牦牛Linc24063的克隆鉴定及其与miRNAs 表达水平的相关性分析

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¹西南民族大学,青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室,成都 610041

²西南民族大学,青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,成都 610041

³西藏自治区农牧科学院, 省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室,拉萨 850002

Cloning and Identification of Long-Chain Non-Coding RNA Linc24063 and Its Correlation with the Expression Level of miRNAs in Yak

WANG Hui¹^,², CHAI ZhiXin¹^,², ZHU JiangJiang¹^,², ZHONG JinCheng^,¹^,², ZHANG ChengFu³, Xin JinWei³

¹Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization (Southwest Minzu University), Ministry of Education, Chengdu, 610041

²Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Southwest Minzu University, Chengdu, 610041

³State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences(TAAAS), Lhasa 850002;

通讯作者: 钟金城,E-mail: zhongjincheng518@126.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2018-11-5接受日期:2019-05-9网络出版日期:2019-07-16

基金资助:

四川省科技计划.2019YJ0257
省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室开放基金课题.XZNKY-2019-C-007K08
国家肉牛牦牛产业技术体系.CARS-37

Received:2018-11-5Accepted:2019-05-9Online:2019-07-16
作者简介 About authors
王会,E-mail: wanghui892321@sina.cn。

摘要
【目的】通过对牦牛长链非编码RNA Linc24063进行克隆鉴定,分析其在乳腺组织中与miRNAs表达量的相关性,为Linc24063通过调控miRNA发挥功能的调控机制研究提供试验依据。【方法】选取4.5岁处于第一泌乳期的健康母牦牛12头,清晨空腹屠宰后,迅速采集大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢组织,提取组织总RNA,利用5′ RACE和3′ RACE方法克隆牦牛Linc24063序列;利用生物信息学对其序列保守性、染色体定位及编码潜能进行分析,然后利用原核表达试验对其编码能力进行验证;利用RT-qPCR检测其在大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢的表达水平。利用普通牛和绵羊的miRNA数据库,结合miRanda和mireap软件预测与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs,与前人研究表明在牛不同泌乳时期乳腺组织中具有差异表达的miRNA取交集,然后对其靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析;最后使用皮尔逊相关系数在乳腺组织中进行Linc24063与miRNAs表达量的相关性分析。【结果】Linc24063 5′RACE和3′RACE片段大小分别为476 bp和356 bp,测序分析表明Linc24063大小为758 bp,位于牦牛21号染色体的Dlk1-Dio3印记域,与普通牛的序列保守性最高。生物信息学预测其编码潜能较低,原核表达试验进一步验证Linc24063不能有效的翻译蛋白,表明Linc24063是一个真正的长链非编码lncRNA。组织表达谱分析表明,Linc24063在牦牛乳腺组织中表达量最高,在肝脏和卵巢中表达量较低。生物信息学分析后共筛选到与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs 21个,其中有研究报道在乳腺中有差异表达的13个;13个miRNAs靶基因富集到TGF-β、PI3K-Akt、胰岛素等信号通路中,表明Linc24063可能通过这些信号通路参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。在乳腺组织中,Linc24063表达水平与miR-200a（P=0.001）、miR-141（P=0.02）显著负相关,与miR-27a（P=0.023）显著正相关,与miR-24（P=0.601）不具备相关性。【结论】Linc24063位于Dlk1-Dio3印记域内,在乳腺组织中具有较高表达量,且可能通过与miR-200a、miR-141和miR-27a相互作用从而参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。为深入探讨牦牛Linc24063在乳脂和乳蛋白合成中的生物学功能提供了基础数据。
关键词： 牦牛;Linc24063;RACE;原核表达;乳脂;乳蛋白

