王小纯^,1,2, 王露露¹, 张志勇¹, 秦步坛¹, 于美琴², 韦一昊¹, 马新明^,1,*1河南粮食作物协同创新中心 / 河南农业大学, 河南郑州 450002
²河南农业大学生命科学学院, 河南郑州450002

Transcription characteristics of wheat glutamine synthetase isoforms and the sequence analysis of their promoters

WANG Xiao-Chun^,1,2, WANG Lu-Lu¹, ZHANG Zhi-Yong¹, QIN Bu-Tan¹, YU Mei-Qin², WEI Yi-Hao¹, MA Xin-Ming^,1,*1Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China
²College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

通讯作者: *马新明, E-mail: xinmingma@126.com

收稿日期:2020-06-3接受日期:2020-10-17网络出版日期:2021-04-12

基金资助:

国家重点研发计划项目.2016YFD0300205 河南省现代农业产业技术体系项目.S2010-01-G04

Received:2020-06-3Accepted:2020-10-17Online:2021-04-12

Fund supported:

National Key Research and Development Program of China.2016YFD0300205 Modern Agricultural Technology System in Henan Province.S2010-01-G04

作者简介 About authors
E-mail: xiaochun.w@163.com









摘要
谷氨酰胺合成酶是小麦氮同化关键酶, 分为胞液型和质体型(TaGS2)两类, 其中胞液型TaGS又分为TaGS1、TaGSr和TaGSe。为了研究异源六倍体小麦A、B、D染色体组TaGS同工酶表达差异及调控机制, 本项目利用三代测序技术测定了TaGS同工酶基因转录水平, 依据中国春基因组序列克隆了豫麦49的12个TaGS同工酶启动子, 并对其序列进行了分析。结果表明, TaGS1主要由6B染色体基因转录, TaGSe和TaGSr主要由4D染色体基因转录, TaGS2主要由2D染色体基因转录, 不同TaGS同工酶转录起始位点距起始密码子ATG的距离不同。启动子元件分析显示, 6B染色体上的TaGS1启动子有较多W-box、AC-I、ABRE、as-1和茉莉酸甲酯等响应元件, 4D染色体上的TaGSe启动子有较多胁迫响应转录因子(MYB、MBS、LTR等)结合元件和植物生长素响应元件, 4D染色体上的TaGSr启动子有较多WRE3等转录因子结合元件, 2D染色体上的TaGS2启动子有较多A-box、WRE3、ARE及AT富集区。不同TaGS同工酶启动子顺式元件种类、数目及排列顺序均不同, 为进一步研究GS同工酶调控机制奠定了基础。
关键词： 小麦;GS同工酶;转录;启动子;顺式作用元件

Abstract
As a key enzyme for nitrogen assimilation in wheat, glutamine synthetase is grouped into two classes: cytosolic GS and chloroplastic GS (TaGS2), and cytosolic GS includes TaGS1, TaGSr, and TaGSe. In order to study the expression characteristics and regulatory mechanisms of GS isozymes in chromosome A, B, and D of heterohexaploid wheat, transcripts of TaGS isoforms were analyzed based on the third-generation sequencing technology transcriptome analysis, and 12 promoters of TaGS isozymes of Yumai 49 were cloned based on Chinese Spring genome, and the sequence of the promoters were analyzed. The results showed that TaGS1 was mainly transcribed on chromosome 6B, TaGSe and TaGSr on chromosome 4D, and TaGS2 on chromosome 2D. Furthermore, the distance from initiation codon ATG to initiation site of transcript for each promoter of TaGS was distinct. Promoter element analysis showed that the promoter of TaGS1 in 6B had more W-box, AC-I, ABRE, as-1, and methyl jasmonic response elements, the promoter of TaGSe in 4D had more stress response elements (MYB, MBS, LTR, etc.) and auxin response element, the promoter of TaGSr in 4D had more WRE3 and transcript factor response elements, the promoter of TaGS2 in 2D had more A-box, WRE3, ARE, and an AT enrichment region. In summary, the number, type and order of cis-elements of different promoters of TaGS isozymes were distinct, which provided the foundation for further study on the regulation mechanism of TaGS isozymes.
Keywords：wheat;GS isoforms;transcription;promoter;cis-element


