薛晓梦¹, 李建国¹, 白冬梅², 晏立英¹, 万丽云¹, 康彦平¹, 淮东欣^,1,*, 雷永¹, 廖伯寿^,1,*1中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室, 湖北武汉 430062
²山西省农业科学院经济作物研究所, 山西汾阳 032200

Expression profiles of FAD2 genes and their responses to cold stress in peanut

XUE Xiao-Meng¹, LI Jian-Guo¹, BAI Dong-Mei², YAN Li-Ying¹, WAN Li-Yun¹, KANG Yan-Ping¹, HUAI Dong-Xin^,1,*, LEI Yong¹, LIAO Bo-Shou^{,1,* 1}Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China
²Industrial Crops Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Fenyang 032200, Shanxi, China

通讯作者: * 淮东欣, E-mail: dxhuai@caas.cn; 廖伯寿, E-mail: lboshou@hotmail.com

第一联系人: E-mail: xiaomengxue1991@163.com
收稿日期:2018-12-27接受日期:2019-05-12网络出版日期:2019-06-13

基金资助:

本研究由湖北省自然科学基金项目.2017CFB161 国家自然科学基金项目.31671734 国家自然科学基金项目.31871662 国家重点研发计划项目资助.2018YFD1000901

Received:2018-12-27Accepted:2019-05-12Online:2019-06-13

Fund supported:

This study was supported by the Hubei Provincial Natural Science Foundation of China.2017CFB161 the National Natural Science Foundation of China.31671734 the National Natural Science Foundation of China.31871662 the National Key R&D Program of China..2018YFD1000901

摘要
为了探究FAD2在花生低温响应中的作用, 本研究从普通油酸花生中花16 (ZH16)和高油酸花生中花413 (ZH413)中克隆得到花生AhFAD2家族的全部基因, 共7个。通过分析这些基因的表达模式发现, 在ZH16和ZH413中各FAD2基因表达模式相似, AhFAD2-1A/B主要在花和发育的种子中表达, AhFAD2-3A/B主要在营养组织中表达, AhFAD2-4A/B主要在根和花中表达, 表明AhFAD2基因在花生不同发育阶段和不同组织中发挥各自的生物学功能。在15℃下发芽6 d发现, ZH413的发芽率未显著下降, 而ZH16的发芽率显著下降。种子萌发过程中, AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B均受低温诱导表达。在ZH16中AhFAD2-1A/B在低温诱导第6天开始显著上调表达, 而在ZH413中第1天显著上调表达; 在ZH16中AhFAD2-4A/B在低温诱导第3天出现显著上调表达, 之后表达量下降, 但在ZH413中第1天就显著上调表达, 且始终维持在高水平表达。基于以上研究结果推测, 高油酸花生在受到低温胁迫时, AhFAD2-1A/B编码蛋白失活, 但AhFAD2-4A/B的高量表达在一定程度上弥补了这部分功能。同时也说明AhFAD2-1A/B功能的缺失并不是决定花生耐寒性的主要因素。本研究的开展为培育抗寒的高油酸花生品种奠定了理论基础, 为高油酸花生在高纬度、高海拔地区推广提供了理论支持。
关键词： 脂肪酸脱氢酶(FAD2);基因克隆;低温胁迫;基因表达

Abstract
To explore the roles of FAD2s in response to cold stress in peanut, we cloned seven AhFAD2 genes from normal oleate peanut ZH16 and high oleate peanut ZH413, respectively. The results of qRT-PCR showed that the expression patterns of FAD2 genes were similar in ZH16 and ZH413. AhFAD2-1A/B was highly expressed in flower and developing seed, AhFAD2-3A/B was mainly expressed in leaf and stem, and AhFAD2-4A/B was expressed specifically in root and flower, indicating that AhFAD2 genes played their respective roles in different developmental stages and tissues of peanut. At 6 days after inducing under 15℃, the germination rate of ZH16 was significantly decreased while that of ZH413 was not significantly affected. The expression of both AhFAD2-1A/B and AhFAD2-4A/B were induced by cold stress. The expression of AhFAD2-1A/B was significantly up-regulated at 6 DAI in ZH16, while at 1 DAI in ZH413, suggesting that AhFAD2-1A/B was induced by cold more quickly in high oleate peanut. Furthermore, the expression of AhFAD2-4A/B was significantly up-regulated at 3 DAI in ZH16 and then decreased, while it was increased immediately and maintained at high level for six days in ZH413. Based on these results, we speculate that up-regulation of AhFAD2-4A/B may compensate the function of AhFAD2-1A/B that is deactivated under cold stress in high oleate peanut, and the deactivation of AhFAD2-1A/B is not the most important factors affecting peanut cold tolerance. This study provides a theoretical basis in breeding of high oleate peanut with high tolerance to cold stress, and the theoretical support for extension of high oleate peanut in both high latitude and high altitude regions.
Keywords：fatty acid desaturase 2 (FAD2);gene cloning;cold stress;expression profile