Abstract

【Objective】The aim of this study was to clone and to identify the protein coding potential of the long-chain non-coding RNA Linc24063 in yak, and then to analyze its correlation with the expression of miRNAs in mammary gland, which might provide basis for studying the function of Linc24063 in yak. 【Method】Twelve healthy female yaks at 4.5-year old in the first lactation period were selected as experiment animal. After fasting slaughter, the tissue samples of cerebrum, mammary gland, kidney, heart, liver and ovary were collected for total RNA extraction. Firstly, the sequence of Linc24063 was cloned by 5' RACE and 3' RACE, and the sequence conservation, chromosomal location and coding potential were analyzed by bioinformatics, then the prokaryotic expression assays were used to analyze its protein coding ability. Its expression levels in cerebrum, mammary gland, kidney, heart, liver and ovary tissue were determined by using RT-qPCR. Secondly, the conserved miRNAs interacting with Linc24063 were predicted by using the miRNA database of cattle and sheep, combined with miRanda and mireap software. The same miRNAs were obtained from the published differentially expressed miRNAs during different stages of lactation in cattle and the conserved miRNAs, and then GO enrichment and KEGG pathway analysis were performed on their target genes. Finally, Pearson correlation coefficient was used for analyzing the correlation between the expression of Linc24063 and miRNAs in the mammary gland of yak. 【Result】The length of Linc24063 5'RACE and 3'RACE fragments were 476 bp and 356 bp, respectively. Sequencing analysis showed that Linc24063 was 758 bp in length and located in the Dlk1-Dio3 imprinting domain of 21 chromosomes in yak. Bioinformatics predicts results showed that its coding potential was lower, and prokaryotic expression experiments further demonstrated that Linc24063 had no protein coding ability, suggesting that Linc24063 was a real lncRNA. Tissue expression profiling showed that Linc24063 had highest expression in mammary gland and lowest expression in liver and ovary. After bioinformatics analysis, Twenty-one conserved miRNAs interacting with Linc24063 were screened, among which 13 miRNA were differentially expressed in the mammary gland reported previously. The 13 miRNAs targets were enriched in TGF-β, PI3K-Akt, insulin and other signaling pathways, suggesting that Linc24063 might participate in the biosynthesis of milk fat and protein via these signaling pathways. In mammary gland tissue, the expression of Linc24063 was significantly negatively correlated with miR-200a (P=0.001) and miR-141 (P=0.02), and significantly positively correlated with miR-27a (P=0.023), but no correlation with miR-24 (P=0.601). 【Conclusion】The results showed that Linc24063 was located in the Dlk1-Dio3 imprinting domain and expressed higher in mammary gland, and might play an important roles in the biosynthesis of milk fat and protein via miR-200a, miR-141 and miR-27a, which would be beneficial for revealing the regulatory mechanism of Linc24063 in milk fat and protein synthesis.

Keywords：Bos grunniens; Linc24063;RACE;prokaryotic expression;milk fat;milk protein

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王会, 柴志欣, 朱江江, 钟金城, 张成福, 信金伟. 牦牛Linc24063的克隆鉴定及其与miRNAs 表达水平的相关性分析[J]. 中国农业科学, 2019, 52(14): 2538-2547 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.14.012
WANG Hui, CHAI ZhiXin, ZHU JiangJiang, ZHONG JinCheng, ZHANG ChengFu, Xin JinWei. Cloning and Identification of Long-Chain Non-Coding RNA Linc24063 and Its Correlation with the Expression Level of miRNAs in Yak[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(14): 2538-2547 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.14.012

