UV-B胁迫下Ca 2+对颠茄生理特性与次生代谢产物的调控研究

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卢克欢¹, 刘兴¹, 杨怡¹, 廖志华², 吴能表^,¹^,^*

1西南大学生命科学学院 / 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400715

2西南大学生命科学学院, 重庆 400715

Effect of Exogenous Ca ²⁺ on Physiological Characteristics and Secondary Metabolites accumulation of Atropa belladonna L. Seedlings under UV-B Stress

LU Ke-Huan¹, LIU Xing¹, YANG Yi¹, LIAO Zhi-Hua², WU Neng-Biao^,¹^,^*

1 Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education / School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

2 School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

通讯作者: ^* 通信作者(Corresponding author): 吴能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn, Tel: 023-68252147

第一联系人: E-mail: lukehuan@163.com
收稿日期:2018-01-15接受日期:2018-07-20网络出版日期:2018-08-01

基金资助:

本研究由国家自然科学基金项目.30500041
重庆市科技攻关计划项目.cstc2012gg-yyjs80013

Received:2018-01-15Accepted:2018-07-20Online:2018-08-01

Fund supported:

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China.30500041
the Science Technology Breakthrough Plan Project of Chongqing.cstc2012gg-yyjs80013

摘要
有害中波紫外线(Ultraviolet B, UV-B; 280~320 nm)辐射影响植物的生长和发育, Ca ²⁺是植物生长发育所必须的大量元素之一, 外源Ca ²⁺不但可以提高植物抗胁迫能力, 还对次生代谢具有调控作用。以颠茄(Atropa belladonna L.)实生苗为材料, 在UV-B辐射(10 μW cm ^-2)背景下, 研究不同浓度外源Ca ²⁺、不同处理时间对颠茄生理特性、氮代谢、次生代谢产物含量以及托品烷类生物碱代谢途径中3个关键酶基因表达量的影响。结果表明, 随着UV-B辐射时间的延长(4 ~12 d), 对颠茄的光合作用、氮代谢以及生物碱的积累产生抑制作用, 加剧了膜脂氧化程度; 经外源Ca ²⁺处理, 叶片初始荧光(F_o)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量呈下降趋势, 叶片最大光化学效率(F_v/F_m)、光合色素(总叶绿素、类胡萝卜素)含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均呈上升趋势, 说明Ca ²⁺有利于缓解UV-B辐射的抑制, 加强对UV-B胁迫的抗性; 在Ca ²⁺处理下, 叶片中硝态氮含量显著降低, 游离氨基酸、可溶性蛋白含量和氮代谢关键酶(NR、GS、GDH)的活性显著提高, 叶片中莨菪碱含量和东莨菪碱含量显著提高; qRT-PCR分析显示, 在外源Ca ²⁺的诱导下, 托品烷类生物碱合成途径中3个关键酶基因(PMT、TR I、H6H)表达量均有不同程度上调趋势。本研究结果可为田间种植提供理论参考。
关键词： UV-B胁迫;颠茄;生理特性;氮代谢;托品烷类生物碱

Abstract

Ultraviolet B (UV-B) radiation does harm to plant, for which growth and development. Ca ²⁺is one of the most necessary elements. Exogenous Ca ²⁺ can enhance plant abilities to resist stress and regulate secondary metabolism. In this research, we used Atropa belladonna L. seedlings to investigate the effects of different concentrations of exogenous Ca ²⁺ and different treatment days on the physiological characteristics, nitrogen metabolism, secondary metabolites content and relative genes expression levels of three key enzymes in secondary metabolism under the background of UV-B radiation. The UV-B radiation not only caused inhibitory effect on the Atropa belladonna L. photosynthesis, nitrogen metabolism, alkaloid content, but also increased peroxidation of membrane lipid. The F_o, MDA content gradually decreased, but the F_v/F_m, photosynthetic pigment content, antioxidant enzyme activity gradually increased under Ca ²⁺ treatment, showing that Ca ²⁺ is propitious to relieve inhibitory effect on photosynthesis and enhance resistance to UV-B stress. Moreover, Ca ²⁺ reduced the content of nitrate nitrogen significantly, promoted the contents of free amino acids, soluble proteins, atropine alkaloids, and raised the activities of key enzymes in nitrogen metabolism. Using real-time fluorescence quantitative PCR, we found that exogenous Ca ²⁺ increased the relative gene expression levels of three key enzymes in secondary metabolism in different degrees. This research could provide a theoretical references for plantation in the field.