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本文引用格式
薛晓梦, 李建国, 白冬梅, 晏立英, 万丽云, 康彦平, 淮东欣, 雷永, 廖伯寿. 花生FAD2基因家族表达分析及其对低温胁迫的响应[J]. 作物学报, 2019, 45(10): 1586-1594. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.84177
XUE Xiao-Meng, LI Jian-Guo, BAI Dong-Mei, YAN Li-Ying, WAN Li-Yun, KANG Yan-Ping, HUAI Dong-Xin, LEI Yong, LIAO Bo-Shou. Expression profiles of FAD2 genes and their responses to cold stress in peanut[J]. Acta Agronomica Sinica, 2019, 45(10): 1586-1594. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.84177


花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内主要的油料作物之一, 集中分布在热带、亚热带以及温带地区^[1]。我国是主要的花生生产国, 目前种植面积达到近500万公顷, 占全球的20%。我国花生总产的一半左右用于榨油, 是世界上最大的花生消费国^[2,3]。

花生的脂肪酸组成对其营养价值、食用品质、存储和加工性能以及市场价值等方面起着决定性作用。油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)是花生脂肪酸的主要成分, 其总和约占80%, 高油酸花生中油酸含量达到75%以上^[4]。油酸能选择性地降低人体血液中有害的低密度胆固醇, 而保持有益的高密度胆固醇, 可有效预防心血管疾病的发生, 而且高油酸花生抗氧化能力强、货架期长, 因此受到广大消费者和花生加工企业的青睐。

在高油酸花生推广的过程中发现, 高油酸品种在低温条件下出苗率低, 特别在东北地区播种遭遇低温时常烂种, 高油酸品种表现不耐低温^[5]。花生高油酸性状是由2对Δ¹²脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因隐性突变导致的^[6]。已有研究报道, 拟南芥(Arabidopsis thaliana) fad2突变体植株在低温条件下生长缓慢, 植株矮小, 耐低温能力显著低于野生型拟南芥^[7,8]。酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ScFAD2基因在低温处理2 h后ScFAD2转录水平上调, 之后其表达量回复到日常水平^[9]。棉花(Gossypium hirsutum)的GhFAD2-3和GhFAD2-4在低温处理下表达量显著提高, 而GhFAD2-1和GhFAD2-2的表达不受温度影响^[10]。花生具有多个AhFAD2家族基因, 它们在不同组织中的表达量不尽相同^[11]。对于花生中的AhFAD2家族基因与花生耐寒性的关系鲜有报道。研究花生AhFAD2基因在低温胁迫条件下的响应水平, 对解析高油酸花生的耐寒性具有重要意义。

本研究从栽培种花生中克隆得到7个FAD2基因, 并通过荧光定量PCR (qRT-PCR)探究其在高油酸花生(ZH413)和普通油酸花生(ZH16)各组织器官中的表达模式, 通过比较ZH413和ZH16在低温胁迫条件下的发芽率、各AhFAD2基因在低温下的表达模式来分析花生FAD2基因与其耐低温能力的相关性, 将为解析和改良高油酸花生的耐寒性提供理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通油酸花生中花16 (ZH16)油酸含量为54.3%, 高油酸花生中花413 (ZH413)油酸含量为78.8%, 均为珍珠豆型花生。种植试验在中国农业科学院油料作物研究所试验基地(武昌)进行, 于2017年5月初播种, 8月底收获。

