吴垚群¹, 陈少康³, 盛熙晖¹, 齐晓龙¹, 王相国¹, 倪和民¹, 郭勇¹, 王楚端^,2, 邢凯^,1 1 北京农学院动物科学技术学院,北京 102206
2 中国农业大学动物科技学院,北京 100193
3 北京市畜牧总站,北京 100101

Differential Expression of mRNA and lncRNA in Longissimus Dorsi Muscle of Songliao Black Pig and Landrace Pig Based on High-Throughput Sequencing Technique

WU YaoQun¹, CHEN ShaoKang³, SHENG XiHui¹, QI XiaoLong¹, WANG XiangGuo¹, NI HeMin¹, GUO Yong¹, WANG ChuDuan^,2, XING Kai^,1 1 College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206
2 College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193
3 Beijing Animal Husbandry Station, Beijing 100101

通讯作者: 王楚端,E-mail： cdwang@cau.edu.cn邢凯,E-mail： xk181986@163.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2018-12-10接受日期:2019-12-5网络出版日期:2020-02-16

基金资助:

国家重点研发计划资助.2018YFD0501000 现代农业产业技术体系北京市创新团队.BAIC02-2018 北京市教委2019年度科技计划一般项目.KM201910020010 北京农学院青年教师科研基金.SXQN201807 北京农学院“大北农青年教师科研基金”

Received:2018-12-10Accepted:2019-12-5Online:2020-02-16
作者简介 About authors
吴垚群,E-mail：1530321769@qq.com。











摘要
【背景】肌肉生长和脂肪沉积是猪生产中非常重要的经济性状,同时也是复杂的数量性状,受到众多因素的影响。长白猪原产于丹麦, 是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一, 具有生长速度快, 瘦肉率高等特点,但肉质欠佳。松辽黑猪是以民猪、长白猪和杜洛克猪为素材经过三元杂交育成的黑色母系地方培育品种,具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性。二者在肉质方面存在较大差异。【目的】采用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪的背最长肌转录组进行分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）,为猪肉品质研究提供新的参考信息。【方法】采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌作为样本,提取其RNA,将每个品种内的个体取等量RNA混池,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对混池后的样本RNA进行测序,然后对所获得的Reads进行比对、注释和差异表达等分析,筛选出差异表达mRNA和lncRNA并进行相关生物学功能富集分析。而后在筛选出的差异表达mRNA和lncRNA中各挑选10个基因,包括5个上调基因和5个下调基因,采用荧光定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR）方法鉴定所选mRNA和lncRNA的表达水平,并验证测序结果的可靠性。【结果】将得到的原始数据进行质量控制后,每个样本分别得到103 M和150 M reads,其中98%以上reads质量较高,满足进行下一步分析的要求。将reads比对到参考基因组上,共得到26 774个转录本,其中包括8 428个新的转录本。采用edgeR软件包进行差异表达分析,参考标准是错误发现率（false discovery rate, FDR）小于0.05和差异倍数大于2（fold change, FC）。在2个猪种中共得到4 239个显著差异表达的mRNA,其中在松辽黑猪肌肉中2 023个上调,2 216个下调。其中HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1和ZNF7等基因参与脂类代谢和肌肉发育相关的调控。差异表达的mRNA的生物学功能富集分析发现,其主要富集在细胞发育、生物代谢调控、肌肉发育、脂类代谢等相关的信号通路和生物代谢途径上。同时,在2个猪种中还检测到的178个差异表达显著的lncRNAs,其中在松辽黑猪肌肉组织中有84个上调,94个下调。联合差异表达lncRNAs的靶基因预测和差异表达基因结果分析,显示有4个差异表达的lncRNA与差异表达mRNA存在潜在的调控关系,分别是TCONS-00041713、TCONS-00041712、ENSSSCT00000034982、ENSSSCT00000034269。同时10个差异表达mRNA和10个差异表达lncRNA的RT-PCR结果显示：其表达水平在两组中同样差异显著,且与转录组测序中表达的趋势相似,表明高通量测序结果具有可靠性。 【结论】 获得了影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和lncRNA,同时发现了几对差异表达lncRNA和mRNA之间可能存在着潜在的调控关系。这些潜在调控关系的发现,可能对于研究调控肌肉组织代谢活动的分子机制的具有一定意义,并为其提供新的参考信息。
关键词： 松辽黑猪;长白猪;背最长肌;mRNA;lncRNAs

Abstract
【Background】Muscle growth and fat deposition are important economic traits in pig production and are also complex quantitative traits. Landrace, originally from Denmark, is one of the world-famous lean-type, with fast growth and high lean meat rate, but its meat quality is poor. Songliao black pig is a black maternal local cultivar cultivated by ternary cross-breeding with the Min pig, the Landrace pig and the Duroc pig, which has the characteristics of high reproduction rate, good meat quality, strong adaptability, roughage resistant and etc. There is a big difference in meat quality between the Songliao Black Pig and Landrace Pig. 【Objective】 In this study, high-throughput sequencing technique was used to analyze the longissimus dorsi transcriptome of Songliao black pig and Landrace. The key mRNA and long non-coding RNA（lncRNA）, affecting muscle growth, meat quality and fat deposition were selected to provide new reference information for the study of pork quality. 【Method】We collected the longissimus dorsi muscle of 6 Songliao black pigs and 6 Landrace to extract RNA. Individuals in each cultivar were sampled in the same RNA mixing pool and sequenced by Illumina HiSeq 2500 high-throughput sequencing technology. Reads were compared, annotated and differentially expressed. Differentially expressed genes and lncRNAs were screened out and their biological functions were enriched. Moreover then, ten genes, including five up-regulated genes and five down-regulated genes, were selected from the differentially expressed RNA and lncRNA, and the relative expression levels of differentially expressed mRNA and lncRNA were detected by real-time PCR. 【Result】After quality control, each sample received 103 M and 150 M reads, of which more than 98% of the reads were of higher quality, meeting the requirements of further analysis. The reads were aligned to the reference genome and a total of 26 774 transcripts were obtained, of which 8 428 were new transcripts. Using edgeR for differential expression analysis, the reference standards are False Discovery Rate(FDR)＜0.05 and fold change (FC)＞2. A total of 4 239 significant differentially expressed genes were obtained, of which 2 023 were up-regulated and 2 216 were down-regulated in Songliao black pig muscle. Meanwhile, 178 significant differentially expressed lncRNAs were detected, of which 84 were up-regulated and 94 were down-regulated in Songliao black pig muscle tissue. The biological function enrichment analysis of differentially expressed genes revealed that it is mainly enriched in cell components and cell development, biological metabolism regulation, and signaling pathways and biological metabolic pathways involved in muscle development and lipid metabolism. The target gene prediction results of the screened lncRNA showed that there was a potential differential relationship between the four differentially expressed lncRNAs and the differentially expressed genes, namely TCONS-00041713, TCONS-00041712, ENSSSCT00000034982, ENSSSCT00000034269. At the same time, the results of real-time PCR analysis of 10 differentially expressed mRNAs and lncRNAs showed that the results of real-time PCR were similar to the expression of transcriptome sequencing of the longissimus dorsi muscle tissue of Songliao black pig and Landrace, indicating that high throughput sequencing results are reliable.【Conclusion】We obtained the key mRNA and lncRNA that affect the muscle growth, meat quality, and fat deposition of pigs. Meanwhile, it was found that there may be a potential regulatory relationship between several pairs of differentially expressed lncRNA and mRNA.The discovery of these differentially expressed mRNAs and lncRNAs and possible potential regulatory relationships may have a certain significance for studying the molecular mechanisms that regulate metabolic activity in muscle tissue and provide new reference information.
Keywords：Songliao black pig;Landrace pig;longissimus dorsi muscles;mRNA;lncRNAs


