<script type="text/javascript" src="https://cdn.bootcss.com/mathjax/2.7.2-beta.0/MathJax.js?config=TeX-AMS-MML_HTMLorMML"></script> <script> MathJax = { tex: { inlineMath: [['$', '$'], ['\\(', '\\)']] }, svg: { fontCache: 'global' } }; </script> 孙程明^1,2, 陈松¹, 彭琦¹, 张维¹, 易斌^,2,*, 张洁夫^,1,*, 傅廷栋²1 江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/江苏省现代作物生产协同创新中心, 江苏南京 210014
2 华中农业大学植物科学技术学院/作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070

Genome-wide association study of silique length in rapeseed (Brassica napus L.)

SUN Cheng-Ming^1,2, CHEN Song¹, PENG Qi¹, ZHANG Wei¹, YI Bin^,2,*, ZHANG Jie-Fu^,1,*, FU Ting-Dong² 1 Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210014, Jiangsu, China
2 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement/College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;

通讯作者: *张洁夫, E-mail: jiefu_z@163.com。 易斌, E-mail: yibin@mail.hzau.edu.cn

收稿日期:2019-02-12接受日期:2019-05-12网络出版日期:2019-05-17

基金资助:

本研究由国家重点研发计划项目.2018YFD0100601 国家现代农业产业技术体系建设专项资助.CARS-12

Received:2019-02-12Accepted:2019-05-12Online:2019-05-17

Fund supported:

The study was supported by the National Key Research and Development Program of China.2018YFD0100601 the China Agriculture Research System.CARS-12

作者简介 About authors
E-mail:suncm8331537@gmail.com。









摘要
角果长度是油菜重要的农艺性状, 适度增加角果长度有利于扩大角果库容量, 增加光合面积, 提高油菜的籽粒产量。本研究利用Illumina 60K SNP芯片对496份具有代表性的油菜资源进行基因型分析, 考察群体在4个环境中的角果长度表型, 利用MLM和GLM模型进行全基因组关联分析。结果表明, MLM模型检测到7个位点, 联合解释25.01%的表型变异; GLM模型检测到25个位点, 联合解释41.77%的表型变异。合并共同位点后得到27个位点, 其中7个与前人报道的QTL重叠, 其余20个是新鉴定的位点。效应最大的位点Bn-A09-p29991443位于A09染色体, 在MLM和GLM模型中分别解释13.89%和12.86%的表型变异, 携带其优异等位基因的材料平均角果长度增加0.89 cm。同时, 在该位点附近找到已克隆的油菜角果长度基因ARF18和BnaA9.CYP78A9。此外, 在5个位点附近发现拟南芥已知角果长度基因GID1b、FUL、EOD3、DOF4.4和GA20ox1的同源拷贝。本研究结果有助于解析角果长度的遗传基础, 为研究角果长度的调控机理, 指导角果长度的遗传改良打下基础。
关键词： 甘蓝型油菜;产量;角果长度;关联分析;SNP标记

Abstract
Silique length is a key agronomic trait of rapeseed. Moderately increasing silique length is conducive to high seed yield by enlarging photosynthetic area and seed volume. A collection of 496 representative rapeseed accessions was genotyped by the Illumina 60K SNP array, and phenotyped for silique length in four environments. The genome-wide association study (GWAS) of silique length was performed via the MLM (Mixed linear model) and GLM (General linear model). Seven loci and 25 loci were detected with MLM and GLM, which explained 25.01% and 41.77% of the phenotypic variance, respectively. Combining the common loci between two models, we finally got 27 unique loci, of which seven were overlapped with reported QTLs, and 20 were new one. Bn-A09-p29991443, the most effective locus, was located on chromosome A09, accounting for 13.89% and 12.86% of the phenotypic variance in MLM and GLM, respectively. Silique length of accessions with the favorable allele of Bn-A09-p29991443 was averagely 0.89 cm longer than that with the unfavorable allele. The cloned silique length genes ARF18 and BnaA9.CYP78A9 in rapeseed was found to be colocalized with Bn-A09-p29991443. Besides, five candidates including GID1b, FUL, EOD3, DOF4.4 and GA20ox1, orthologous to documented Arabidopsis silique length genes, were found near our GWAS loci. The results provide an insight into the genetic basis of silique length and lay a foundation for further mechanism exploration and breeding for this trait in B. napus.
Keywords：Brassica napus L;yield;silique length;GWAS;SNP