1.2 试剂与测序分析

大肠杆菌感受态Trans10、pEASY-Blunt Cloning Kit、Taq聚合酶、RNA抽提试剂盒均购自全式金生物科技有限公司; SYBR荧光PCR染料、反转录试剂盒等均购自诺唯赞生物科技有限公司; PCR引物的合成和测序由武汉擎科生物科技有限公司协助完成。

1.3 总RNA的提取及cDNA的合成

花生播种后6 d, 分别收集ZH16和ZH413的胚根、胚轴、子叶和真叶; 60 d后分别收集ZH16和ZH413的根、茎、新叶、老叶、花以及未入土的果针; 100 d后分别收集ZH16和ZH413发育的种子, 并根据其种子形态划分为5个时期。将所有收集到的样品液氮速冻后, 存于-80℃备用。

取100 mg左右的样品置液氮冷却的研钵中, 加入液氮迅速研磨成粉, 按照RNA提取试剂盒的方法提取总RNA。通过分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量, 取1 μg的DNA-free RNA根据反转录试剂盒提供的方法和将其反转为cDNA。

1.4 FAD2家族基因的克隆和测序分析

利用已知的花生FAD2基因(KF741365和KF741366)编码的氨基酸序列, 在花生基因组信息(http://www.peanutbase. org/)中进行blast分析, 得到花生中所有AhFAD2基因序列信息, 并根据核苷酸序列设计引物(表1)。分别以ZH16和ZH413发育种子的cDNA为模板, 克隆得到所有AhFAD2基因, 送公司测序。利用Copmuter PI/MW (https://web.expasy.org/protparam/)预测FAD2蛋白质的等电点及相对分子质量。

Table 1
表1
表1克隆AhFAD2基因使用的引物及其序列
Table 1Sequences of primers for cloning of AhFAD2

基因 Gene	基因注册号 Accession No.	上游引物 Forward primer (5°-3°)	下游引物 Reverse primer (5°-3°)
AhFAD2-1A	Aradu.G1YNF	GATTATTGACTTGCTTTGTAGTAGTGC	ACACAAACGTTTTCAACTCTGAC
AhFAD2-1B	Araip.S3GXY	CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTGC	ACACAAACGTTTCCAACTCTGAC
AhFAD2-2	Araip.65EGG	CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTGC	ACACAAACGTTTCCAACTCTGAC
AhFAD2-3A	Aradu.10027244	AGCACAACCGATAATACTCTCCCAA	TTATTCTGAGCACAACCGATAATA
AhFAD2-3B	Araip.D6HPL	CTCTGTTCCTCCTTCAAACAGGACG	TAATCAACCATCCTAATTGGCAGAA
AhFAD2-4A	Aradu.7W39T	ATGGGGTCTGGGGGTCATTCTTCCG	TTAAAGCTTATTATACCAAAGAACACCTTT
AhFAD2-4B	Araip.WI51C	ATGGGGTCTGGTGGTCATTCTG	TTAAAGCTTATTATACCAAAGAACACCT

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1.5 FAD2家族基因的表达模式分析

通过在线工具Integrated DNA Technologies (http://sg. idtdna.com/scitools/Applications/RealtimePCR/)设计AhFAD2基因的荧光定量PCR引物(表2)。

Table 2
表2
表2Real time PCR引物及其碱基序列
Table 2Sequences of primers for real-time PCR

基因 Gene	引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence (5°-3°)
AhFAD2-1A and AhFAD2-1B	RTAhFAD2-1-F	TTTATGTCTCAGATTCATCTGT
	RTAhFAD2-1-R	CCTCTTAACCAGTCCCATTCG
AhFAD2-2	RTAhFAD2-2-F	TTCTAATTTATGTCTCAGGACTCAG
	RTAhFAD2-2-R	CCATAATCTCTGTCCACTGTTGCCA
AhFAD2-3A and AhFAD2-3B	RTAhFAD2-3-F	GGTCTTATCCGTCTTGTCATGG
	RTAhFAD2-3-R	AGATGAATCGTAATGTGGCAATG
AhFAD2-4A and AhFAD2-4B	RTAhFAD2-4-F	TGGCCTTTGTACTGGTTCG
	RTAhFAD2-4-R	GGACGAGAAGGAAAGAATGGAG
AhActin	Actin-F	TAAGAACAATGTTGCCATACAGA
	Actin-R	GTTGCCTTGGATTATGAGC