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本文引用格式
吴垚群, 陈少康, 盛熙晖, 齐晓龙, 王相国, 倪和民, 郭勇, 王楚端, 邢凯. 用高通量测序技术研究松辽黑猪与长白猪背最长肌 mRNA和lncRNA的差异表达[J]. 中国农业科学, 2020, 53(4): 836-847 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.04.015
WU YaoQun, CHEN ShaoKang, SHENG XiHui, QI XiaoLong, WANG XiangGuo, NI HeMin, GUO Yong, WANG ChuDuan, XING Kai. Differential Expression of mRNA and lncRNA in Longissimus Dorsi Muscle of Songliao Black Pig and Landrace Pig Based on High-Throughput Sequencing Technique[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(4): 836-847 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.04.015

0 引言

【研究意义】 长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类转录长度大于200nt的非编码RNAs。目前许多研究已证实,lncRNA 参与了广泛的基因表达的调控过程,在细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤的发生和发展中发挥重要作用^[1,2]。随着高通量测序技术的广泛应用,已经有众多的lncRNA在肌肉发育和脂肪沉积中的作用被发现^[3,4,5]。由此可见lncRNA是基因表达调控的重要因素,本研究的意义在于通过对不同品种猪背最长肌组织中lncRNA的研究,进一步解析猪骨骼肌生长发育和脂肪沉积的分子机理。【前人研究进展】骨骼肌占哺乳动物总体重的50%左右^[6]。多个研究发现lncRNAs在骨骼肌发育过程中起着关键作用。在小鼠成肌细胞中,一个lncRNA位于发育多能性相关2（developmental pluripotency associated 2, Dppa2）基因上游,其转录产物可以招募多种DNA甲基化转移酶到Dppa2基因的启动子区域,使Dppa2 基因沉默,进而促进成肌细胞的分化和肌肉再生^[7]。lncRNA H19由H19/胰岛素样生长因子2（insulin like growth factor 2, IGF2）基因座母体等位基因转录,在胚胎发育和成年机体的肌肉组织中表达较高,H19 通过结合某些复合物,起到抑制IGF2转录的作用^[8]。LU等人发现lncRNA YY1相关肌发生RNA 1（YY1-associated myogenesis RNA 1, Yam-1）,受转录因子YY1（YY1 transcription factor, YY1）的正向调控,Yam-1可以激活miR-715、抑制Wnt家庭成员7B（Wnt family member 7B, Wnt7b）的表达,可以作为肌细胞抑制因子发挥作用^[9]。在牛骨骼肌组织中,lncRNA-133a可以促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖,对牛骨骼肌卫星细胞的增殖有着正向调控作用^[10]。lncRNA 作为基因表达的重要调控分子,可以通过多种作用机制,从转录水平、转录后水平以及染色质水平调节靶基因的表达,进而调控生命活动^[11]。【本研究切入点】猪骨骼肌的生长发育与其生长速度和瘦肉率息息相关,直接关系着生猪养殖的生产效益。猪肌肉生长发育的差异是导致不同品种猪肉品质差异的重要原因。松辽黑猪是我国培育的第一个瘦肉型黑色母系品种,是由杜洛克猪、长白猪和东北民猪3个品种经过长时间杂交培育而成的一个培育品种。松辽黑猪具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性,同时松辽黑猪的肌内脂肪含量可达3.19%,猪肉品质极佳^[12]。长白猪原产于丹麦, 是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一,具有生长速度快,瘦肉率高等特点。研究发现,二者在肉质方面存在较大差异^[12,13]。因此,以松辽黑猪和长白猪作为试验对象来研究lncRNA与不同猪品种骨骼肌发育差异的关系,有利于研究lncRNA在猪肌肉发育过程中的分子机制。目前已有多项研究证实lncRNA在猪肌肉发育过程中发挥作用,但lncRNA在中外不同品种猪肌肉生长发育过程中的差异性以及参与的生物学信息还有待于深入研究。【拟解决的关键问题】采用高通量测序技术对其背最长肌转录组进行测序分析,筛选差异表达的mRNA和lncRNAs,并进行相关生物信息学的分析。最终筛选出关于猪肌肉发育和脂肪沉积的关键mRNA和lncRNAs,以加深对肌肉生长发育和脂肪沉积分子调控机制的了解,为国内外猪品种在肉质和生长性状方面形成差异的分子机理研究提供新的参考信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的长白猪和松辽黑猪来自天津宁河原种猪场。所有动物均在统一条件下饲养管理,自由采食和饮水。饲养至体重为100kg左右时进行屠宰。屠宰在华都阳光食品公司进行。屠宰标准按照GB/T 17236-2008生猪屠宰操作规程进行^[14]。屠宰后,立即将背最长肌组织移至液氮中进行冷冻保存,待提取RNA使用。

