿茶素含量最高。庞道瑞^[7]检测了4个品种杨桃的游离酚提取物,其中Xiangmi和Taiguo的表儿茶素和原花青素B2含量最高,其品种间差异与本研究的结果基本一致。前人也从杨桃中检测到了没食子酸^[7]、丁香酸^[7]和香草酸^[28],本研究中未能检测到,可能是由于这些化合物的含量过低,也有可能是由于不同产地杨桃化学成分有一定差异。除了上述指认的酚类成分,杨桃中分离报道最多的是一类二氢查耳酮碳苷类成分^[2,8-9],是杨桃中一类特征性酚类物质,本研究液相色谱图中（图2）保留时间在20—22 min的3个主要色谱峰具有二氢查耳酮类化合物的紫外吸收特征（223 nm、280 nm）,并且洗脱极性也与文献报道的较为接近,因此推测为二氢查耳酮碳苷类成分,但由于缺少标准品,具体还有待进一步确认。

3.2 杨桃果实酚类物质的生物可及性分析

食物中多酚的生物利用度取决于几个因素,包括它们在胃肠道消化过程中释放（即生物可及性）、吸收、代谢以及循环系统中的运输^[11]。由于食物基质的复杂性,酚类物质可能与其他成分（主要是多糖）交互,从而减少了酚类物质的释放,使得其含量被低估^[31]。而生物可及性研究可以让人们更近距离地了解在食用某些食物时,体内会发生什么,因而可以更科学、客观地评价食品的营养价值。

不同种类食品中酚类物质的生物可及性已有报道,蔬菜、豆类、谷物的平均生物可及性分别为26.01%、25.47%、28%^[32,33],而水果的生物可及性显著高于其他食物^[34],且由于果实基质成分的不同,不同种类水果多酚的释放和吸收机制可能大不相同^[35]。LINGUA等^[36]研究发现红葡萄在胃消化后释放的生物可及性花青素、黄酮和酚酸分别达到了总含量的45%、73%和80%;肠消化后在可透析的部分中测得6%生物可及性的总酚含量,而在不可透析的部分中发现了10%的酚类物质,代表可能的结肠可用化合物。SUN等^[37]曾报道柑橘类水果经过胃肠消化后黄酮类物质的生物可及性达到79%。本研究结果显示,胃消化后样品生物可及性的总酚含量变化范围为54.05%—76.98%,生物可及性的总黄酮含量变化范围为47.58%—93.88%,与葡萄的生物可及性相当。表明模拟胃液消化能够促进杨桃中酚类物质的释放,可能是在胃蛋白酶和胃酸作用下,酚类物质从蛋白、多糖等的交联作用中释放,并从结合态转化为游离态^[38,39]。TOYDEMIR等^[40]发现酸樱桃经胃消化后总酚含量显著高于去离子水组,生物可及性增加,与本研究结果一致。胃肠消化后测得所有供试品种杨桃消化液中的总酚、总黄酮含量均比胃消化液低,生物可及性也大大降低,生物可及性的总酚含量变化范围为46.57%—66.45%,生物可及性的总黄酮含量变化范围为40.12%—84.75%,远远高于葡萄的生物可及性。其中GZ杨桃在胃肠消化后释放的生物可及性黄酮达到84.75%,与柑橘水平相当。刘国艳等^[41]发现,芹菜汁在胃消化过程中其总酚含量增加较快,肠消化后总酚含量降低;TAGLIAZUCCHI等^[42]利用模拟胃肠条件的体外模型研究了葡萄多酚的生物可及性,发现在胃消化过程中,生物可及的多酚、黄酮类化合物和花青素的数量增加,而肠道环境的转变导致所有被分析的多酚类物质的含量均下降,分析原因可能是花青素和其他黄酮类化合物在中性或微碱性环境下不稳定而发生降解^[43,44]。GZ杨桃提取物的总酚含量不高,但胃消化、胃肠消化后释放的生物可及性多酚水平均显著高于其他品种,而XM杨桃虽然酚类物质含量在3个品种中最高,但是胃消化、胃肠消化后释放的生物可及性多酚远少于GZ杨桃,可见,食用富含多酚的XM品种时,消费者真正吸收利用的酚类物质可能反而低于酚类物质相对较低的GZ品种。可能的原因是不同品种杨桃果实的基质成分存在差异,食物基质可以是碳水化合物、脂类、蛋白质和植物化学物质等组成的非常复杂的混合物,它们之间的相互作用可能会减少通过胃肠道释放多酚的数量^[45,46]。基质成分中存在的不可消化的化合物,如纤维,抗性淀粉,蛋白质等也会降低多酚的生物可及性^[47,48]。也可能是由于不同品种杨桃酚类化合物的构成谱和分子大小存在差异,使酚类物质释放的难易程度不一^[49]。GZ杨桃可能含有更多生物可及性高的单体酚。

除原儿茶酸外,所有被检单体酚的含量在胃肠消化后均显著降低了（表4）。3个品种杨桃的原花青素B2、表儿茶素和异槲皮苷含量较胃消化后显著下降,可能是由于肠道消化的化学环境呈弱碱性,而黄酮类物质对碱性条件比较敏感,容易在碱性条件下降解为其他化合物,因此,黄酮类物质在肠消化液中的含量与胃消化液相比有所减少^[50]。XM杨桃中原儿茶酸在胃肠消化后第一次被检测到,这可能是由于黄酮和原花青素等酚类成分在消化过程中发生降解反应生成了原儿茶酸^[51]。