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以ZH16和ZH413不同生长时期各组织的cDNA为模板, 按照TaKaRa荧光定量试剂盒SYBR Premix ExTaq说明书进行PCR, 反应体系为20 μL, 包含SYBR Premix ExTaq (2×) 10 μL、引物(F/R)各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH₂O 8 μL。反应程序为95℃变性3 min; 95℃变性30 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 测荧光值, 40个循环; 最后计算溶解曲线以0.1℃ s^-1的速度从60℃升至90℃。设每个反应3个重复, 利用2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。利用Graph Pad Prism 5软件和Microsoft Excel软件处理和分析实验数据。

1.6 低温胁迫试验

分别挑选50粒ZH16和ZH413的饱满种子, 置培养皿中充分吸胀后, 分别置15℃和25℃培养箱中, 分别在1、3、6 d统计的发芽种子, 并选取5粒有代表性的种子提取其总RNA, 并反转得到cDNA。以上试验重复3次。

发芽率(%) = 发芽的种子数/参试种子总数×100

利用上述设计的FAD2家族基因荧光定量PCR引物,按照翊圣荧光定量试剂盒SYBR Premix ExTaq说明书进行qRT-PCR。

2 结果与分析

2.1 花生AhFAD2家族基因的克隆

利用已知的花生FAD2基因(KF741365和KF741366)编码的氨基酸序列, 在花生基因组信息网站(https://www. peanutbase.org/)中进行blast分析, 共得到7个AhFAD2基因。分别以ZH16和ZH413发育种子的cDNA为模板, 克隆测序得到这些基因ORF的序列信息, 并根据它们在花生基因组中的位置和同源性分别命名为AhFAD2-1A、AhFAD2-1B、AhFAD2-2、AhFAD2-3A、AhFAD2-3B、AhFAD2-4A和AhFAD2- 4B (表3), AhFAD2-1A/B为1对同源基因, 分别位于A09和B09染色体上, 均编码379个氨基酸, 相对分子质量为43.65 kDa, pI为8.9; AhFAD2-2中第451位的G突变为T, 形成终止密码子, 导致翻译提前终止; AhFAD2-3A/B为1对同源基因, 分别位于A06和B06染色体上, 分别编码349个和383个氨基酸, 相对分子质量分别为39.7 kDa和43.8 kDa, PI分别为8.85和8.80; AhFAD2-4A/B一对同源基因, 分别位于A09和B09染色体上, 均编码387个氨基酸, 相对分子质量为45.0 kDa, pI分别为8.94和9.04。

Table 3
表3
表3花生FAD2家族基因信息
Table 3Information of FAD2 family genes in peanut

基因编号 Gene	基因注册号 Accession No.	染色体 Chr.	翻译阅读框 ORF (bp)	氨基酸残基 Len (aa)	相对分子质量 Molecular weight (kDa)	等电点 pI
AhFAD2-1A	Aradu.G1YNF	A09	1140	379	43.65	8.90
AhFAD2-1B	Araip.S3GXY	B09	1140	379	43.65	8.90
AhFAD2-2	Araip.65EGG	B09	453	150	17.20	8.30
AhFAD2-3A	Aradu.10027244	A06	1050	349	39.70	8.85
AhFAD2-3B	Araip.D6HPL	B06	1152	383	43.80	8.80
AhFAD2-4A	Aradu.7W39T	A09	1164	387	45.00	8.96
AhFAD2-4B	Araip.Wi51C	B09	1164	387	45.00	9.04