1.2 总RNA提取和建库

采用Trizol法按照产品说明提取每个背最长肌组织的总RNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测总RNA 的完整性以及有无DNA 污染。采用Nanodrop、Qubit 2.0和Aglient 2100方法检测各样品的浓度、纯度和完整性等。保证样品浓度≥500 ng·µL^-1,28S:18S ＞1.0,RIN≥8。将每个品种的6个样品的总RNA等量混合后,进行混池建库,随后利用Illumina HiSeq 2500 (Illumina, America)平台进行双末端测序。文库的构建及测序在广州基迪奥生物科技有限公司进行。

1.3 数据的质控、比对和组装

FastQC软件（http://www.bioinformatics.babraham. ac.uk/projects/fastqc/）用于对原始数据的质量控制,质控的标准为：（1）去除含adapter的reads;（2）去除含N比例大于10% 的reads;（3）去除低质量reads （质量值Q≤20的碱基数占整条read的50%以上）^[15]。TopHat2将高质量的序列数据（clean reads）比对到猪的参考基因组Sus scrofa 11.1中^[16]。Cufflinks流程用于数据的转录本组装、注释与合并^[17]。HT-seq软件用于每个样本中基因表达量的计算^[18]。

1.4 差异表达基因的功能富集分析

基因本体(gene ontology, GO )数据库 (http://www. geneontology.org/) 被用于差异表达基因的GO功能富集分析,包括细胞组分,分子功能和生物学过程。超几何检验被用于P-value的计算其公式为

$P=1-\sum^{m-1}_{i=0}\frac{(^{M}_{i})(^{N-M}_{n-i})}{(^{N}_{n})}$

式中：N为所有Unigene中具有GO注释的转录本数目;n为N中差异表达转录本的数目;M为所有Unigene中注释为某特定GO 条目的转录本数目;m为注释为某特定GO条目的差异表达转录本数目。FDR被用于校正原始的P value。FDR＜0.05的GO terms被鉴定为显著富集的通路。京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 数据库 (https://www.genome.jp/kegg/) 被用于通路研究。同样,采用上述的方法和阈值鉴定差异表达基因的显著富集通路。

1.5 lncRNA的鉴别

首先,筛选cuffcompare转录本类别符号为“I”、“j”、“o”、“u”、“x”的转录本,其可能是新的lncRNA。进一步,为了剔除其中的小的非编码RNA,过滤掉其中外显子总长度小于200nt及只有1个或无外显子的转录本。将剩下的转录本通过CPAT（Computerized Progressive Attention Training ）软件^[19]进行lncRNA的初步预测。为了得到可靠的lncRNA,继而利用CPC（Cetylpyridinium Chloride）软件^[20]对CPAT软件预测的结果进行进一步lncRNA的识别。Cufflinks用于对筛选出来的lncRNA进行定量分析^[17]。

1.6 基因及lncRNA的差异表达分析

采用FPKM（fragments per kb per million fragments）的方法校正基因的表达水平,其同时考虑到了测序深度和基因长度对基因计数的影响^[21]。edgeR软件包被用于筛选差异表达基因^[22],其标准为FDR＜0.05且|log₂FC|＞1。

1.7 差异表达lncRNAs的靶基因的预测

基于lncRNA的顺式作用和反式作用方式预测差异表达lncRNA的靶基因。在lncRNA基因组位置上下游100kb的基因认为是该lncRNA潜在的靶基因。利用RNAplex软件来预测lncRNA通过碱基互补配对的反式作用模式的潜在靶基因^[23]。

1.8 测序结果可靠性分析

为了验证测序结果的可靠性,对差异表达的mRNA和lncRNA进行验证。挑选10个差异表达的mRNA和10个差异表达的lncRNA,包括5个上调基因和5个下调基因,进行RT-PCR验证。RT-PCR所使用的cDNA由高通量测序使用的剩余的RNA样品反转录产生。设计所挑选基因的引物,使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因作为内部对照,引物均由上海生工合成（表1）。进行RT-PCR,并使用2-ΔΔCt方法计算样品之间基因的相对表达水平。

Table 1
表1
表1引物序列
Table 1Primer sequences

基因Gene	上游引物（5′-3′）Forward primer	下游引物（5′-3′）Reverse primer
HPSE	GCGTTCCTGTCCGTAACCAT	ATGCGGGAGACAAACCTCTG
BTK	TTTCAGCACCATCCCTGAGC	ACGGCGCATTCTTGTTTTGT
SFT2D2	ACTGTCTTCCTCATGGGACC	GTGCAAAACACAACAGCACC
SMAD6	CCCATCTTCGTCAACTCCCC	GCTCGAAGTCGAACACCTTG
FGF10	AGATGTCCGCTGGAGAAAGC	TCCAGGATACTGTACGGGCA
TECRL	CAAAGCATGTGGGCCCTTTT	GTGGTCCAACTGACTTGTTGAC
PRKD2	CTACAACCGCTCACTGGACAT	TGCGTTCTGGATCTGGTCAT
TRAPPC2	ACCAGTTCATAGCACACGCT	GCCGAGACAAACCACTCATTG
HOXD1	CGCACGAATTTCAGCACCAA	TCAGCTGCAATGAGTTGGCT
ATP2B3	GGAGCAGAAGTTCACCGTCA	GGCAGCAGGTCTCCGTATTT
TCONS-OOO52690	GGGAAATCCAGCATCGTGTG	CCACAAGGCACAGTTTTGGTC
TCONS-OOO59635	AGCGTTTATTCCTCCCAGGC	AGGTACTTGTAGGGCCGGTA
TCONS-OOO35174	CACCGTAGGGTCGTTGCA	CATCCTTCCTTCCGTCCAG
TCONS-OOO39610	ACACCTTGGGACCCCAACTA	GGCCAGAATGACGGATGACA
TCONS-OOO59695	CAGGGTTGTCCAGCCAATGT	TGCTGGGCTGTCATCCTCTT
TCONS-OOO16916	ATTACTTTGCCCCGGAGGTCT	TAATTAGGGCTTCCCGGGTCT
TCONS-OOO46917	TGCCCGATACTGTAATGCCA	CATTCCCCGAGCACGGATTC
TCONS-OOO67508	CGTGGACGAAAAACGATCCG	CTTCACCTCGTTCAGGGCTT
TCONS-OOO36675	GGTCTTCCAAATCGGTTGCC	ACAGGGGTTGCTTTGGTGTA
TCONS-OOO52912	GGACCTGGACCCAATCAACT	TGATGATGGCACGGAATGGT
GAPDH	TATGATTCCACCCACGGCAA	CCATTTGATGTTGGCGGGAT