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本文引用格式
孙程明, 陈松, 彭琦, 张维, 易斌, 张洁夫, 傅廷栋. 甘蓝型油菜角果长度性状的全基因组关联分析[J]. 作物学报, 2019, 45(9): 1303-1310. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.94021
SUN Cheng-Ming, CHEN Song, PENG Qi, ZHANG Wei, YI Bin, ZHANG Jie-Fu, FU Ting-Dong. Genome-wide association study of silique length in rapeseed (Brassica napus L.)[J]. Acta Agronomica Sinica, 2019, 45(9): 1303-1310. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.94021


油菜是我国重要的油料作物, 种植面积约690万公顷, 产油量占国产植物油总量的55%以上, 是我国最大的食用植物油来源^[1]。作为食用油消费大国, 我国食用油自给率仅35%左右, 因此, 提高产量成为油菜育种最迫切的目标。角果长度是油菜重要的产量相关性状, 解析其遗传基础对提高油菜产量具有重要意义。

角果是油菜重要的光合产物贮存器官, 适度增加角果长度, 可增加角果库容量, 有利于灌浆物质向籽粒中运输, 每角粒数和籽粒大小也随之提高^[2]。此外, 角果还是油菜成熟后期重要的光合器官, 在角果完全伸展后, 角果皮面积占全株光合面积的60.6%^[3]; 对角果遮光处理导致油菜的千粒重降低54.7%、籽粒产量降低62.1%、含油量降低44.2%^[3]。冷锁虎等^[2]研究表明, 角果长度每增加1 cm, 群体中角果皮面积占总光合面积的比例增加2.64%。因此适度增加角果长度有利于扩大角果库容量, 增加全株光合面积, 从而提高油菜的籽粒产量。

油菜角果长度是受多基因调控的数量性状, 众多研究者采用遗传差异较大的双亲构建连锁群体, 进行角果长度的QTL定位。Udall等^[4]定位的角果长度QTL分布在A09、C02和C08连锁群, 其中A09连锁群的QTL ln9.5贡献率为25.3%^[4]; Yang等^[5]定位到的QTL分布在A01、A02、A06、A07、A09、C02、C03和C04连锁群, 其中A09连锁群的QTL qSLA9.3能解释65.6%的表型变异; 漆丽萍^[6]在A01、A07、A09和A10连锁群检测到11个QTL, 其中贡献率最大的2个QTL均位于A09, 在3个环境中分别解释38.3%~60.0%和11.2%~16.5%的表型变异; Wang等^[7]在A05、A06、C01、C05和C06检测到11个QTL, 解释3.4%~14.36%的表型变异; Fu等^[8]在A01、A05、A09和C08连锁群上检测到20个角果长度QTL, 效应最大的2个QTL均位于A09; Yang等^[9]在A05、A09、C02、C08和C09检测到7个角果长度QTL, 位于C09的主效位点解释26.51%的表型变异。

近年来, 随着高密度SNP基因分型芯片和全基因组测序等技术的发展, 全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)已广泛应用于玉米^[10,11]、水稻^[12,13]、油菜^[14,15]等作物复杂性状的遗传结构解析。本研究利用60K SNP芯片对群体进行基因型分析, 并对角果长度进行全基因组关联分析, 旨在挖掘显著的SNP位点, 分析其候选基因, 为油菜角果长度的遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于关联分析的496份甘蓝型油菜包括地方品种、育成品种及高世代育种材料。其中国内资源444份, 主要来自湖北、重庆、江苏、湖南、四川、陕西等油菜主产省市; 国外资源52份, 主要来自德国、瑞典、朝鲜、加拿大等国家(附表1)。所有材料均由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供。