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2.2 花生AhFAD2基因的表达分析

利用荧光定量PCR分析各AhFAD2基因在高油酸花生ZH413和普通油酸ZH16的15个组织中的表达模式(图1)表明, AhFAD2-1A/B主要在花生发育种子中表达, AhFAD2-1A/B在ZH16的花中也高量表达, 但该基因在ZH413中表达量较低。在种子发育的各个时期, ZH16中AhFAD2-1A/B表达量均高于ZH413。AhFAD2-2的表达模式与AhFAD2-1A/B类似, 虽然在花生的各组织均有表达, 但表达量都很低。AhFAD2-3A/B在花生的各组织均有表达, 但主要在叶片和茎中表达, 而在种子中的表达量相对较低。AhFAD2-3A/B在ZH16幼嫩叶片和果针中的表达量比在ZH413中高, 而AhFAD2-3A/B在ZH413花和发育早期的种子中的表达量比在ZH16中高。AhFAD2-4A/B主要在根和花中高量表达, 在花中的表达量最高, 是根中表达量的1000倍左右。AhFAD2-4A/B在ZH16和ZH413各组织中的表达量没有显著差异。通过比较AhFAD2-1A/B、AhFAD2-3A/B和AhFAD2-4A/B在花生种子发育各时期的表达量发现, AhFAD2-1A/B在ZH16和ZH413的种子发育中后期表达量最高。AhFAD2-3A/B在ZH16和ZH413种子发育各时期均有表达, 且在ZH413的种子发育初期表达量最高。而AhFAD2-4A/B在ZH16和ZH413种子发育各时期表达量都很低。以上结果表明, 花生各AhFAD2 基因的表达模式不尽相同, 其可能在不同发育阶段、不同组织中发挥作用, 例如AhFAD2-1A/B是花生种子中决定油酸含量的关键基因, 而AhFAD2-3A/B在营养组织中的表达量较高, 可能是调控花生营养组织中不饱和脂肪酸含量的主要基因。

图1

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图1AhFAD2基因在15个花生组织中的表达水平

A: 本研究中涉及到的15个花生组织。I: 播种6 d后的胚根; II: 播种6 d后的胚轴; III: 播种6 d后的子叶; IV: 播种6 d后的真叶; V: 播种60 d后的根; VI: 播种60 d后的果针; VII: 播种60 d后的茎; VIII: 播种60 d后的幼嫩叶片; IX: 播种60 d后的成熟叶片; X: 播种60 d后的花; XI: 白色、扁平的发育中的种子; XII: 白色、水滴形的发育中的种子; XIII: 白色、鱼雷形的发育中的种子; XIV: 浅粉色、圆形的发育中的种子; XV: 深粉色、成熟的种子。B: AhFAD2基因在15个花生组织中的表达水平。白色表示普通油酸材料ZH16; 灰色表示高油酸材料ZH413。经单因素方差分析差异达到显著水平。* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001。C: AhFAD2基因在花生发育种子中的表达分析。标有不同小写字母的柱值表示经单因素方差分析和最小显著差异法(LSD)检验差异达到显著水平(P < 0.05)。
Fig. 1Expression levels of AhFAD2 genes in 15 peanut tissues

A: 15 peanut tissues involved in this study. I: radicle after 6 days of sowing; II: hypocotyl after 6 days of sowing; III: cotyledon after 6 days of sowing; IV: true leaves after 6 days of sowing; V: root after 60 days of sowing; VI: peg after 60 days of sowing; VII: stem after 60 days of sowing; VIII: yong leaves after 60 days of sowing; IX: mature leaves after 60 days of sowing; X: flowers after 60 days of sowing; XI: white and flat developing seeds; XII: white and drop-shaped developing seeds; XIII: white and torpedo-shaped developing seeds; XIV: light pink and round developing seeds; XV: dark pink and mature seeds. B: expression analysis of AhFAD2 genes in 15 tissues of peanut. The white column indicates normal oleate peanut ZH16, the gray column indicates high oleate peanut ZH413. Differences reached a significant level by one-way analysis of variance. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. C: expression analysis of AhFAD2 genes in developing seeds. Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at P < 0.05 by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