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2 结果

2.1 测序数据的质量及比对信息

本研究通过Illumina HiSeqTM 2000测序平台对松辽黑猪和长白猪的背最长肌组织mRNA进行测序,每个样本平均得到约10G数据量。测序数据的Q20在96%以上,Q30在91%以上,测序质量良好。对原始数据质控后,平均每个样本得到18 224 475 795条150bp的clean reads（表2）。除去比对到核糖体RNA上的reads后,平均81.22% 的clean reads比对到猪的参考基因组中,其中唯一比对到基因组位置的为79.49%。各项数据显示测序数据的质量较好,可以进行后续的分析。

Table 2
表2
表2质控前后样本测序数据的质量
Table 2Quality of sample sequencing data before and after QC

	样本 Sample	Reads数目 No.	Q20(%)	Q30(%)	N(%)	GC含量 GC content (%)
质控前 Before QC	SL	18817856700	96.92%	92.24%	0.01%	49.83%
	L	20211575400	96.60%	91.58%	0.01%	51.92%
质控后 After QC	SL	17560551309	98.01%	94.00%	0.01%	49.77%
	L	18888400280	97.82%	93.52%	0.01%	51.26%

SL表示松辽黑猪,L表示长白猪。SL stands for Songliao black pig, L stands for Landrace pig

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2.2 基因表达水平和差异分析

对转录本进行统计分析,松辽黑猪和长白猪得到的所有转录本数目分别是21 866个和21 972个,其中检测到新的转录本分别有7 846个和7 838个。对转录本的表达量统计发现,多数转录本的RPKM值在1 000以下,其中FPKM值在1以下转录本最多,为11 047个;FPKM值1—10之间的转录本为9 905个;FPKM值在10—100的转录本为2 915个;而FPKM值大于100的转录本只有363个,占总数的1.65%。同时,还发现两个样本的转录本表达丰度模式基本相同（图1）。

图1

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图1转录本表达量丰度分布函数图

横坐标为log₁₀（FPKM）值,数值越高,表示转录本表达量越高;纵坐标为转录本的密度,即为对应横轴表达量的转录本数/检测已表达转录本的总数;分布曲线的峰值表示整个样本转录本表达量最集中的区域
Fig. 1Transcript distribution abundance distribution function map

The abscissa is the log₁₀ (FPKM) value. The higher the value, the higher the transcript expression; the ordinate is the density of the transcript, which is the number of transcripts corresponding to the horizontal axis expression/detection of the total number of expressed transcripts; The peak of the distribution curve represents the region where the expression of the entire sample transcript is most concentrated


利用edgeR软件包来筛选差异表达基因,显著差异表达的条件为 FDR＜0.05且| log₂FC|＞1 。结果显示两组之间一共有4 239个基因显著差异,相对于长白猪,松辽黑猪组中2 023个显著上调,2 216个显著下调（图2）。

图2

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图2基因的差异表达分析

A图中横坐标表示样品间的差异倍数对数值,纵坐标表示两个样品的-log₁₀（FDR）值;红色表示长白猪相对于松辽黑猪的样本表达量上调和绿色表示表达量下调,黑色的点标志没有差异。B图中横坐标表示成对比较的样品,纵坐标表示差异表达的基因数
Fig. 2Results of differential expression analysis of genes.

In the graph A, the abscissa indicates the logarithm of the difference between the samples, the ordinate indicates the -log₁₀ (FDR) value of the two samples, and the red indicates the up-regulation of the sample expression and the green expression of the Landrace pig relative to the Songliao black pig. Down, there is no difference in the black dot mark. In the B diagram, the abscissa indicates the pairwise comparison of the samples, and the ordinate indicates the number of genes differentially expressed

2.3 差异表达基因功能分析

为了解差异表达基因涉及的生物学功能,使用超几何检验的方法对差异表达基因进行GO条目和KEGG通路的功能富集分析。富集GO条目的结果显示,差异表达基因主要分布在生物学过程、分子功能和细胞组成的三大类中的3 780个GO条目中,其中 1 314个是显著富集的（Q-value≥0.05）。主要参与的细胞膜的组成、跨膜运输、蛋白质结合、转运蛋白活性、能量代谢和氧化磷酸化等过程（表3）。对差异表达基因进行KEGG通路功能富集分析,共鉴定出25个显著的通路,其中包括生物素代谢、泛酸盐辅酶A生物合成、多聚糖生成、磷脂酰肌醇信号系统、肌动蛋白调控、溶酶体等通路（图3）。

Table 3
表3
表3差异表达基因最显著富集的GO条目
Table 3GO entries with the most significant enrichment of differentially expressed genes

类型 Type	GO条目 GO entries	基因数目 Number of genes	校正后P值 Corrected P value
细胞组成 Cell composition	膜组分 Membrane part	299	1×10-6
	膜内组分 Intrinsic component of membrane	249	1×10-6
	细胞器 Organelle	1825	1×10-6
	细胞内部分 Intracellular part	1890	1×10-6
	胞内 Intracellular	2003	1×10-6
	被膜小泡 Membrane-bounded vesicle	212	1×10-6
	包膜细胞器 Membrane-bounded organelle	1491	1×10-6
	细胞器膜 Organelle membrane	135	1×10-6
	胞内细胞器 Intracellular organelle	1624	1×10-6
	质膜组分 Plasma membrane part	68	1×10-6
分子功能 Molecular function	阳离子结合 Cation binding	316	1×10-6
	结合 Binding	1791	1×10-6
	蛋白质结合 Protein binding	705	1×10-6
	金属离子结合 Metal ion binding	171	1×10-6
	转换金属离子结合 Transition metal ion binding	128	1×10-6
	小分子结合（small molecule binding）	181	1×10-6
	碳水化合物衍生物结合（carbohydrate derivative binding）	164	1×10-6
	分子传感活性（molecular transducer activity）	75	1×10-6
	嘌呤核苷酸结合 Purine nucleoside binding	144	1×10-6
	核糖核苷结合 Ribonucleotide binding	144	1×10-6
生物过程 Biological process	调控代谢过程 Regulation of metabolic process	461	1×10-6
	调控大分子代谢过程 Regulation of macromolecule metabolic process	376	1×10-6
	生物过程的正调控 Positive regulation of biological process	246	1×10-6
	调控细胞代谢过程 Regulation of cellular metabolic process	312	1×10-6
	调控初级代谢过程 Regulation of primary metabolic process	295	1×10-6
	细胞过程的正调控 Positive regulation of cellular process	206	1×10-6
	基因表达调控 Regulation of gene expression	275	1×10-6
	分子功能调控 Regulation of molecular function	183	1×10-6
	调控刺激反应 Regulation of response to stimulus	196	1×10-6
	调控蛋白质代谢过程 Regulation of protein metabolic process	158	1×10-6