0 引言

【研究意义】在机体内,lncRNA可通过miRNA发挥调控作用。一方面,lncRNA可作为miRNA吸附剂,与miRNA靶基因竞争性结合miRNA;另一方面,lncRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）,与具有相同miRNA结合元件的mRNA竞争miRNA,抑制翻译、调节可变剪切或调节mRNA降解^[1]。牦牛主要分布于海拔3 000 m以上的青藏高原地区,为藏区人民提供肉、奶产品。牦牛奶具有高蛋白、高乳脂率的特点,研究lncRNA在牦牛乳腺组织中的具体功能及调控机制,对更好地利用牦牛遗传资源具有重要意义。【前人研究进展】在牦牛等哺乳动物中,由于早期配子遗传的精子和卵子的表观遗传修饰不同,导致接近1%的蛋白质编码基因表达具有亲本特异性,这种亲本依赖的表观遗传现象被定义为基因组印记^[2,3]。迄今为止,在人类、小鼠、牛和绵羊等哺乳动物中分别鉴定出350个、236个、45个和18个印记基因（http://igc.otago.ac.nz）,这些印记基因通常以簇的形式存在。Dlk1-Dio3印记域位于人染色体14q32、小鼠染色体12q、牛染色体 21q和绵羊染色体18q上,因其在胚胎发育^[4]、癌症的发生^[5]、细胞增殖分化^[6]及机体各代谢调控通路^[7]中发挥重要作用而备受关注,是目前研究较多的印记区域之一。Dlk1- Dio3印记域包括3个父源表达的编码蛋白基因（Dlk1、Dio3和 Rtl1/Peg11）与母系表达的长链非编码RNA（如lncRNA:Meg3、Meg8、Meg9）、miRNA和snoRNA^[8]。研究表明,Dlk1-Dio3印记域在物种间高度保守,广泛参与到机体各生理及病理过程中。Dlk1-Dio3印记区域的激活与小鼠干细胞多能性水平相关^[9];Dlk1参与调控多能干细胞^[10]、肌细胞的增殖与分化^[7];Dlk1启动子区域甲基化可增加非小细胞肺癌细胞的侵袭能力^[11]。LncRNA是长度大于200 bp的一类非编码RNA,在胚胎发育^[12]、细胞增殖分化^[13]、精子发生^[14]等多种生命过程中发挥重要的调控作用。Dlk1-Dio3印记域上有多个具备重要功能的lncRNA,如高脂饮食可增加小鼠Meg3表达量,Meg3通过调控FoxO1的表达增强肝脏胰岛素抵抗,干扰Met3可逆转小鼠由高脂饮食引起的血液甘油三酯含量的上调^[14]。近年来,人们在不同物种Dlk1-Dio3印记域间发现并鉴定到了新lncRNA,如在鼠Meg8与Meg9、Meg9与Dio3之间分别发现并鉴定了2个lncRNA,即lncRNA B830012L 14Rik和AK044800,lncRNA B830012L 14Rik在小鼠大脑、肺脏、心脏和肝脏组织中广泛表达^[15],而lncRNA AK044800主要在胚胎时期的前脑组织中表达^[16];对牛Dlk1-Dio3印记域lncRNA鉴定发现,该区域包含Linc24061、Linc24063、 Linc24064三个lncRNAs,它们在在心脏、肾脏及肌肉组织中均广泛表达^[17,18]。【本研究切入点】前人研究表明,Dlk1-Dio3印记域内的lncRNA,能参与机体多种生物学过程调控。但在牦牛上,未见此印记域内lncRNA的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究旨在牦牛Dlk1- Dio3印记域Meg8与Meg9间鉴定牦牛Linc24063,通过生物信息学对其靶miRNA进行预测,结合组织表达谱分析其表达量在乳腺组织中与靶miRNAs的相关性,从而为牦牛Linc24063通过miRNA发挥功能的调控机制研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年4月,在西藏自治区昌都市类乌齐县,选取处于第一泌乳期、体重接近、健康的12头母牦牛,屠宰后采集卵巢、心脏、肝脏、肾脏、乳腺和大脑组织,DEPC反复冲洗后锡箔纸包装,迅速置于液氮保存,带回实验室备用。

1.2 RNA提取及牦牛Linc24063扩增

各组织RNA提取参照Trizol（Invitrogen）试剂说明书。RNA经纯度和质量检测合格后备用。

利用牛Dlk1-Dio3印记域Meg8与Meg9间的序列进行搜索并与牦牛基因组比对,鉴别出牛Linc24063（NCBI登录号:KU956000.1）序列与牦牛基因组序列高度保守,根据此序列利用Primer premier 5设计牦牛Linc24063基因5′ RACE（cDNA末端快速扩增）和3′ RACE引物。将牦牛各组织RNA等量混合后,利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech, Palo Alto, CA, USA）按照操作说明书进行RACE试验,获取Linc24063的5′端和3′端。5′ RACE引物为:5′-TTAAACATTCCTAACATCTGCC TAC-3′,3′ RACE引物为5′-GGGACCCTGAGGCCCAGTCCATTC-3′。