Table 1
表1
表1关联群体角果长度性状的统计分析
Table 1Statistical analysis of silique length of the association panel

环境 Environment	最小值 Min.	最大值 Max.	平均值±标准差 Mean ± SD	变异系数 CV
2013/2014 Nanjing	3.42	11.37	5.40±1.01	0.19
2013/2014 Nanjing	3.28	15.80	6.39±1.25	0.20
2014/2015 Taizhou	3.31	10.18	5.79±0.88	0.15
2015/2016 Taizhou	4.01	9.94	5.90±0.77	0.13

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1.2 田间试验与表型调查

2013年、2014年于江苏南京(13NJ和14NJ), 2015年、2016年于江苏泰州(15TZ和16TZ), 采用完全随机区组设计种植自然群体, 在南京设置3次重复, 在泰州设置2个重复。单个材料每重复种2行, 每行15株, 行宽1.5 m, 行距40 cm, 行长1.5 m。每年10月上旬大田直播, 田间管理按当地常规方式进行。在油菜成熟期, 取每小区8株长势一致的植株, 选主花序中部10个角果测量角果长度。利用R软件对各环境的角果长度表型进行统计分析和相关性分析, 并计算广义遗传力和最佳线性无偏预测值(best linear unbiased prediction, BLUP)^[16,17]。

1.3 基因型检测与分析

利用Illumina 60K SNP芯片分析基因型。在Genome Studio软件中, 剔除Call Freq < 0.75, Minor Freq < 0.05, AA, BB frequencies < 0.03及GenTrain Scores < 0.50的SNP, 基因型杂合的SNP按缺失值处理。将过滤后的33,218个SNP序列比对至油菜Darmor-bzh基因组, E-value阈值设为10^-12, 保留19,167个单拷贝、位置清楚的SNP标记用于后续分析。

1.4 全基因组关联分析

用Structure 2.3.3计算群体结构Q矩阵 ^[18], 用SPAGeDi计算材料间的亲缘关系K矩阵^[19]。将基因型、表型、Q矩阵和K矩阵导入Tassel 4.0后, 以Q矩阵和Q+K矩阵作协变量, 分别进行基于一般线性模型(General Linear Model, GLM)和混合线性模型(Mixed Linear Model, MLM)的全基因组关联分析^[20]。关联分析的显著性阈值 (Bonferroni threshold) 定为1/总标记数, 即-lg (P) = 4.28。当1 Mb区间内存在多个显著SNP时, 如果两两间的r² ≥ 0.1, 则将这些SNP归为一个关联位点, 以最小P值的SNP作为代表。用R软件包qqman绘制曼哈顿图和QQ (Quantile-Quantile)图^[21]。用R软件中逐步回归分析的lm功能分析关联位点解释的总表型变异。首先, 挑选出关联区间的lead SNP, 将其中一种等位基因型标记成1, 另外一种标记成-1, 杂合和缺失位点标记成0; 利用“stepAIC”函数, 通过选择最小的AIC (Akaike information criterion)信息统计量, 逐步增加或剔除lead SNP, 最终确定最适宜的模型, 模型的R²即为总表型变异。

1.5 已报道QTL的信息整理

目前有2篇角果长度的关联分析研究^[22,23], 2个群体分别包含300个和157个株系, 整理其显著位点的信息并与本研究的结果比较。角果长度的连锁分析报道很多, 但多数研究的标记为SSR和AFLP等传统标记, 数目少且无法准确确定其物理位置。漆丽萍^[6]和Yang等^[9]分别用SNP芯片对DH群体进行基因型分析, 本研究将其角果长度QTL两侧的SNP标记比对至油菜Darmor-bzh参考基因组以获得QTL的物理区间。此外, Fu等^[8]利用混池测序将一个角果长度主效QTL定位至油菜A09染色体27.21~ 28.26 Mb区段。