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图3

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图3差异表达基因的KEGG通路功能富集分析结果

圆的大小和颜色分别代表富集通路和富集显着性的差异表达基因的量
Fig. 3Functional enrichment analysis of KEGG pathways of differentially expressed genes

The size and color of the circle represent the enrichment pathway and the amount of differentially expressed genes with significant enrichment, respectively

2.4 新lncRNA的鉴定及差异表达分析

通过cufflinks、CPAT和CPC流程鉴定转录本中的lncRNA,共得到885个新的lncRNA。所鉴定出的新lncRNA中,在两个组中都有表达的lncRNA有792个,只在松辽黑猪和长白猪中表达的基因分别为49个和44个 (图4-A)。同样利用edgeR分析软件筛选差异表达分析,结果显示松辽黑猪和长白猪之间一共有178个非编码基因显著差异,其中在松辽黑猪中84个显著上调,94个显著下调（图4-B）。

图4

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图4lncRNA的差异表达分析

A图表示鉴定出的新lncRNA,蓝色在松辽黑猪中表达的lncRNA,红色表示在长白猪中表达的lncRNA,中间的交集表示松辽黑猪和长白猪中均表达的lncRNA;B图表示松辽黑猪和长白猪之间差异表达的lncRNA,横坐标表示样品间的差异倍数对数值,纵坐标表示两个样品的-log₁₀（FDR）值;红色表示长白猪相对于松辽黑猪的样本表达量上调和绿色表示表达量下调
Fig. 4Differential expression analysis results of lncRNA

A figure shows the identified new LNCRNA, blue shows the LNCRNA expressed in Songliao black pig, red shows the LNCRNA expressed in landrace pig, and the middle intersection shows the LNCRNA expressed in both Songliao black pig and landrace pig; B figure shows lncRNA of difference expression between Songliao black pig and landrace pig, horizontal coordinate shows logarithm of difference multiple between samples, vertical coordinate shows-log₁₀(FDR) value of two samples; The red color showed that the expression of landrace pig was up-regulated and the green color showed down-regulated compared with Songliao black pig

2.5 lncRNA的靶基因预测

基于lncRNA的作用模式,通过cis作用和反义作用预测差异表达lncRNA的靶基因。根据lncRNA的在染色体上的位置,共在241个新预测到的lncRNA的上下游500kb内找到342个编码基因。同时,在26个已知的lncRNA中发现81个编码基因。使用RNAplex软件预测lncRNA的反义作用靶基因,共鉴定得到84个lncRNA与编码基因存在碱基的互补配对的关系。

结合两组间差异表达分析和靶基因预测的结果发现,几对差异表达lncRNA和基因之间可能存在着潜在的调控关系。如新lncRNA TCONS_00041713和TCONS_00041712在ZNF7基因的上游;lncRNA ENSSSCT00000034982在ERNBP基因的下游且与HCFC1存在碱基互补配对的关系;新lncRNA TCONS_00024150分别与FGFR1和 ENSSSCT00000034063基因间存在碱基互补配对的关系（图5）。以上的这些潜在调控关系为研究lncRNA调控基因表达进而影响肉质品质提供新的素材。

图5

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图5lncRNA和基因之间存在的潜在调控关系

不同颜色表示基因的表达水平,黄色表示基因在松辽黑猪中表达量高,蓝色表示基因在长白猪中的表达量高。箭头表示lncRNA与基因之间存在的潜在调控关系。单向箭头代表基因上下游关系,箭头指向方向表示位于下游的基因;双向箭头表示基因之间存在碱基互补配对关系
Fig. 5Potential regulatory relationships between lncRNA and genes

Different colors indicate the level of gene expression. Yellow indicates that gene expression is high in Songliao Black pig, and blue indicates that gene expression is high in Landrace pigs. Arrows indicate potential regulatory relationships between lncRNA and genes. One-way arrows represent upstream and downstream relationships of genes, arrows point to downstream genes, and two-way arrows represent complementary pairing relationships between genes

2.6 测序结果的验证

通过RT-PCR对随机挑选的10个差异表达mRNA和10个差异表达lncRNA进行验证。结果表明,随机挑选的10个mRNA的RT-PCR结果与转录组测序结果表达趋势相似（图6-A）,同样随机挑选的lncRNA的验证结果也与转录组测序结果表达趋势相似（图6-B）,证实了松辽黑猪和长白猪背最长肌组织转录组测序结果具有可靠性,可以用于后续的深入研究。

图6

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图6差异表达基因的RT-PCR验证

通过RT-PCR验证松辽黑猪和长白猪背最长肌组织基因的差异表达
Fig. 6RT-PCR verification of differentially expressed genes

The differential expression of genes in the longissimus dorsi transcriptome of Songliao black pig and Landrace was verified by RT-PCR

3 讨论

本研究选用在肌肉品质和育肥期期间日增重方面存在较大差异的松辽黑猪和长白猪为对象,对其背最长肌进行RNA-seq测序,筛选与肌肉生长和脂肪沉积相关的基因。结合生物学功能分析发现了一些与松辽黑猪和长白猪背最长肌肌肉发育和脂肪沉积可能相关的mRNA和lncRNA。