3.3 杨桃果实酚类物质的抗氧化活性分析

酚类物质是果蔬中重要的活性物质,其在贡献电子后能产生稳定的中间体,能有效的在细胞和生理水平上防止氧化^[52]。本研究中杨桃果实的抗氧化活性是通过ABTS⁺自由基清除能力和ORAC抗氧化能力来测定的。XM杨桃的ABTS和ORAC抗氧化能力均为受试品种中最强,胃消化后,GZ和TW杨桃消化液的ABTS抗氧化能力与杨桃果实提取物相当,而XM杨桃消化液的ABTS抗氧化能力显著高于杨桃果实提取物（P<0.05）。胃消化后所有受试品种杨桃消化液的ORAC抗氧化能力都显著高于杨桃果实提取物,与樊梓鸾等^[53]得到的结果相似,并分析可能是由于胃酸水解和胃蛋白酶酶解等消化作用,结合态多酚转变成游离态多酚,也说明酚类物质在胃液消化后有更优的抗氧化能力,功能活性更强。而经进一步肠消化后,3个品种杨桃消化液的抗氧化能力较胃消化液均显著降低（P<0.05）。这可能是与酚类物质在碱性环境中不稳定,部分发生降解有关^[53];也可能是由于黄酮类化合物与胰蛋白酶结合后形成络合物,其溶解性降低,给电子能力被显著抑制,进而降低了其抗氧化活性^[54]。

大量研究表明,果蔬的抗氧化能力与其酚类物质含量有密切的联系^[55,56]。XU等^[57]测定了31种葡萄的ABTS抗氧化活性变化范围为19.09—162.53 mg TE/g FW,LI等^[58]测定了11种葡萄的果皮和果肉的ORAC抗氧化活性,结果显示葡萄皮的ORAC值变化范围为9.62—190.57 μmol TE/g FW,而葡萄果肉的ORAC值最大仅为16.24 μmol TE/g FW。ZHANG等^[59]测定了19种柑橘类水果的ABTS抗氧化活性变化异范围为64.24—97.31 mg TE/g FW,而其ORAC值达到395.66—834.37 μmol TE/g DW。在本研究中,受试杨桃果实提取物的ABTS值变化范围为49.98—56.30 mg TE/g FW,ORAC值变化范围为30.67—37.09 μmol TE/g FW,均高于葡萄果肉的抗氧化活性,但不如柑橘类水果的抗氧化能力强。其中XM杨桃的ABTS和ORAC抗氧化值最高,这与其总酚、总黄酮含量最高是一致的。无论是胃消化后还是胃肠消化后,GZ杨桃释放入消化液的总酚、总黄酮含量都是受试品种中最高的,但其ABTS清除自由基能力却显著低于XM杨桃,这可能是由于不同品种杨桃酚类物质构成谱有所差异。不同结构的酚类物质抗氧化活性差异较大^[60,61],相比于GZ杨桃,XM杨桃中可能富含一些高抗氧化活性的酚类成分。在本研究中,受试杨桃中含量最高的两种单体酚是原花青素B2和表儿茶素,已有研究表明原花青素B2和表儿茶素具有良好的ABTS自由基清除能力和综合抗氧化能力^[62,63]。本研究中,胃消化后受试杨桃（GZ、XM、TW）消化液的ABTS值和ORAC值均降低,原花青素B2和表儿茶素含量也表现为减少,通过SPSS 24.0软件进行Pearson相关性双尾检验发现,杨桃消化液的ABTS值与原花青素B2、表儿茶素的相关性系数分别为0.847*和0.900*,ORAC值与原花青素B2、表儿茶素的相关性系数分别为0.935**和0.980**,呈显著性相关,提示原花青素B2和表儿茶素可能是杨桃果实抗氧化能力的主要贡献物质。

本研究也存在一些不足,比如水果的抗氧化活性不仅仅只与酚类物质有关,类胡萝卜素、维生素C等也有一定活性^[64],本研究未对其他成分进行研究。另外,在食物消化的过程中,大多数的游离态酚类物质是在上消化道中酶的作用下释放出来的,而结合态酚类物质主要是在下消化道酶及微生物酶的作用下释放^[65,66],庞道瑞^[7]测定了4个品种杨桃果实的游离酚和结合酚,发现结合酚仅占总酚含量的2.18%— 7.70%,因此本研究没有对杨桃果实结合酚进行研究。许多研究结果表明,进入下消化道的酚类物质同样具有健康功效^{[67,68,69,70]}。今后,可以对杨桃果实酚类物质在下消化道的变化规律进行深入研究。

4 结论

原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸、原花青素B2、表儿茶素和异槲皮苷是杨桃中主要的酚类物质,其中原花青素B2和表儿茶素的含量较高。杨桃经模拟胃液消化后消化液含有较高的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性,其中总酚含量变化范围为54.05%—76.98%,生物可及性的总黄酮含量变化范围为47.58%—93.88%;而模拟胃肠消化后消化液中酚类物质含量和抗氧化活性均显著降低。

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