1.6 候选基因挖掘

以r² = 0.1作为衰减阈值, 用Tassel计算显著关联位点的LD 衰减距离作为其置信区间。提取所有显著位点置信区间内的基因CDS序列, 与拟南芥的基因CDS进行BLAST比对, E-value阈值设为10^-10, 以相似度最高的拟南芥基因信息来注释油菜基因。

2 结果与分析

2.1 表型统计分析

496份油菜资源的角果长度在4个环境中具有广泛的变异, 单个环境的角果长度极差范围是5.93~ 12.52 cm。单个环境表型平均值范围是(5.40±1.01) ~ (6.39±1.25) cm, 变异系数范围是0.13~ 0.20 (表1和图1)。由表2可知, 4个环境的角果长度存在极显著相关(P ≤ 0.001), 表明本研究考察的表型数据具有较高的可靠性和重复性。根据R软件包lem4的计算, 角果长度在4个环境的广义遗传力为86.0%。

图1

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图1关联群体在4个环境的角果长度分布

A和B分别指群体在南京和泰州2年的角果长度频数分布图。
Fig. 1Distribution of silique length of the association panel in four environments

A and B, histogram of silique length in Nanjing and Taizhou in two years, respectively.


Table 2
表2
表24个环境的角果长度相关系数
Table 2Correlation coefficients of silique length among four environments

	2012/2013 Nanjing	2013/2014 Nanjing	2014/2015 Taizhou
2013/2014 Nanjing	0.57***
2014/2015 Taizhou	0.64***	0.70***
2015/2016 Taizhou	0.56***	0.57***	0.75***

^*** P ≤ 0.001.

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2.2 角果长度全基因组关联分析

利用MLM模型, 当阈值为-lg (P) = 4.28时, 检测到15个显著SNP。合并存在连锁不平衡的SNP (r² ≥ 0.1), 得到7个显著位点, 分布在A07、A09、C02、C04和C09染色体(表3和图2)。效应最大的位点Bn-A09-p29991443位于A09染色体[-lg (P) = 13.59], 对表型变异的贡献率为13.89%; 携带其等位基因型A的材料(48份)角果长度均值为6.62 cm, 比携带基因型T的材料(389份)角果长度均值增加0.89 cm。商品种如华油6号、华油12号、中双5号、中双7号、中双11号、宁油6号、湘油13号等, 地方品种包括南川长角、湖北白花油菜等均携带该位点的优异等位基因型(附表2)。其余位点的-lg (P)值范围是4.29~ 5.80, 可解释3.21%~5.10%的表型变异。利用一般线性模型计算, 7个位点联合解释25.01%的表型变异。与单环境的关联结果比较, 5个BLUP位点在单环境中被重复检测到, 3个位点在2个环境中得到验证, Bn-A09-p29991443位点在3个环境中被重复检测到。

Table 3
表3
表3MLM角果长度显著关联位点(BLUP)
Table 3Significant GWAS loci of silique length in MLM (BLUP)

标记 Marker	染色体 Chr.	位置 Position	-lg (P)	表型变异 R2 (%)	环境 Environment	已报道QTL Reported QTL
Bn-A07-p8572785	A07	10,018,929	5.80	5.10	13NJ/15TZ
Bn-A09-p28925363	A09	26,858,796	5.15	4.92	13NJ/15TZ	[8, 22]
Bn-A09-p29991443	A09	27,815,620	13.59	13.89	13NJ/14NJ/15TZ	[6, 8, 22, 23]
Bn-scaff_15712_2-p492440	C02	38,697,584	4.67	3.54
Bn-scaff_17869_1-p813291	C04	9,884,407	5.41	4.73	14NJ /15TZ
Bn-scaff_20817_1-p60579	C04	48,635,772	4.56	4.27	15TZ
Bn-scaff_15576_1-p68473	C09	41,121,951	4.29	3.21	13NJ/15TZ

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图2

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图2油菜角果长度全基因组关联分析(BLUP)

A: 角果长度MLM曼哈顿图; B: 角果长度MLM QQ图; C: 角果长度GLM曼哈顿图; D: 角果长度GLM QQ图。水平线代表Bonferroni阈值。
Fig. 2Genome-wide association study of rapeseed silique length (BLUP)

A: Manhattan plot of MLM for silique length; B: Quantile-quantile plot of MLM for silique length; C: Manhattan plot of GLM for silique length; D: Quantile-quantile plot of GLM for silique length. The dashed horizontal line depicts the Bonferroni significance threshold.