猪的脂肪性状直接影响猪肉品质,如肌间脂肪含量、胴体瘦肉率等。猪脂肪组织的沉积能力具有品种差异,且不同品种的猪脂肪沉积能力具有较大差异^[24]。本研究中,通过功能富集分析发现了一些与脂类代谢差异性显著的信号通路和代谢途径,如磷脂酰肌醇信号通路、鞘脂信号通路、甘油磷脂代谢途径、醛固酮的合成与分泌,与之相关的基因包括二酰基甘油激酶α(diacylglycerol kinase α, DGKα)、磷脂酰肌醇-4-激酶α(phosphatidylinositol 4-kinase α, PI4Kα)、磷脂酰肌醇5-磷酸4激酶2α(phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type 2 α, PIP4K2α)、磷脂酶D1(phospholipase D1, PLD1)、脂肪酶F(lipase F, LIPE)、二酰基甘油脂酶α(diacylglycerol lipase α, DAGLα)、蛋白激酶D2(protein kinase D2, PRKD2)、脂质1(lipin 1, LPIN1)、3-磷酸甘油酰基转移酶4(glycerol-3-phosphate acyltransferase 4, GPAT4)。在筛选得到的差异表达基因中,发现一些基因同时参与不同信号通路和代谢途径,如DGKα,其在磷脂酰肌醇信号通路和甘油磷脂代谢中均有参与。DGKα属于二酰基甘油激酶家族,该酶类家族成员众多,主要作用为将1,2-二酰基甘油生成磷脂酸。DGKα是一种在含有特殊脂类和蛋白质分子的外泌体生成的过程中发挥重要调控作用的因子,其在脂类代谢活动中具有重要作用^[25]。前人研究发现,DGKα作为LIPF的下游分子,而LIPF与食物中的甘油三酯在胃肠道中的消化过程相关^[25]。因此可将DGKα基因作为影响猪脂类代谢活动重要候选基因之一。HE等研究发现在猪中LPIN1基因与肌内脂肪沉积及肌肉品质存在显著相关性,可影响肌内脂肪含量、瘦肉率和风味,故将LPIN1基因作为改善肌肉品质的候选基因之一^[26]。这些基因现在已知的功能均与能量代谢和氧化磷酸化相关,但是在猪中影响组织脂类代谢的机制还有待深入研究。

育肥期期间日增重是猪的一种重要的经济性状,其受到肌肉发育直接影响。本研究发现了一些在松辽黑猪和长白猪之间显著差异的信号通路和代谢途径与肌肉发育有关,可能是影响育肥期期间日增重差异的因素。这些信号通路和代谢途径包括肌动蛋白调控过程、磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine kinase, PI3K- AKt）信号通路、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP- activated protein kinase, AMPK）信号通路,参与这些生物过程的基因包括成纤维因子1（fibroblast growth factor 1, FGF1）、成纤维因子10（fibroblast growth factor 10, FGF10）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1）、肌醇多磷酸-1-磷酸酶（inositol polyphosphate-1-phosphatase, INPP1）、磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1, PIK3R1）、血管生成素2（angiopoietin 2, ANGPT2）。研究已经证实,FGF1在细胞增殖和细胞分化等多种生物学过程中发挥作用^[27];FGF10在多种细胞的增殖、迁移、分化和生存中起到重要的支持作用^[28]。PIK3R1基因可编码磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase, PIK3）的调节亚基p85α蛋白^[29,30],而PIK3作用于多种细胞外因子的信号转导,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多种生命活动中起到重要作用^[31]。可发现这些基因多数与细胞增殖、生长和分化等生命活动相关。在功能方面,多数与肿瘤细胞相关,但与肌肉细胞增殖生长的相关报道很少。因此,这些基因可作为研究肌肉发育的候选基因进行深入研究和验证。

在生物学功能分析中,本研究发现生物素代谢过程最为显著。生物素,又称为维生素H、辅酶R,是一种在机体内生物活动过程中必不可少的辅酶因子^[32]。GO功能分析发现全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase, HLCS）和生物素酶（biotinidase, BTD）基因参与了生物素代谢过程。HLCS作用是能够催化生物素与羧化酶及组蛋白结合^[33,34,35]。DO等在对猪饲料利用效率的研究中发现该基因与剩余采食量性状具有显著关联性,发现全羧化酶合成酶活性丧失时会对机体组织的葡萄糖、脂肪及蛋白质的代谢产生重要影响^[36]。而在本研究中发现HLCS基因在两个品种猪背最长肌组织中表达显著差异,提示HLCS可能参与了肌肉组织的生物代谢活动,与猪生长性状具有潜在联系。BTD缺乏时会导致肠道对生物素的摄取能力下降,导致体内生物素缺乏,使依赖于生物素的各种羧化酶（丙酰辅酶A羧化酶、丙酮酰羧化酶、乙酰辅酶A 羧化酶和甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶）的活性下降,影响糖类、脂肪及氨基酸代谢活动^[37]。

在本研究中通过对差异表达的lncRNA进行靶基因预测和功能分析,3个差异表达lncRNA与基因之间可能存在着潜在的调控关系,分别是TCONS- 00024150、TCONS-00041713、TCONS-00041712。其中新lncRNA TCONS-00041713和TCONS-00041712位于锌指蛋白7（zinc finger protein 7, ZNF7）基因的上游。ZNF7属于锌指蛋白家族,前人研究发现,许多锌指蛋白家族成员在脂肪生成过程中起到关键的作用^[38,39]。同时,在本研究发现新lncRNA TCONS- 00024150与FGFR1基因间存在碱基互补配对的关系,FGFR1在脂肪组织中最先被发现,其可能在血管新生、糖脂调节、新陈代谢等方面发挥作用^[40]。本研究表明新lncRNAs可能参与了肌肉组织的脂类代谢活动,为解释猪品种间脂肪性状差异性提供新的思路,可为脂肪性状相关的基因研究奠定理论基础。

综上所述,通过对松辽黑猪和长白猪背最长肌之间差异表达基因的鉴定与分析,筛选出多个参与肌肉发育和脂类代谢的候选基因,其包括HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1和ZNF7基因。这些基因可能对研究松辽黑猪和长白猪两品种间肌肉发育和肌肉脂类代谢的差异性研究具有参考价值。