Keywords：UV-B stress;Atropa belladonna L.;physiological characteristics;nitrogen metabolism;tropane alkaloids

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卢克欢, 刘兴, 杨怡, 廖志华, 吴能表. UV-B胁迫下Ca ²⁺对颠茄生理特性与次生代谢产物的调控研究 [J]. 作物学报, 2018, 44(10): 1527-1538. doi:10.3724/SP.J.1006.2018.01527
LU Ke-Huan, LIU Xing, YANG Yi, LIAO Zhi-Hua, WU Neng-Biao. Effect of Exogenous Ca ²⁺ on Physiological Characteristics and Secondary Metabolites accumulation of Atropa belladonna L. Seedlings under UV-B Stress [J]. Acta Agronomica Sinica, 2018, 44(10): 1527-1538. doi:10.3724/SP.J.1006.2018.01527

颠茄(Atropa belladonna L.), 茄科颠茄属, 多年生草本植物, 全草可入药, 是我国药典规定的托品烷类生物碱(tropane alkaloids, TAs)药源植物^[1]。TAs包括莨菪碱和东莨菪碱, 是一类重要的抗胆碱药物, 提取自茄科植物的次生代谢产物, 具有多方面的药用价值, 广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘、抗晕动病, 也可用于控制帕金森病的僵直和震颤^[2,3]。颠茄中的TAs含量极低, 有着较高的药用价值, 且市场需求量巨大。颠茄作为托品烷类生物碱的重要药源植物, 如何提高其次生代谢产物莨菪碱和东莨菪碱的合成具有十分重要的医药应用价值。

地球的大气臭氧层是抵抗紫外辐射的保护层, 它能够有效吸收强烈的太阳光带来的紫外线辐射, 保护地球上的生物免受伤害。随着工业化发展的进程, 氟氯烷烃和氮氧化物的大量排放, 导致地球臭氧层变薄甚至出现空洞, 到达地表的有害中波紫外线逐渐增强, 对植物的生长极为不利^[4,5]。UV-B不仅作为一种环境胁迫导致植物DNA损伤、细胞分裂停滞、细胞死亡以及生长受抑制, 也能够调控植物形态建成与营养生长, 同时影响包括类黄酮、单宁等多种次生代谢物合成。

钙是植物体内不可或缺的矿物质元素, 同时也是维持植物细胞正常生长代谢的重要离子, 作为偶联细胞外信号的第二信使, 在维持细胞膜结构及细胞膜结合蛋白稳定性、调控多种酶活性方面都具有重要作用^[6,7]。Ca²⁺和钙调素参与胁迫信号的感受、传递、响应与表达等过程, 以增强植物抗逆性^[8]。Ca²⁺在逆境条件下可以保持植物细胞壁、细胞膜的稳定性^[9], 激活或抑制细胞内特定酶的活性, 调节逆境中植物体内的生理生化反应^[10,11]。外施Ca²⁺可以增强盐胁迫下唐古特白刺氮代谢中关键酶的活性, 促进对无机氮源的吸收, 保护氮代谢途径不受盐胁迫的破坏^[12]; 在干旱胁迫下, Ca²⁺可以促进黄瓜幼苗的生长, 提高叶片的叶绿素的含量、净光合速率、蒸腾速率以及水分利用率, 降低膜脂过氧化程度及脯氨酸和可溶性蛋白的积累量, 缓解干旱对黄瓜幼苗的不利影响, 从而增强植株对干旱胁迫的抗性^[13]; 适宜浓度的外源Ca²⁺能明显改善低温胁迫对玉米幼苗生长的抑制作用, 提高玉米幼苗在低温胁迫下的适应能力^[14]。此外, 外源Ca²⁺对植物的次生代谢也起着显著作用, 外源Ca²⁺可以影响水蓼细胞中黄烷醇^[15]、曼陀罗细胞中莨菪碱^[16]、田七细胞中人参皂苷Rb₁^[17]和咖啡细胞中生物碱^[18]等次生代谢物的生物合成与积累。Ca²⁺对于提高植物逆境适应性及次生代谢调控具有重要的生理作用, 其是否参与调控颠茄在UV-B胁迫条件下的逆境适应性和次生代谢产物的合成还有待探究。本试验旨在探究UV-B胁迫条件下, 外源Ca²⁺对颠茄光合及耐逆生理特性、次生代谢产物积累方面的功能, 对于提高颠茄次生代谢产物托品烷类生物碱的合成具有一定指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