通过GLM模型共检测到136个显著SNP, 合并存在连锁不平衡的SNP后得到25个显著位点, 分布在A02、A03、A06、A07、A09、A10、C02、C04、C07、C08和C09染色体(表4和图2)。效应最大的位点和MLM相同, 在GLM模型中Bn-A09- p29991443的-lg (P) = 16.27, 对表型变异的贡献率为12.86%。其余的位点-lg (P)值范围是4.31~9.38, 可解释2.91%~7.76%的表型变异。利用一般线性模型计算, 25个位点联合解释41.77%的表型变异。与单环境的关联结果比较, 23个BLUP位点在单环境中被重复检测到, 其中8、6和5个位点分别在2、3和4个环境中得到验证。比较2个关联模型的结果, 5个MLM位点与GLM重叠, 合并重叠的位点共得到27个位点。利用一般线性模型计算, 27个位点联合解释44.04%的表型变异。

Table 4
表4
表4GLM角果长度显著关联位点(BLUP)
Table 4Significant GWAS loci of silique length in GLM (BLUP)

标记 Marker	染色体 Chr.	位置 Position	-lg (P)	表型变异 R2 (%)	环境 Environment	已报道QTL Reported QTL
Bn-A02-p11454573	A02	8,166,563	4.61	3.72	13NJ/14NJ/15TZ
Bn-A03-p4408895	A03	3,938,915	4.39	2.91
Bn-scaff_16092_1-p866917	A03	18,418,252	4.74	4.66	13NJ/15TZ
Bn-scaff_27914_1-p34836	A06	15,544,511	6.21	5.30	15TZ/16TZ
Bn-A06-p23042849	A06	22,092,944	4.72	3.85	15TZ/16TZ
Bn-A07-p1228602	A07	860,252	4.51	3.76	16TZ
Bn-A10-p12099059	A07	2,762,935	5.02	3.38	15TZ/16TZ
Bn-A07-p7606228	A07	9,162,030	6.03	4.90	13NJ/15TZ/16TZ	[23]
Bn-A07-p8572785	A07	10,018,929	9.38	7.76	13NJ/15TZ/16TZ
Bn-A07-p10340211	A07	11,509,208	4.45	3.70	15TZ/16TZ
Bn-A07-p13957160	A07	15,884,413	5.18	4.20	15TZ/16TZ	[23]
Bn-A07-p18319586	A07	20,221,220	5.14	4.33	14NJ/15TZ	[6, 23]
Bn-A09-p3051349	A09	2,971,335	4.31	3.32	15TZ
Bn-A09-p28925363	A09	26,858,796	6.08	4.89	13NJ/15TZ/16TZ	[8, 22]
Bn-A09-p29991443	A09	27,815,620	16.27	12.86	13NJ/14NJ/15TZ/16TZ	[6, 8, 22, 23]
Bn-A10-p3966740	A10	885,133	6.47	4.46	13NJ/14NJ/15TZ/16TZ	[6]
Bn-A10-p15793623	A10	15,756,213	4.60	3.65
Bn-scaff_17177_1-p381225	C02	44,843,894	5.12	4.13	15TZ
Bn-A05-p4304172	C04	6,449,454	6.96	5.75	14NJ/15TZ/16TZ
Bn-scaff_27914_1-p9919	C04	28,255,420	7.06	6.09	13NJ/14NJ/15TZ/16TZ
Bn-scaff_20817_1-p60579	C04	48,635,772	7.98	6.89	13NJ/14NJ/15TZ/16TZ
Bn-scaff_16069_1-p1668600	C07	38,086,007	6.38	5.29	15TZ/16TZ
Bn-scaff_16069_1-p3731985	C07	40,142,298	5.92	4.63	13NJ/14NJ/15TZ/16TZ
Bn-scaff_16361_1-p241830	C08	27,753,144	4.34	3.48	13NJ	[9]
Bn-scaff_15576_1-p68473	C09	41,121,951	5.47	3.72	14NJ/15TZ/16TZ