1.3 牦牛Linc24063序列分析

利用NCBI BLAST对牦牛Linc24063序列在物种间的保守性及染色体上的定位进行分析;利用在线软件Coding Potential Calculator（http://cpc2.cbi.pku.edu.cn/）对Linc24063、已知lncRNA Meg9（登录号:NR_132275.2）和编码基因β-酪蛋白（CSN2,登录号:MH378280.1）的编码能力进行预测;利用miRanda和mireap软件分析与Linc24063相互作用的miRNAs;利用DAVID在线软件（https://david.ncifcrf.gov/）对与Linc24063相互作用的miRNAs的靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析。

1.4 牦牛Linc24063原核表达

将牦牛Linc24063全长亚克隆至Pet-28a载体的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点上,获得Linc24063-28a原核表达质粒,转化至BL21感受态细胞,获得含重组质粒Linc24063-28a表达菌种,提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定。CSN2-28a原核表达质粒为本实验室保存。

Linc24063-28a和CSN2-28a诱导表达步骤参照文献[19]。取1 mL诱导后的菌液沉淀,用100 μL的1×SDS-PAGE Loading Buffer重悬沉淀,沸水中煮沸10 min,保证菌体完全裂解。10 000×g离心5 min后,取上清10 μL用于SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色,脱色液脱色,凝胶成像。

1.5 牦牛Linc24063组织表达分析

利用PrimeScript ^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, 大连）试剂盒将各组织总RNA反转录为cDNA,Linc24063表达量的检测参照SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒（Takara）说明书,内参基因选择核糖体蛋白S9（RPS9,登录号:XM_005899362.2）、广泛表达蛋白（UXT, 登录号:XM_014483477.1）^[20];对于miRNA表达量的检测利用Stem-loop方法^[21],内参基因选择5S rRNA。利用Bio-Rad CFX96（伯乐,美国）定量仪进行牦牛Linc24063及miRNAs组织表达谱分析。扩增体系均为:2×SYBR^? Premix Ex Taq^TM Ⅱ10 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,ddH₂O 7 μL。qPCR条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,39个循环。所用引物列于表1。

Table 1
表1
表1实时荧光定量PCR引物
Table 1Specific primers used for RT-qPCR

基因名称 Gene name	引物序列（5′-3′） Primer sequence (5′-3′)	产物大小 Product length (bp)
Linc24063	F:ACTGTGAACATAGATGGTGAGG	141
	R:CACGGGGTCACAAAGAGTCA
RPS9	F:GTGGTGAACATCCCGTCCTT	130
	R:GCCACTGCACCTTGTAACAC
UXT	F:CGAGGCTTTCATCTCTGACG	138
	R:TCCGAGTGATTAGCTTCCTGG
18S rRNA	F:GTGGTGTTGAGGAAAGCAGACA	79
	R:CGATCCCTGTCCTCACCTCATC
MiR-200a	RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaacatcgt
	F:CTGGtaacactgtctggta	70
MiR-24	RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACctgttcct
	F:GGAtggctcagttcagc	69
MiR-27a	RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcggaactt
	F:GGCacttcacagtggct	69
MiR-141	RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACccatcttt
	F:GGCataacactgtctggt	69
miRNA universal primer	GTGCAGGGTCCGAGGT

F:forward primer; R;Reverse primer; RT: miRNA reverse transcription primer; the lowercase letters in RT primer and F primer are stem-loop and the miRNA sequence, respectively
F:上游引物;R:下游引物;RT:miRNA反转录引物;RT和F引物序列中小写字母分别为茎环结构序列和相应的miRNA序列,以保证扩增的特异性