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本文引用格式
王小纯, 王露露, 张志勇, 秦步坛, 于美琴, 韦一昊, 马新明. 小麦谷氨酰胺合成酶同工酶转录特点及其启动子序列分析[J]. 作物学报, 2021, 47(4): 761-769. doi:10.3724/SP.J.1006.2021.01046
WANG Xiao-Chun, WANG Lu-Lu, ZHANG Zhi-Yong, QIN Bu-Tan, YU Mei-Qin, WEI Yi-Hao, MA Xin-Ming. Transcription characteristics of wheat glutamine synthetase isoforms and the sequence analysis of their promoters[J]. Acta Agronomica Sinica, 2021, 47(4): 761-769. doi:10.3724/SP.J.1006.2021.01046


氮是植物生长发育的必需元素, 在作物产量与品质形成过程中起重要作用。谷氨酰胺合成酶(GS)是植物氮素同化和运转的关键酶^[1], 根据亚细胞定位可分为胞液型(GS1)和质体型(GS2)两类^[2], 小麦GS1包含GS1.1 (GS1)、GS1.2 (GSr)和GS1.3 (GSe)。GS2参与硝酸还原氨与光呼吸释放氨同化, GS1参与叶片衰老过程中氮素的再利用^[3], GSr参与根部系氮素同化运转, GSe参与籽粒发育过程中氮素利用^[4]。GS活性与小麦籽粒可溶性蛋白含量及产量密切相关^[5,6,7,8,9]。水稻过表达GS1基因, 其GS活性及可溶性蛋白含量显著提高^[10], 过表达GS2可以增强水稻的光呼吸和光合作用强度, 水稻过表达GS2和烟草过表达GS2均提高抗盐能力^[11,12]。过表达GSr可提高水稻对盐、干旱及冷胁迫的敏感性^[13]。QTL定位证明GS与小麦产量呈正相关^[6]。可见, GS与植物生长发育和抗逆密切相关。

小麦是异源六倍体, 有A、B、D三个染色体组, 每组染色体都有一套TaGS同工酶基因, 比如GS1有3个基因编码, 即GS1A、GS1B和GS1D。以前报道小麦GSr和GSe只有2个基因^[14], 可能存在未发现的GSr和GSe同工酶基因。启动子位于基因的5'端非编码区, 其结构和功能影响基因的转录调控。Michael等^[15]发现拟南芥GLN1:2启动子在高氮条件下活性更高。拟南芥不同GS启动子存在组织特异性, 与GS同工酶在植物中表达部位相吻合^[16,17]。Gómez-Maldonado等^[18]研究发现, 松树GS启动子可与MYB转录因子结合提高GS同工酶的表达量从而调控体内氮代谢。小麦染色体组复杂, 不同染色体组基因表达存在差异。董佳敏等^[19]发现A、B、D染色体上的expansin (膨胀素)基因均有表达, 胁迫处理后B染色体上的expansin表达量最高, D染色体表达量最低, 可见不同染色体上的启动子调控方式不同。

有关植物GS功能及分布等研究报道较多, 但对GS启动子研究相对较少, 小麦GS启动子研究至今尚未见报道。本研究依据中国春基因组序列, 在A、B、D染色体上克隆12个GS同工酶启动子, 利用Plant-CARE在线软件对其进行序列分析及功能预测, 利用三代测序技术测定了小麦不同染色体组上GS同工酶的转录水平, 为深入研究小麦A、B、D染色体组上不同GS同工酶表达调控机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为具有丰产稳产特点、氮素利用效率高的河南省当家品种之一, 豫麦49 (YM49)。将成熟饱满大小均匀一致的小麦种子放入清水中浸泡, 露白后分别移入Hoagland营养液中进行培养至三叶一心, 分别取其根系和叶片, 液氮处理后于-80℃冰箱保存。许昌实验农场大田种植的豫麦49, 于2018年10月16日机械播种, 播种前一次施入氮素量为225 kg hm^-2, 其他管理同大田。于小麦开花16 d后分别选取有代表性的旗叶、穗下节及籽粒, 每个处理重复3次, 液氮处理后于-80℃冰箱保存。

1.2 三代测序

将上述所取的叶、穗下节、籽粒、根系样品分别于液氮中研磨成粉状, 送百迈客生物科技公司, 由公司分别提取各部位RNA并等量混合后测序。

1.3 TaGS同工酶基因查找

依据本实验室前期克隆的小麦GS同工酶的cDNA序列[GenBank号分别为: TaGS1:1 (DQ124209), TaGS1:2 (AY491968), TaGS1:3 (AY491970)和TaGS2 (DQ124212)], 在中国春小麦基因组文库(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)中查找小麦GS基因。利用ClustalX软件进行序列对比, 确定编码GS同工酶的基因, 预测上游的启动子位置。