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2.3 与前人报道QTL的比较

综合MLM和GLM的结果, 与已报道的角果长度QTL结果比较, 本研究发现的7个位点与前人研究结果一致(表3和表4)。周庆红等^[22]、漆丽萍^[6]、Fu等^[8]、Dong等^[23]通过不同的定位策略检测到效应最大的位点均落在A09染色体27.26~28.61 Mb区段。本研究中效应最大的位点Bn-A09-p29991443也同样落在该区间。位于A07的位点Bn-A07- p18319586物理位置是20.22 Mb, 与Dong等^[23]检测到的角果长度显著位点(范围为19.76~20.57 Mb)重叠, 紧邻漆丽萍^[6]检测到的QTL qSL.A7.2 (范围为21.04~22.52 Mb)。位于C08的位点Bn-scaff_16361_ 1-p241830物理位置是27.75 Mb, 与Yang等^[9]检测到的QTL cqSL.C08a (范围为25.92~27.79 Mb)重叠。此外, 还有4个位点与前人检测的QTL重叠或紧邻。这些结果证实了本研究结果的可靠性。此外, 综合MLM和GLM的结果, 本研究共检测到20个新位点。多个位点效应较高, 如位于A07的Bn-A07-p8572785表型贡献率为9.38%, 位于C04的Bn-scaff_20817_1-p60579表型贡献率为7.98%。多个位点在多环境中被检测到, 可信度高, 例如位于C04染色体的位点Bn-scaff_27914_1-p9919和Bn- scaff_20817_1-p60579及位于C07染色体的位点Bn- scaff_16069_1-p3731985, 这3个位点在4个环境中均被检测到。这些位点值得进一步验证和研究。

2.4 候选基因挖掘

基于中双11号基因组注释信息, 在Bn-A09- p29991443位点下游153 kb和184 kb处分别找到油菜角果长度已知基因ARF18和BnaA9.CYP78A9 (表5)。ARF18编码一个生长素响应因子, 通过生长素信号途径调节角果皮的细胞生长^[24]。BnaA9.CYP78A9编码一个细胞色素P450单加氧酶, 通过调节细胞的伸长影响角果长度^[25]。基于Darmor-bzh基因组注释信息, 在Bn-A09-p3051349位点上游252 kb处找到一个候选基因BnaA09g05500, 该基因的拟南芥同源基因FUL编码一个MADS-box转录因子, 该基因突变导致植株角果无法伸长, 果实不能正常开裂^[26]。在Bn-scaff_ 20817_1-p60579位点上游293 kb处找到一个候选基因BnaC04g50960, 该基因的拟南芥同源基因EOD3编码一个细胞色素P450单加氧酶, 其功能缺失突变体角果长度缩短、种子变小^[27]。在Bn-scaff_16069_1-p1668600位点下游490 kb处找到一个候选基因BnaC07g36530, 该基因在拟南芥中的同源基因DOF4.4属于Dof转录因子家族, RNAi株系角果增长、产量增多^[28]。此外, 本研究还找到别的候选基因, 如拟南芥已知基因GID1b和ga20ox1在油菜中的同源拷贝^[29,30]。

Table 5
表5
表5角果长度关联位点候选基因信息
Table 5Information of candidate genes of silique length GWAS loci