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1.6 数据分析

基因表达量差异分析均使用2^-△△ct法,对于Linc24063的定量选择UXT和RPS9的几何平均值进行分析。利用SPSS 19.0皮尔逊系数（双尾）反应Linc24063与miRNA的相关性。相关性以|R |≥0.8为极强相关,0.6≤|R |≤0.8为强相关,0.4≤|R |≤0.6为中度相关,|R |≤0.4为不相关。结果表示为平均值+标准误。*,P<0.05为差异显著,**,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 长链非编码RNA Linc24063序列特征

利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 扩增牦牛长链非编码RNA Linc24063,结果表明,5′ RACE片段大小为476 bp,3′ RACE片段大小为356 bp（图1-A）,测序分析表明Linc24063大小758 bp（图1-B）,位于牦牛21号染色体的Dlk1-Dio3印记域。NCBI blast分析物种间保守性,结果表明牦牛Linc24063与牛、绵羊、山羊的序列相似性分别为98%、90%和90%,而与人和小鼠的序列相似性较低。

图1

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图1Linc24063 5′ Race和3′ Race电泳图（A）及序列（B）

Fig. 1The 5′ Race and 3′ Race electrophoresis analysis (A) and the sequence (B) of Linc24063

2.2 长链非编码RNA Linc24063的鉴定

利用在线软件Coding Potential Calculator对长链非编码RNA Linc24063、已知lncRNA Meg9和编码基因CSN2的编码能力预测分析,结果表明:Linc24063与长链非编码RNA Meg9类似,编码潜能均较低,明显区别于编码基因CSN2,属于非编码RNA（表2）。

Table 2
表2
表2Linc24063、Meg9和CSN2基因编码潜能分析
Table 2The coding probability analysis of Linc24063, Meg9 and CSN2

基因 Gene	编码/非编码 Coding/Noncoding	编码潜能 Coding probability	Fickett 分 Fickett score	等电点 Isoelectric point
Linc24063	Noncoding	0.01	0.35	9.52
Meg9	Noncoding	0.17	0.36	7.90
CSN2	coding	1.00	0.45	5.89

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为验证Linc24063是否具备编码能力,本研究将Linc24063连接pET-28a原核表达载体,提取质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,由图2-A可知,Linc24063-28a和CSN2-28a分别检测到一条758 bp和780 bp大小的片段,进一步通过测序验证目的片段成功插入原核表达载体。利用原核表达系统在体外对Linc24063和编码基因CSN2进行翻译,结果表明:Linc24063在30 kD附近没有检测到蛋白表达,表明其不能有效的翻译蛋白,而在相同试验条件下,编码基因CSN2在30 kD附近有蛋白表达,表明CSN2能很好的表达蛋白（图2-B）。以上研究结果表明,牦牛Linc24063是一个真正的长链非编码lncRNA。

图2

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图2Linc24063的原核表达

（A）Linc24063与CSN2原核表达载体酶切鉴定;（B）Linc24063与CSN2原核表达
Fig. 2The prokaryotic expression of Linc24063

(A) Identification of prokaryotic expression vector of Linc24063 and CSN2 by restriction endonuclease. (B) The prokaryotic expression of Linc24063 and CSN2

2.3 长链非编码RNA Linc24063组织表达谱

利用RT-qPCR技术,笔者研究了Linc24063在牦牛不同组织的表达谱。结果显示,Linc24063在乳腺表达量最高,显著高于其他组织（P<0.05）,其次大脑和肾脏,在肝脏和卵巢中表达量较低（图3）。

图3

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图3Linc24063在各组织中的表达量

小写字母a,b表示差异显著,P<0.05
Fig. 3The expression of Linc24063 in tissues

The lowercase a, b means significant difference, P<0.05

2.4 长链非编码RNA Linc24063生物信息学分析

下载miRbase 22数据库中普通牛（牦牛的近源物种）和绵羊所有的miRNAs,利用miRanda和mireap软件分析与Linc24063具有相互作用的miRNA,共发现21个物种间保守miRNAs（表3）。

Table 3
表3
表3与Linc24063相互作用的保守miRNAs
Table 3The conserved miRNAs interacting with Linc24063