2.3 低温处理对ZH16和ZH413发芽率的影响

在25℃和15℃温度处理下, 分别统计ZH16和ZH413种子的发芽率(表4)。25℃条件下, 种子浸泡24 h后即可露白; 而在15℃条件下, 种子的萌发时间显著延长, 种子在3 d后开始露白。在25℃条件下, ZH16的种子发芽率为91.33%, ZH413的种子发芽率为94.66%, 差异不显著; 而在15℃条件下, ZH16的种子发芽率为45.00%, ZH413的种子发芽率为98.67%, ZH16的发芽率显著低于ZH413 (表4和图2)。以上结果表明, 虽然低温均延长了ZH16和ZH413的萌发时间, 但是ZH413在低温处理6 d后发芽率仍然达到90%以上, 而ZH16在低温处理下发芽率显著降低。因此, 高油酸花生的耐寒性并不一定比普通油酸花生差。

Table 4
表4
表4不同温度处理条件下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的种子发芽率
Table 4Seed germination rates of normal oleate ZH16 and high oleate ZH413 under different temperatures

温度 Temperature (℃)	ZH16种子发芽率 Germination rate of ZH16 (%)	ZH413种子发芽率 Germination rate of ZH413 (%)
25	91.33±5.25 bc	94.66±3.77 b
15	45.00±7.34 c	98.67±0.94 a

Values followed by different lowercase letters are significantly different at P < 0.05 are determined by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.
标以不同小写字母的值表示经单因素方差分析和最小显著差异法(LSD)检验差异达到显著水平(P < 0.05)。

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图2

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图2不同温度处理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的种子发芽情况

Fig. 2Seed germination test of normal oleate ZH16 and high oleate ZH413 under different temperatures

2.4 低温胁迫对AhFAD2基因在高油酸和普通油酸花生中表达模式的影响

为了调查AhFAD2基因在低温胁迫条件下是否参与了花生的低温响应过程, 利用荧光定量PCR分析了不同温度处理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413萌发种子中各AhFAD2基因的表达模式(图3)。研究发现, 在25℃条件下, ZH16和ZH413中AhFAD2-1A/B随着处理时间的延长, 其表达量逐渐增加(图3-a, d)。而在15℃条件下, ZH16中AhFAD2-1A/B前3 d的表达量与25℃处理条件下的表达量差异不显著; 在处理第6天, AhFAD2-1A/B在15℃条件下的表达量比在25℃条件下的表达量显著提高(图3-a)。处理第1天, ZH413中AhFAD2-1A/B在15℃条件下的表达量比在25℃条件下的表达量显著上调20倍以上, 但在第3天后其表达量显著下调, 比在25℃条件下的表达量显著下调10倍以上(图3-d), 表明AhFAD2-1A/B是受低温诱导表达的基因, 在ZH16中响应较慢, 但在ZH413中响应非常快。

图3

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图3在不同温度处理下各AhFAD2基因在ZH16和ZH413中的表达分析

a: 在不同温度处理下, AhFAD2-1A/B在ZH16中的表达模式; b: 在不同温度处理下, AhFAD2-3A/B在ZH16中的表达模式; c: 在不同温度处理下, AhFAD2-4A/B在ZH16中的表达模式; d: 在不同温度处理下, AhFAD2-1A/B在ZH413中的表达模式; e: 在不同温度处理下, AhFAD2-3A/B在ZH413中的表达模式; f: 在不同温度处理下, AhFAD2-4A/B在ZH413中的表达模式。经单因素方差分析差异达到显著水平, * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001。
Fig. 3Expression analysis of AhFAD2 genes in ZH16 and ZH413 under different temperature

a: expression pattern of AhFAD2-1A/B in ZH16 under different temperature treatment conditions; b: expression pattern of AhFAD2-3A/B in ZH16 under different temperature treatment conditions; c: expression pattern of AhFAD2-4A/B in ZH16 under different temperature treatment conditions; d: expression pattern of AhFAD2-1A/B in ZH413 under different temperature treatment conditions; e: expression pattern of AhFAD2-3A/B in ZH413 under different temperature treatment conditions; f: expression pattern of AhFAD2-4A/B in ZH413 under different temperature treatment conditions. Significant differences are determined by one-way analysis of variance. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.