4 结论

本研究通过高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪背最长肌肌肉组织进行RNA测序,通过基因比对分析,筛选出4 239个编码基因差异mRNA,其中2 023个显著上调,2 216个显著下调;与此同时,筛选出178个差异表达的lncRNAs,84个显著上调,94个显著下调。通过对差异表达基因进行GO功能分析和KEGG通路分析共筛选出了HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1和ZNF7等与脂类代谢和肌肉发育相关的基因,并且参与了相关的信号通路和生物代谢途径。结合差异表达基因分析和靶基因预测的结果发现,几对差异表达lncRNA和mRNA之间可能存在着潜在的调控关系。如新lncRNA TCONS_00041713和TCONS_00041712在ZNF7基因的上游;lncRNA ENSSSCT00000034982在ERNBP基因的下游且与HCFC1存在碱基互补配对的关系;新lncRNA TCONS_00024150分别与FGFR1和 ENSSSCT00000034063基因间存在碱基互补配对的关系。这些结果为了解松辽黑猪和长白猪之间肌内脂肪含量和肌肉发育性状差异的分子机制提供了新的参考。

参考文献 View Option 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] ARYAL B, ROTLLAN N, Fernandez-Hernando C . Noncoding RNAs and atherosclerosis
Current Atherosclerosis Reports. 2014,16(5):407.
[本文引用: 1]

[2] LEE J T, BARTOLOMEI M S . X-inactivation, imprinting, and long noncoding RNAs in health and disease
Cell, 2013,152(6):1308-1323.
[本文引用: 1]

[3] YANG Y, ZHOU R, ZHU S, LI X, LI H, YU H, LL K . Systematic identification and molecular characteristics of long noncoding RNAs in pig tissues
BioMed research International, 2017, doi: 10.1155/2017/ 6152582.
URL [本文引用: 1]

[4] XING K, WANG K, AO H, CHEN S, TAN Z, WANG Y, WANG C . Comparative adipose transcriptome analysis digs out genes related to fat deposition in two pig breeds
Scientific Reports, 2019,9(1):12925.
[本文引用: 1]

[5] 刘怡冰, 敖红, 邢凯, 王楚端 . 脂肪相关lncRNAs在动物中的研究进展
中国畜牧兽医, 2019,46(07):2021-2029.
[本文引用: 1]

LIU Y B, AO H, XING K, WANG C D . Advances in research of fat-related lncRNAs in animals
Chinese Animal Husbandry Veterinarian, 2019,46(07):2021-2029. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[6] ZHANG J, ZHOU C, MA J, CHEN L, JIANG A, ZHU L, SHUAI S, WANG J, LI M, LI X . Breed, sex and anatomical location-specific gene expression profiling of the porcine skeletal muscles
BMC Genetics, 2013,14:53. DOI: 10.1186/1471-2156-14-53.
URL [本文引用: 1]

[7] WANG L J, ZHAO Y, BAO X C, ZHU X H, KWOK Y K Y, SUN K, CHEN X N, HUANG Y H, JAUCH R, ESTEBAN M A, SUN H, WANG H T . lncRNA Dum interacts with Dnmts to regulate Dppa2 expression during myogenic differentiation and muscle regeneration
Cell Research, 2015,25(3):335-350.
[本文引用: 1]

[8] DEY B K, PFEIFER K, DUTTA A . The H19 long noncoding RNA gives rise to microRNAs miR-675-3p and miR-675-5p to promote skeletal muscle differentiation and regeneration
Genes Development, 2014,28(5):491-501.
[本文引用: 1]

[9] LU L N, SUN K, CHEN X N, ZHAO Y, WANG L J, ZHOU L, SUN H, WANG H T . Genome-wide survey by ChIP-seq reveals YY1 regulation of lincRNAs in skeletal myogenesis
EMBO Journal, 2013,32(19):2575-2588.
[本文引用: 1]

[10] 李燕, 陈明明, 张俊星, 张林林, 李新, 郭宏, 丁向彬, 刘新峰 . 牛lncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响
中国农业科学, 2019,52(1):143-153.
URL [本文引用: 1]

LI Y, CHEN M M, HANG J X, ZHANG L L, LI X, GUO H, DING X G, LIU X F . Effects of bovine lncRNA-133a on the proliferation and differentiation of skeletal muscle satellite cells.
College of Animal Science and Veterinary Medicine, 2019, 52(1):143-153. (in Chinese)
URL [本文引用: 1]

[11] LAU E . Non-coding RNA: Zooming in on lncRNA functions
Nature Reviews Genetics, 2014, 15(9):574.
[本文引用: 1]

[12] 张树敏, 陈群, 李娜, 金鑫, 赵晓东 . 松辽黑猪种质特性及其利用的研究
当代畜禽养殖业, 2006(06):42-45.
[本文引用: 2]

ZHANG S M, CHEN Q, LI N, JIN X, ZHAO X D . Study on germplasm characteristics and utilization of Songliao black pig.
Contemporary Livestock and Poultry Farming, 2006(06):42-45. (in Chinese)
[本文引用: 2]

[13] 贺希文, 高彩霞, 姜骞 . 加系SPF大白猪和长白猪群体遗传学分析
中国实验动物学报, 2015,23(6):551-556.
[本文引用: 1]

HE X W, GAO C X, JIANG Q . Genetic Analysis of the pedigreed population genetics of SPF Yorkshire and Landrace pigs imported from Canada
Chinese Journal of Experimental Animals, 2015,23(6):551-556. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[14] 李江华 , GB/T 17236-2008《生猪屠宰操作规程》的主要内容
肉类研究, 2014(7):彩插.
[本文引用: 1]

LI J H , GB/T 17236-2008 Main contents of the "Pest Management Procedure for Pigs".
Meat Research, 2014(7).(in Chinese)
[本文引用: 1]

[15] WINGETT S, ANDREWS S . FastQ Screen: A tool for multi-genome mapping and quality control
F1000 Research, 2018,7. DOI: 10. 12688/f1000research.15931.1
URL [本文引用: 1]

[16] KIM D, PERTEA G, TRAPNELL C, PIMENTEL H, KELLEY R, SALZBERG S L . TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions
Genome Biology, 2013,14(4):R36.
[本文引用: 1]