颠茄(Atropa belladonna L.)种子购自湖南芝茵农业开发有限责任公司, 并经西南大学生命科学学院吴能表教授鉴定。

挑选颗粒饱满的颠茄种子, 充分浸润后置湿润滤纸上, 待萌发后移栽至盛有混匀介质(泥炭土∶珍珠岩∶蛭石 = 3∶1∶1)的营养盆(12 cm×13 cm)中, 每盆3株, 共300盆, 于25°C温室内培养, 每7 d浇灌一次稀释10倍的MS营养液, 2个月后, 挑选200盆长势一致的颠茄幼苗, 开始试验处理。以颠茄叶片中MDA含量和抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的变化为参考标准, 经预实验确定UV-B胁迫所用的辐照强度为10 μW cm^-2, 参照杨卫星等^[19]研究中的处理浓度并结合预实验结果, 选取5个CaCl₂溶液梯度浓度, 每天12:00—12:40进行相同强度的UV-B照射, 同时以CaCl₂喷施叶片至溶液欲滴, 处理方式见表1。

Table 1
表1
表1颠茄幼苗的处理组合
Table 1Different treatments of Atropa belladonna L.

处理组 Group	CaCl₂浓度 CaCl₂ concentration (mmol L^-1)	UV-B辐射强度 UV-B radiation intensity (μW cm^-2)	处理时间 Treatment time (d)
T0	0	0	4, 8, 12
T1	0	10	4, 8, 12
T2	2	10	4, 8, 12
T3	4	10	4, 8, 12
T4	6	10	4, 8, 12
T5	8	10	4, 8, 12

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分别在第4、第8和第12天采集颠茄叶片, 存放于-80°C冰箱, 用于各项指标的测定。另采集颠茄根、叶组织材料, 一部分冻存于液氮中, 用于基因表达量的测定; 另一部分于70°C烘箱中烘干, 用于生物碱含量的测定。设置每处理组3次重复。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素荧光动力学参数F_o和F_v/F_m的测定

将颠茄植株暗处理2 h, 选择长势一致且较为平展的叶片(避开主叶脉)用叶绿素荧光仪PAM-2100 (WALZ, 德国)测定初始荧光(F_o)和最大光化学效率(F_v/F_m), 取3次数据的平均值。

1.2.2 光合色素与MDA含量的测定参照张宪政^[20]的方法, 称取0.2 g新鲜的颠茄叶片, 去中脉, 剪成细丝状, 置黑暗条件下浸泡于20 mL丙酮-乙醇混合液(1∶1) 72 h至白色。取上清液3 mL于石英比色皿中, 测吸光值A₆₆₃、A₆₄₅和A₄₇₀, 计算叶绿素含量和类胡萝卜素含量。参照Velikova等^[21]的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法测定MDA含量。

1.2.3 抗氧化酶活性的测定参照Giannopolitis和Ries^[22]的方法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 通过观察NBT的光还原抑制程度, 将能够抑制反应酶量的50%定义为1个SOD活力单位(U); 采用愈创木酚法^[23]测定过氧化物酶(peroxide, POD)活性, 将每分钟A₄₇₀值升高0.01定义为1个酶活力单位(U); 参照高俊凤^[24]的方法测定过氧化氢酶(catalase, CAT)活性, 将每分钟A₂₄₀下降0.1定为一个酶活力单位(U)。

1.2.4 硝态氮、游离氨基酸和可溶性蛋白含量的测定参照高俊凤^[24]的方法测定硝态氮含量。NO₃^-与水杨酸生成硝基水杨酸, 在碱性条件下(pH > 12)呈黄色, 检测A₄₁₀值反映硝态氮的含量; 参照李合生^[25]的茚三酮溶液显色法测定游离氨基酸含量; 参照高俊凤^[24]的考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量。