Name	成熟体序列（5′-3′）Mature sequence(5′-3′)
bta-miR-137	UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG
bta-miR-139	UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU
bta-miR-141	UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG
bta-miR-154a	UAGGUUAUCCGUGUAGCCUUCG
bta-miR-200a	UAACACUGUCUGGUAACGAUGUU
bta-miR-221	AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUU
bta-miR-223	UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
bta-miR-24	UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG
bta-miR-27a	AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA
bta-miR-30b-5p	UGUAAACAUCCUACACUCAGCU
bta-miR-369-3p	AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU
bta-miR-374a	UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG
bta-miR-376b	AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU
bta-miR-378b	ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC
bta-miR-378c	ACUGGACUUGGAGUCAGAAGU
bta-miR-455-3p	GCAGUCCAUGGGCAUAUACACU
bta-miR-487a	AAUCAUACAGGGACAUCCAGU
bta-miR-500	UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA
bta-miR-543	AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU
bta-miR-551a	GCGACCCAAUCUUGGUUUCCA
bta-miR-655	AUAAUACAUGGUUAACCUCUCU

The bold font miRNAs were expressed in mammary gland as previously reported
加粗的miRNAs为前人报道乳腺中表达的miRNAs

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由2.3研究表明,Linc24063在乳腺的表达量最高,我们推测其在乳腺发育或乳合成过程中具有重要作用,由此结合前人在乳腺中miRNAs表达谱的研究^[22,23],发现13个miRNAs可能在乳腺组织中与Linc24063具有相互作用。对这13个miRNAs的靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析,结果表明,这些miRNAs显著富集到RNA聚合酶II相关基因的转录等生物学过程中（表4）。KEGG信号通路分析表明,这些miRNAs显著参与到TGF-beta信号通路、PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路、MAPK信号通路等（表5）。

Table 4
表4
表4与Linc24063相互作用的miRNAs靶基因的前10条GO富集条目
Table 4The top ten GO terms of the conserved miRNAs interacting with Linc24063

GO条目 Go Term	基因数目 Gene count	富集倍数 Fold enrichment	P值 P value
Nucleus细胞核	201	1.63	7.98E-14
Cytoplasm细胞质	171	1.28	2.06E-04
Regulation of transcription from RNA polymerase II promoter RNA聚合酶II启动子转录的调控	116	1.98	4.76E-06
Nucleoplasm 核质	83	1.48	2.68E-04
Metal ion binding金属离子结合	71	1.42	0.00231
Cytosol胞液	60	1.37	0.011998
RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding DNA特异性结合RNA聚合酶II核心启动子近区序列	52	2.92	3.51E-08
Transcription, DNA-templated DNA为模板的转录	42	1.57	0.004197
Transcriptional activator activity, RNA polymerase II core promoter proximal region RNA聚合酶II核心启动子近区转录激活活性	33	3.05	2.15E-06
Sequence-specific binding序列特异性结合
Chromatin binding染色质结合	30	2.22	8.71E-05

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Table 5
表5
表5与Linc24063相互作用的miRNAs靶基因的信号通路
Table 5The KEGG pathway of the conserved miRNAs interacting with Linc24063

信号通路条目 Pathway term	基因数 Input number	P值 P-value	校正后P值 Corrected P-value
TGF-beta signaling pathway TGF-β信号通路	16	1.46E-06	8.22E-05
PI3K-Akt signaling pathway PI3K-Akt信号通路	28	0.000267	0.0063
Axon guidance 轴突导向	18	0.000392	0.00865
ErbB signaling pathway ErbB 信号通路	10	0.002087	0.03393
Chronic myeloid leukemia慢性粒细胞白血病	9	0.002965	0.04313
FoxO signaling pathway FoXO信号通路	13	0.003366	0.04738
Pathways in cancer 癌症通路	27	0.003372	0.04783
Insulin signaling pathway胰岛素信号	13	0.003495	0.04786
Maturity onset diabetes of the young糖尿病	5	0.003572	0.04789
MAPK signaling pathway MAPK信号通路	19	0.003611	0.04952