在25℃条件下, ZH16和ZH413中AhFAD2-3A/B表达量均随着时间的延长而逐渐减少(图3-b, e)。在15℃条件下, ZH16中AhFAD2-3A/B的表达量显著下调, 且始终比其在25℃条件下的表达量低(图3-b); 而ZH413中AhFAD2-3A/B的表达量与其在25℃条件下的表达量差异不显著(图3-e)。

在25℃条件下, ZH16中AhFAD2-4A/B不同时间点的表达量变化不显著(图3-c); 而ZH413中AhFAD2-4A/B在6 d后表达量显著上调(图3-f)。在15℃条件下, ZH16中AhFAD2-4A/B的表达量第3天出现显著上调, 在第6天时又显著下调(图3-c); 而ZH413中AhFAD2-4A/B的表达量从第1天就显著上调, 且在处理的6 d中表达量一直维持在高水平, 虽然呈现下降趋势, 但始终比其在25℃条件下的表达量高20倍以上(图3-f)。以上结果表明, AhFAD2- 4A/B受低温诱导表达, 在ZH16中其表达量呈先上升后下降的趋势, 而在ZH413中始终维持在高水平表达, 呈微弱下降趋势。

综合以上结果得出, 在低温胁迫种子萌发过程中, AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B均受低温诱导表达, 而在高油酸材料中AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B的响应速度都比在普通油酸材料中快, 表达量上调的倍数也比在普通油酸材料中多, 特别是AhFAD2-4A/B基因在高油酸材料受到低温胁迫时始终维持在高水平表达, 推测其高水平的表达部分弥补了突变的AhFAD2-1A/B的功能。

3 讨论

花生属于温带和亚热带作物, 整个生育期需要足够的光照强度和合适的温度条件, 温度是限制花生种植分布的重要因素。低温会造成花生烂种增多、发芽率降低、出苗迟缓, 致使基本苗减少, 生育期延长, 最终导致减产。已有研究表明, 细胞中多不饱和脂肪酸的含量与植物的抗寒能力具有一定相关性, 多不饱和脂肪酸含量越高, 抗寒性越强^{[12,13,14,15,16]}。脂肪酸脱氢酶是生物体内调控不饱和脂肪酸合成的关键酶, 细胞中脂肪酸脱氢酶的种类和数量是决定植物抗寒性的重要因素^[17,18,19]。本研究系统分析了花生FAD2家族全部AhFAD2基因, 并调查了这些AhFAD2基因在花生15个组织中的表达模式, 以及它们在受到低温胁迫时表达模式的变化。

FAD2 基因是一个含有多个成员的基因家族, 甘蓝型油菜中含有4个BnFAD2基因^[20], 红花(Carthamus tinctorius)中含有11个CtFAD2基因^[21]。本研究从栽培种花生中共克隆到7个AhFAD2基因, 其中6个成对出现, 分布在A、B亚基因组的相应位置, 仅AhFAD2-2基因没有找到A亚基因组相对应的拷贝。AhFAD2-2基因的第451位碱基G突变为T, 形成终止密码子, 导致翻译提前终止, 翻译的蛋白不具有功能。阮建等^[11]研究发现花生FAD2家族中含有6个基因, 与本研究结果基本一致, 但本研究克隆得到Araip.D6HPL在A06染色体上的同源基因Aradu.10027244。

已有大量研究报道, AhFAD2-1A和AhFAD2-1B是与高油酸花生形成相关的AhFAD2基因^{[22,23,24,25]}, 通过表达模式分析发现, 相较于其他AhFAD2基因, AhFAD2-1A/B在发育种子中的表达量最高, 因此AhFAD2-1A/B基因是花生种子中最重要的AhFAD2基因。这也解释了为什么花生中存在6个有功能的AhFAD2基因, 仅AhFAD2-1A和AhFAD2- 1B发生突变就可以使花生种子中油酸含量从40%提高到80%。