1.4 引物设计

以1.3查找的中国春TaGS同工酶启动子序列为模板, 利用Premier 5.0设计扩增目的片段的引物。上游引物(S)在ATG上游2000 bp左右, 下游引物(A)在ATG下游500 bp左右(表1)。扩增目的序列包含启动子及ORF的5′端,由华大基因合成引物。

1.5 豫麦49基因组提取及启动子克隆

利用CTAB法^[20]提取YM49基因组DNA。以YM49基因组DNA为模板进行PCR: 95℃预变性180 s; 95℃变性15 s, 退火15 s (退火温度详见表1), 72℃延伸160 s, 循环35次; 72℃稳定5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后, 切取与目的片段大小一致的条带, 利用胶回收试剂盒(诺唯赞, DC301)回收目的条带, 然后与pTOPO载体(艾德莱, DR01)连接, 转化DH5α大肠杆菌, 利用卡那抗性平板筛选阳性克隆, 进行PCR验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 启动子序列分析

测序后利用ClustalX软件与中国春小麦GS基因进行序列对比, 并利用在线软件Plant-CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子序列进行顺式作用元件分析。

1.7 转录起始位点预测

将三代测序的TaGS同工酶mRNA序列5′端A/G定为转录起始位点; 若5′端没有A/G, 沿克隆的启动子序列上游寻找最近的A/G定为转录起始位点。根据克隆的启动子序列, 距转录起始位点最近的TATA-box为RNA聚合酶II识别位点^[21]。

2 结果与分析

2.1 TaGS同工酶在小麦染色体中表达特点

TaGS同工酶种类多, 且同源性高, 利用qPCR不能准确反应各染色体上TaGS的表达情况。三代测序可以获得YM49的TaGS同工酶全长转录本, 便于准确区分各个TaGS基因。为了得到小麦所有TaGS同工酶表达信息, 选择花后16 d根系、节间、叶片、籽粒及苗期根系与叶片组织RNA等量混合测序。三代测序数据分析显示, 不同染色体组的TaGS同工酶表达量存在差异。其中TaGSr基因表达量最高, TaGSe基因表达量最低。TaGS1位于6号染色体长臂(L), 在A、B、D染色体上的表达量依次为6B> 6A>6D; TaGSe和TaGSr位于4号B、D染色体长臂(L)或A染色体短臂(S)。TaGSe在不同染色体上的表达量依次为4D>4A>4B; TaGSr在A、B、D染色体上的表达量依次则为4D>4B>4A; TaGS2位于2号染色体长臂(L), 在A、B、D染色体上的表达量依次为2D>2B>2A (图1)。

图1

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图1不同染色体上TaGS同工酶基因表达特点

Fig. 1Expression of TaGS isozymes on different chromosomes

2.2 TaGS同工酶启动子克隆

TaGS同工酶基因转录受其启动子元件调控, 为了探索其基因表达调控机制, 对A、B、D染色体上的TaGS同工酶启动子进行了克隆。首先以YM49基因组为模板, 利用特异性引物(表1)进行PCR扩增, 分别扩增到A、B、D染色体上的TaGS1、TaGSr、TaGSe及TaGS2基因的启动子片段(图2)。将与表1一致的目的片段回收, 与pTOPO载体连接转化DH5α, 提取质粒, 并进行PCR鉴定后(图3), 相应菌株进行测序, 结果表明YM49与中国春的GS启动子序列同源性为100%。

Table 1
表1
表1TaGS同工酶启动子扩增引物
Table 1Primers of TaGS isoenzymes for promoter amplification