标记 Marker	油菜基因 Rapeseed gene	染色体 Chr.	位置 Position	拟南芥同源基因 Ar. homolog	参考基因组 Ref. genome
Bn-A07-p13957160	BnaA07g19530	A07	15,590,253	GID1b	Darmor-bzh
Bn-A09-p3051349	BnaA09g05500	A09	2,718,832	FUL	Darmor-bzh
Bn-scaff_20817_1-p60579	BnaC04g50960	C04	48,343,005	EOD3	Darmor-bzh
Bn-scaff_16069_1-p1668600	BnaC07g36530	C07	38,575,790	DOF4.4	Darmor-bzh
Bn-scaff_16069_1-p3731985	BnaC07g39650	C07	40,392,394	GA20ox1	Darmor-bzh
Bn-A09-p29991443	BnA09g0377700	A09	36,712,502	ARF18	ZS11
Bn-A09-p29991443	BnA09g0377760	A09	36,740,578	CYP78A9	ZS11

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3 讨论

角果长度是油菜重要的农艺性状, 适度增加角果长度有利于扩大角果库容量, 增加植株光合面积, 从而提高油菜的籽粒产量。因此, 众多研究者围绕角果长度开展了一系列的定位工作, 在油菜19条染色体上均检测到QTL, 对表型变异的贡献率为3.4%~65.5%^[4-9,22,23]。本研究对496份油菜资源的角果长度进行4个环境的考察, 通过全基因组关联分析挖掘到27个显著位点, 分布在A02、A03、A06、A07、A09、A10、C02、C04、C07、C08和C09共11条染色体, 对表型变异的贡献率为2.91%~ 13.89%。多个研究者在A09染色体27.26~28.61 Mb区段检测到主效QTL, 最高可解释超过60%的表型变异^{[5,6,8,22-23]}。本研究中效应最大的位点Bn-A09- p29991443同样落在该区间。此外, 本研究还检测到另外6个与前人结果共定位的位点及20个新位点, 所有位点联合解释44.04%的表型变异。可将携带不同有利等位基因的材料杂交, 利用与上述QTL紧密连锁的分子标记进行辅助选择, 聚合更多有利等位基因, 培育角果长度理想的油菜新品种。

目前油菜中已克隆的角果长度基因较少, Liu等^[24]和Shi等^[25]分别报道在A09染色体克隆了角果长度基因ARF18和BnaA9.CYP78A9。2个基因均落在本研究最显著的位点Bn-A09-p29991443所在区段, 相距28.1 kb, 处于紧密连锁状态。可能由于2个基因效应叠加, 致使该区间的显著性很高。此外, 在对应的C08同源区段检测到微弱的关联信号(GLM, -lg (P) = 3.72), 表明ARF18和BnaA9. CYP78A9位于C08的同源拷贝, 对角果长度的表型贡献很小, 与Liu等^[24]和Shi等^[25]的研究结果一致。Bn-A07-p8572785是用MLM和GLM检测到显著性较高的位点, 但在附近未找到角果长度已知基因。分析其附近基因的注释信息, 找到一个候选基因BnaA07g10150, 该基因位于Bn-A07-p8572785上游339 kb处, 其拟南芥同源基因PIN7编码一个生长素运输基因。生长素调节细胞的伸长生长, ARF18通过生长素途径调节角果长度, 因此BnaA07g10150的功能值得进一步研究。Bn-scaff_20817_1-p60579是GLM模型中显著性较高的位点, 根据基因注释信息在该位点附近发现重要候选基因BnaC04g50960, 其拟南芥同源基因EOD3同时调控角果长度和籽粒大小^[27], 后续研究可以通过转基因或CRISPR敲除验证该基因的功能。

4 结论

用MLM检测到7个位点, 联合解释25.01%的表型变异; 用GLM检测到25个位点, 联合解释41.77%的表型变异。合并共同的位点后得到27个位点, 其中7个位点与前人QTL共定位, 其余20个是新位点。效应最大的位点Bn-A09-p29991443位于A09染色体, 在其附近检测到油菜已克隆的角果长度基因ARF18和BnaA9.CYP78A9。此外, 在其他多个位点附近发现拟南芥已知角果长度基因GID1b、FUL、EOD3、DOF4.4和GA20ox1的同源拷贝。

附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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