AhFAD2-3A/B在花生发育种子中的表达量排第二, 但其在营养组织中的表达量更高。AhFAD2-4A/B在花生发育种子中的表达量极低, 但是在根和花中的表达量很高。以上结果表明, 花生的AhFAD2基因具有表达的组织偏好性, 以此实现不同AhFAD2基因在花生生长发育过程中的分工。在其他植物中也发现了类似现象, 红花中11个CtFAD2基因也具有表达的组织特异性, CtFAD2-1和CtFAD2-10主要在花和发育的种子中表达, CtFAD2-2在各个组织中都表达, 而CtFAD2-5和CtFAD2-8主要在根中特异表达^[21]。

AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B均在受到低温胁迫后上调表达, 特别是在高油酸花生中, AhFAD2-1A/B和AhFAD2-4A/B的响应速度和上调倍数均比在普通油酸材料中快且多。在其他植物中也发现FAD2基因受低温诱导表达。橄榄中的OeFAD2-1在橄榄冷驯化的过程中参与冷胁迫响应, 转录活性提高, 提高种子中亚油酸含量, 促进角质的形成, 从而保护胚乳^[26]。棉花中的GhFAD2-3和GhFAD2-4受到低温胁迫后, 转录水平显著上调^[10]。唐桂英等^[27]通过低温处理花生幼苗叶片发现, AhFAD2-2A/B (对应本研究中的AhFAD2-3A/B)受低温胁迫诱导表达。但本研究中AhFAD2-3A/B在受到低温胁迫后没有表现出转录水平的变化, 可能由于处理的样品是萌发种子, 也许它更多参与花生苗期或中后期的调控。大豆中GmFAD2-2在营养生长组织和发育的种子中均有表达, 但在受到冷胁迫刺激时, 转录水平并无明显差异^[28]。

高油酸花生中AhFAD2-1基因发生突变, 引起种子中甘油三酯的脂肪酸组成变化, 即在大幅提高油酸含量的同时也大幅降低亚油酸的含量^[29]。但是这种变化可能不局限于甘油三酯, 种子膜脂中亚油酸含量也有可能大幅降低^[30,31]。而细胞膜中, 多不饱和脂肪酸(比如亚油酸、亚麻酸)含量越高, 越有利于细胞膜的流动性^[32]。当低温胁迫时, 细胞膜流动性下降, 黏度增加, 运输功能下降, 严重时细胞膜从常态的液晶相转变为凝胶相, 膜的结构改变, 透性增大, 最终致细胞死亡^[33]。AhFAD2-1基因主要在发育的种子中表达, 而在种子发育的过程中, 高油酸花生中合成的亚油酸总量可能比普通油酸花生中的总量少, 也有可能造成高油酸花生的细胞膜中亚油酸含量偏低, 即高油酸花生种子细胞膜流动性可能比普通油酸花生的差。因此, 当高油酸花生和普通油酸花生在萌发时遭遇低温胁迫, 有可能因为种子发育过程中造成的膜脂中亚油酸含量的差异, 从而影响萌发过程中的细胞膜流动性, 最终表现为发芽率的差异。本研究通过比较高油酸花生ZH413和普通油酸花生ZH16在低温处理下的发芽率发现, ZH413的发芽率并没有显著下降, 而ZH16发芽率显著下降, 说明在影响花生耐寒性的诸多因素中, AhFAD2-1A/B功能的缺失并不是决定其耐寒性的主要因素。AhFAD2-1A/B主要在种子中表达, 其功能的缺失并不会影响花生营养器官的生长发育, 而AhFAD2-3A/B主要在营养器官中发挥作用, 高油酸花生中该基因并没有发生突变, 理论上不会影响其营养器官的耐寒性。在萌发的种子中, 虽然高油酸花生中AhFAD2-1A/B丧失了功能, 但AhFAD2-4A/B在受到低温胁迫时持续显著上调表达, 也部分弥补了AhFAD2-1A/B缺失的功能, 及时合成亚油酸, 从而维持细胞膜的流动性, 保障了高油酸花生的耐寒性。因此, 高油酸花生的耐寒性是否一定比普通油酸花生差, 这一论断仍然有待继续深入研究。本研究结果为高油酸在高纬度、高海拔地区的普及提供了可能性, 通过筛选耐寒性较强的高油酸品种可以实现其在高纬度、高海拔地区的种植。

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