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	退火温度 Annealing temperature (℃)	PCR长度 PCR fragment (bp)	5′端非编码区 5′NCS (bp)
GS1-6AL S	CACTGCCTTCTCAGGCTTGTTA	58	2000	1594
GS1-6AL A	GCCCCATGAATTTAGCATCG
GS1-6BL S	TCTTAGTCCAACGTGGCATCATAGG	62	2033	1548
GS1-6BL A	AGACGCCAAACTACGACTACG
GS1-6DL S	CACATTCACACGTGGTTTCCTCT	58	2261	1470
GS1-6DL A	GCAAAAACCTCTTCTCGTCGC
GSe-4AL S	TCACCCATAATCATGCTGTGCAAAT	63	2538	1557
GSe-4AL A	TACCATATGTACTCGGCGATGATCTTG
GSe-4BL A	ATGGGAGGTTGGGACAGTGC	58	2508	1565
GSe-4BL S	GATGCGAAGCATACGCGC
GSe-4DS S	TCTGAAGATGCTCATGAGTTGCTCAAT	62	2536	1557
GSe-4DS A	TACCATATGTACTCGGCGATGATCTTG
GSr-4AS S	GTAATGTGGCTACGGTGTGAGTCTGTT	61	2155	1548
GSr-4AS A	GGGTGCAGAATGCAAGTAGC
GSr-4BL S	TCATCTCCGTGAGGAGGTCTTGA	62	2308	1615
GSr-4BL A	TACTCGACGATGATCTTGTCGGTG
GSr-4DL S	GCCCGTTGTACCACTGTTATCGAT	62	1624	1467
GSr-4DL A	TACTCGACGATGATCTTGTCGGTG
GS2-2AL S	GCATTCCTGGCTTGCATGTCTAGA	58	2008	1499
GS2-2AL A	ATGATCTTGTCGGTGAAGGGC
GS2-2BL S	ATTTCGCCGAGTTCAGGTCGAG	63	2153	1419
GS2-2BL A	ATGATCTTGTCGGTGAAGGGC
GS2-2DL S	CAGCGATCCTAGCCTTCGAAAAG	60	1878	1097
GS2-2DL A	ATGATCTTGTCGGTGAAGGGC

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图2

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图2不同染色体TaGS同工酶启动子PCR扩增产物鉴定

箭头所指为目的片段。M: DNA分子量标记。
Fig. 2Identify PCR amplification of TaGS isoenzyme promoters on different chromosomes

The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

图3

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图3TaGS同工酶启动子质粒PCR鉴定箭头所指为目的片段。M: DNA分子量标记。The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

Fig. 3Identify recombinant plasmids of TaGS isoenzyme promoters by PCR

2.3 TaGS同工酶启动子序列分析

利用Plant-CARE在线软件对克隆测序的12个TaGS同工酶启动子进行分析, 发现存在功能不同的多种顺式元件(图4)。包括基本起始元件CAAT-box和TATA-box; 脱落酸、水杨酸、生长素、赤霉素及茉莉酸等激素响应元件; 光响应元件; 厌氧、防御及低温等胁迫响应元件; 分生组织表达调控元件及栅栏叶肉细胞分化元件等组织特异性元件; 细胞周期及昼夜节律调节元件; MYB、MYC等转录因子结合位点, 以及as-1、W-box、dOCT及WRE3等未知功能响应元件。

图4

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图4不同TaGS同工酶启动子顺式元件种类及分布

不同颜色代表不同类型的响应元件, 颜色和形状代表一个具体的响应元件。红色: 激素响应元件; 绿色: 功能未知的响应元件; 蓝色: 基础元件; 黑色: 转录因子结合位点; 紫色: 胁迫响应元件; 粉色: 组织特异性响应元件; 黄色: 光响应元件。
Fig. 4Types and distribution of cis-elements in different TaGS isozyme promoters

Different colors represent different types of response elements; color and shape represent a specific response element. Red: hormone response element; Green: unknown function response element; Blue: basic element; Black: transcription factor binding site; Purple: stress response element; Pink: tissue specific response element; Yellow: light response element.


不同TaGS同工酶启动子结构不同, 同一TaGS同工酶在不同染色体上有其特殊的响应元件。6A染色体上的TaGS1启动子存在生长素响应元件和昼夜调控元件, 6B染色体上TaGS1启动子存在防御和胁迫响应元件, 6D染色体上TaGS1启动子存在MYBHv1结合位点。TaGSe在4A染色体上存在干旱响应元件及MYB结合位点, 在4B染色体上存在MYBHv1结合位点、分生组织表达调控元件, 在4D染色体上存在赤霉素响应元件、生长素响应元件、低温响应元件、MYBHv1结合位点、分生组织表达调控元件。TaGSr在4A染色体上存在A-box、MYC, 在4B染色体上存在赤霉素响应元件、水杨酸响应元件、缺氧特异性诱导元件、细胞周期调控元件, 在4D染色体上存在MYBHv1结合位点。TaGS2在2A染色体上存在赤霉素响应元件、厌氧诱导调控元件, 在2B染色体上存在茉莉酸甲酯响应元件, 在2D染色体上存在赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、厌氧诱导调控元件。