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2.5 长链非编码RNA Linc24063与miRNAs表达相关性分析

为探究Linc24063与miRNAs的功能相关性,本研究利用RT-qPCR在乳腺组织中检测Linc24063与miR-200a 、miR-24、miR-141及miR-27a的表达量,并进行了皮尔逊相关性分析（图4）,结果表明:Linc24063在12头牦牛乳腺组织中的表达量与miR-200a（R=-0.834,P=0.001）和miR-141（R=-0.657,P=0.02）的表达量均显著负相关,与miR-27a的表达量显著正相关（R=0.647,P=0.023）,而与miR-24无显著相关性（P>0.05）。以上研究结果表明,Linc24063在牦牛乳腺组织中可能通过调控miR-200a、miR-141和miR-27a基因的表达,从而参与到乳腺发育或乳成分合成及代谢的生理过程中。

图4

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图412头牦牛乳腺组织Linc24063与miRNAs表达量相关性分析

Fig. 4The correlation between expression levels of Linc24063 and miRNAs in 12 mammary gland of yaks

3 讨论

目前,关于lncRNA的研究不仅局限于模式动物及人上,在猪、牛、羊上也开展了大量研究,但是关于牦牛lncRNA的研究较少。本研究首次通过RACE技术获取并鉴定了牦牛Linc24063,位于牦牛21号染色体的Dlk1-Dio3印记域,在反刍动物牛、羊中具有较高的保守性（>90%）,与前人对Dlk1-Dio3印记域的研究表明该印记域在物种间具有较强的保守性的结果一致^[24]。组织表达谱分析结果表明,Linc24063在所检测的6个组织中均有表达,且在乳腺中表达量最高,其次是大脑和肾脏,表明Linc24063在这些组织中可能均具备生物学功能。

生物信息学分析结果表明:共筛选到21个与Linc24063相互作用的物种间保守miRNAs 。结合前人研究对miRNAs在乳腺组织中的表达谱研究^[22,23],笔者筛选了13个miRNAs可能在乳腺组织中与Linc24063具有相互作用。对这13个miRNAs的靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析表明:与Linc24063相互作用的miRNAs的靶基因富集到TGF-beta信号通路、PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路及与神经发育、保护的轴突引导（Axon guidance）信号通路中。TGF-beta信号通路^[25]、PI3K-Akt信号通路^[26,27]、胰岛素信号通路是与乳腺发育、乳脂乳蛋白合成密切相关的信号通路,结合Linc24063在乳腺组织中表达量最高的特点,推测Linc24063可能在乳腺发育及乳脂乳蛋白合成等生物学过程中发挥重要作用。

为探索Linc24063可能的作用机制,本研究随机挑选了4个可能与其具有相互作用的miRNAs,在乳腺组织中对其表达量进行了相关性分析。结果表明,Linc24063与miR-200a、miR-141、miR-27a均显著相关。前人研究表明miR-200a在乳腺上皮细胞中通过调控β-酪蛋白和E-钙粘蛋白以维持上皮细胞的极性^[28],同时在乳脂、乳蛋白合成信号通路中发挥重要功能^[29];miR-141和 miR-27a可分别通过调控STAT5蛋白、PPARγ蛋白的表达,参与到乳蛋白、乳脂的合成中^[30]。由此可以推测,Linc24063可能通过调控miR-200a、miR-141、miR-27a参与到牦牛乳蛋白及乳脂的生物合成中,但是其具体功能和作用机制还需进行研究。

4 结论

牦牛Dlk1-Dio3印记域存在一个在反刍动物中保守的长链非编码RNA Linc24063,全长758 bp。在乳腺及大脑组织中具有较高表达水平,生物信息学分析表明Linc24063可能参与到PI3K-Akt、胰岛素等与乳脂乳蛋白密切相关的信号通路中。在乳腺组织中Linc24063与乳脂乳蛋白合成相关的miRNAs,如miR-200a、miR-27a和miR-141具有显著的相关性。以上研究结果为Linc24063的功能研究提供了基础数据。

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