[17] TRAPNELL C, ROBERTS A, GOFF L, PERTEA G, KIM D, KELLEY D R, PIMENTEL H, SALZBERG S L, RINN J L, PACHTER L . Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks
Nature Protocols, 2012,7(3):562.
[本文引用: 2]

[18] ANDERS S, PYL P T, HUBER W . HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data
Bioinformatics, 2015; 31(2):166-169.
[本文引用: 1]

[19] SUN L, LUO H, BU D, ZHAO G, YU K, ZHANG C, LIU Y, CHEN R, ZHAO Y . Utilizing sequence intrinsic composition to classify protein- coding and long non-coding transcripts
Nucleic Acids Research, 2013,41(17):e166.
[本文引用: 1]

[20] KONG L, ZHANG Y, YE Z Q, LIU X Q, ZHAO S Q, WEI L, GAO G . CPC: assess the protein-coding potential of transcripts using sequence features and support vector machine
Nucleic Acids Research, 2007,35(Suppl.2):W345-W349.
[本文引用: 1]

[21] TRAPNELL C, WILLIAMS B A, PERTEA G, MORTAZAVI A, KWAN G, BAREN M J, SALZBERG S L, WOLD B J, PACHTER L . Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation
Nature Biotechnology, 2010,28(5):511.
[本文引用: 1]

[22] ROBINSON D M, MCCARTHY D J, SMYTH G K . edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data
.Bioinformatics, 2010, 26(1):139-140.
[本文引用: 1]

[23] TAFER H . RNAplex: a fast tool for RNA-RNA interaction search
Bioinformatics, 2008,24(22):2657-2663.
[本文引用: 1]

[24] WOOD J D, ENSER M, FISHER A V, NUTE G R, SHEARD P R, RICHARDSON R I, HUGHES S I, WHITTINGTON F M . Fat deposition, fatty acid composition and meat quality: A review
Meat Science, 2008,78(4):343-358.
[本文引用: 1]

[25] ALONSO R, MZAAEO C, RODRIGUEZ M C, MARSH M, FRAILE R A, AVILAFLORSE A, MERIDA I, IZQUIERDO M . Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes
Cell death and Differentiation, 2011,18(7):1161-1173.
[本文引用: 2]

[26] HE X P, XU X W, ZHAO S H, FAN B, YU M, ZHU M J, LI C C, PENG Z Z, LIU B . Investigation of LPIN1 as a candidate gene for fat deposition in pigs
Molecular Biology Reports, 2009,36(5):1175-1180.
[本文引用: 1]

[27] GROSE R, DICKSOM C . Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis
Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005,16(2):179-186.
[本文引用: 1]

[28] JOANNE W, CHIARA F . Regulation of FGF10 signaling in development and disease
Front Genetics, 2018, 9:500.
[本文引用: 1]

[29] KATSO R, OKKENHAUG K, AHMADI K, WHITE S, TIMMS J, WATERFIELD M D . Cellular function of phosphoinositide 3- kinases: implications for development, homeostasis, and cancer
Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2001,17:615-675.
[本文引用: 1]

[30] OKKENHAUG K, VANHAESEBROECK B . New responsibilities for the PI3K regulatory subunit p85 alpha
Science's STKE, 2001(65):pe1. DOI: 10.1126/stke.2001.65.pe1.
URL [本文引用: 1]

[31] CARNERO A, BLANCO-APARICIO C, RENNER O, LINK W, LEAL J F M . The PTEN/PI3K/AKT signaling pathway in cancer, therapeutic implications
Current Cancer Drug Targets, 2008,8(3):187-198.
[本文引用: 1]

[32] 郑巍振 . 生物素高产菌种选育的研究
[D]. 杭州: 浙江工业大学, 2010.
[本文引用: 1]

ZHENG W Z . Study on strain screening of high biotin-producing
[D]. Hangzhou: Zhejiang University of Technology, 2010. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[33] WOLF B . Disorders of biotin metabolism
[M]//SCRIVER C R, BEAUDET A L, SLY W S. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, New York: McGraw-Hill, 2011: 3935-3956.
[本文引用: 1]

[34] STANLEY J S, GRIFFIN J B, ZEMPLEMI J . Biotinylation of histones in human cells: Effects of cell proliferation
FEBS Journal, 2001,268(20):5424-5429.
[本文引用: 1]

[35] KOBZA K, CAMPOREALE G, RUECKERT B, KUEH A, GRIFFIN J B, SARATH G, ZEMPLENI J . K4, K9 and K18 in human histone H3 are targets for biotinylation by biotinidase
FEBS Journal, 2005, 272(16):4249-4259.
[本文引用: 1]

[36] DO D N, OSTERSEN T, STRATHE A B, MARK T, JENSEN J, KADARMIEDEEN H N . Genome-wide association and systems genetic analyses of residual feed intake, daily feed consumption, backfat and weight gain in pigs
BMC Genetics. 2014,15:27.
[本文引用: 1]

[37] WEI S, ZHANG L, ZHOU X, DU M, IIANG Z, HAUSMAN G J, BERGEN W G, ZAN L, DODSON M V . Emerging roles of zinc finger proteins in regulating adipogenesis
Cellular and Molecular Life Sciences, 2013,70, 4569-4584.
[本文引用: 1]

[38] TSENG K, Y CHEN, Y H, LIN S . Zinc finger protein ZFP36L1 promotes osteoblastic differentiation but represses adipogenic differentiation of mouse multipotent cells
Oncotarget,2017, 8, 20588-20601.
[本文引用: 1]

[39] HU X M, ZHOU Y F, YANG Y, PENG J, SONG T X, XU T, WEI H K, JIANG S W, PENG J . Identification of zinc finger protein Bcl6 as a novel regulator of early adipose commitment
Open Biology, 2016,6, 1-14.
[本文引用: 1]

[40] SPOLCOVA A, HOLUBOVA M, MIKULASKOVA B, NAGELOVA V, STOFKOVA A, LACINOVA Z, JURCOVICOVA J, HALUZIK M, MALETINSKA L, ZELEZNA B . Changes in FGF21 serum concentrations and liver mRNA expression in an experimental model of complete lipodystrophy and insulin-resistant diabetes
Physiology Research, 2014,63(4):483-490.
[本文引用: 1]