基于TaGS同工酶启动子克隆与序列分析, 结合三代测序结果, 对不同TaGS同工酶基因的转录起始位点进行了预测(图5)。结果表明: 胞液型TaGS(包括TaGS1、TaGSe和TaGSr)在A、B、D染色体上的转录起始位点位于ATG上游约-88~ -249 bp, 且不同染色体组之间存在差异。TaGS1位于6号染色体, 在A、B、D染色体上转录起始位点分别位于ATG上游-202 bp、-249 bp、-171 bp; TaGSe和TaGSr位于4号染色体, TaGSe在A、B、D染色体上转录起始位点分别位于ATG上游-110 bp、-139 bp、-191 bp; TaGSr在A、B、D染色体上转录起始位点分别位于ATG上游-88 bp、-89 bp、-107 bp。质体型TaGS2在A、B、D染色体上的转录起始位点距ATG最远, 差异也最大, 约-111~ -631 bp。TaGS2位于2号染色体, 在A、B、D染色体上转录起始位点分别位于ATG上游-111 bp、-631 bp、-448 bp。

图5

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图5不同TaGS同工酶转录起始位点预测

TATA-box为RNA聚合酶II识别位点。
Fig. 5Prediction of transcription initiation site of different TaGS isozyme

TATA box is the RNA polymerase II recognition site.


小麦不同TaGS同工酶启动子存在特异的响应元件, 不同的环境条件下、不同的生长发育时期、不同的组织器官影响不同染色体上的TaGS同工酶转录水平不同, 而转录本5′端非编码区与翻译起始效率密切相关, 进一步影响TaGS同工酶表达量及生物活性, 从而影响小麦的氮素利用、产量和品质。

3 讨论

启动子是基因表达的开关, 可分为组成型、组织特异型和诱导型3种类型^[22], 启动子上的顺式作用元件与基因表达水平密切相关。前人研究表明, 顺式作用元件的种类、数量、顺序及距离可能会影响转录的起始及转录水平^[23,24]。启动子上游存在的增强子或抑制子可能增强或降低基因的表达水平。栽培小麦不同染色体上的TaGS同工酶启动子元件不同, 可能响应不同环境条件, 以确保TaGS表达水平, 使小麦具有丰产稳产的特性。本实验室前期TaGS同工酶活性测定及Western 杂交表明花后16 d小麦旗叶及子粒GS同工酶条带最多, 表达量也最大^[13]。为了获得小麦GS同工酶转录本及转录量全面信息, 本研究以豫麦49花后16 d各组织器官及苗期叶片和根系为材料, 采用三代测序技术研究了TaGS同工酶在不同染色体上的表达特点, 发现豫麦49不同染色体的GS1、GSr、GSe和GS2表达量不同, 但GSr、GSe和GS2都是D染色体基因表达量最大, D组染色体使栽培小麦从二粒小麦进化到现在的多粒小麦, 根系、叶片及籽粒主要GS同工酶的大量表达是氮素同化的基础, 也是产量形成的基础。

研究启动子的方法主要是生物信息学预测分析及实验验证, 本文利用生物信息学对TaGS的12个启动子序列进行分析, 发现每个启动子中存在多个TATA-box, 结合三代测序数据分析表明在A/G上游可能只有1个TATA-box是RNA聚合酶II识别位点, 不同TaGS启动子的起始转录位点与TATA-box距离差别又十分大, 可能意味着起始转录的机理不尽相同; 每个启动子都有许多光响应元件, 但是只有TaGS2酶表达量及活性受光照强度影响^[13], 当利用启动子与GUS构建重组载体转化拟南芥时, 发现只有GS2-2AL启动子受光诱导(结果尚未发表)。Plant-CARE在线分析还发现每个GS启动子除了基本调控元件CAAT-box外, 还存在多种非生物胁迫应答元件, 如缺氧/厌氧调控元件、干旱响应原件、低温响应原件等以及转录因子如MYB、MYC等结合位点, 启动子上的顺式元件特点与基因功能密切相关^[25]。乙烯、茉莉酸和赤霉素处理使大豆GmWRI1a基因启动子活性增强^[26], 干旱可诱导小麦TaGAPCp1启动子活性^[27], 小麦TaSAP1基因启动子响应干旱、低温及ABA ^[28], 松树的GS启动子可与MYB转录因子结合从而提高GS同工酶的表达量^[18]等。TaGS同工酶启动子元件数量及种类不同, 对外界环境应答不同, 可能是TaGS同工酶差异表达及在A、B、D染色体上差异表达的原因。但是这些启动子元件是否真正存在, 哪个部位的响应元件起作用, 以及如何响应外界环境的变化等还需要进一步验证。

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