1.2.5 GS、NR和GDH活性的测定采用汤绍虎等^[26]的方法测定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性。在ATP和Mg²⁺存在下, GS催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺, 谷氨酰胺转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸, 进而在酸性条件下与铁形成红色络合物, 在540 nm处有最大吸收峰, 即以γ-谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示GS酶活性; 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒分别测定硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性与谷氨酸脱氢酶(glutamic dehydrogenation enzyme, GDH)活性。

1.2.6 莨菪碱与东莨菪碱的提取与测定参照Zárate等^[27]的方法, 略有改动, 提取颠茄叶片中莨菪碱和东莨菪碱; 用HPLC测定其含量, 色谱仪为日本岛津(Shimadzu) LC-60A高效液相色谱仪(泵: LC-20AD, 控制器: SPD-20A, 柱温箱: CTO-10AS vp); 色谱柱为Ultimate XB-C18液相色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250.0 mm); 流动相为甲醇∶醋酸缓冲液(20 mmol L^-1醋酸铵, 0.1%甲酸, pH 4.0) = 1∶4; 检测波长226 nm; 流速1.0 mL min^-1; 柱温40°C; 进样量10 μL。

1.2.7 总RNA的提取及cDNA的合成按照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒使用说明提取总RNA。按照TIANGEN FastQuant RT Kit (with gDNase)说明书操作步骤进行颠茄根、叶RNA的反转录, gDNA去除反应体系10 μL, 分别为5×gDNA buffer 2 μL, 17.5 ng μL^-1 Total RNA 8 μL, 反应条件为42°C孵育3 min, 冰浴暂存; 反转录反应体系10 μL, 分别为10×Fast RT buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH₂O 5 μL; 将10 μL反转录反应体系加入到去基因组DNA污染的Total RNA, 反应条件为42°C 15 min, 95°C 3 min, 冰浴5 min, 获得cDNA。

1.2.8 引物设计与qRT-PCR PMT、H6H、TR I和PGK基因引物根据NCBI上公布的序列设计及参照强玮等^[28,29]的引物序列, 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表2)。采用Promega GoTaq qPCR Master Mix试剂盒使用说明检测, 反应体系20 μL, 分别为GoTaq qPCR Master Mix 10.0 μL、各基因上游引物 (10 μmol L^-1) 0.4 μL、各基因下游引物(10 μmol L^-1) 0.4 μL、cDNA模板2.0 μL、ddH₂O 7.2 μL。反应条件为Stage 1 预变性, 95°C 10 min; Stage 2扩增循环, 95°C 15 s, 60°C 1 min, 共40循环; Stage 3溶解曲线, 95°C 5 s, 60°C 15 s, 95°C 15 s。依制造商的操作说明在Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪(Bio-Rad, USA)上完成, 以PGK为内参基因, 实验数据采用Pfaffl Method法计算得出结果。

Table 2
表2
表2荧光定量PCR所需引物
Table 2Primer pairs for quantitative PCR

基因 Gene	登录号 Accession number	上游引物 Forward primer (5'-3')	下游引物 Reverse primer (5'-3')	退火温度 Annealing temperature (°C)
PGK	JX154676	TCGCTCTTGGAGAAGGTTGAC	CTTGTCCGCAATCACTACATCAG	59.5
PMT	AB018570	CCTACTTACCCTACTGGTGTTATC	GCGAAAGATGGCAAAATAAAAGC	56.4
H6H	JN542537	TTCCACTTGAGCAGAAAGCAAAGC	CCTCATGGTCAACTTCCTCACTTCC	56.4
TR I	JX155757	TTCTTTGCTTCCCTGCTGCTTC	CAGGCCAACCTTAGTATCACACAG	61.4

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1.2.9 数据分析采用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0对所得数据进行统计与分析, 均以$\bar{x}$±s表示, 组间比较采用方差检验, 差异显著性水平为0.05; 采用制图软件OriginPro 8.0制图。

2 结果与分析

2.1 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄叶片F_o和F_v/F_m的影响

叶绿素荧光参数可以较为灵敏地反映光合作用的变化情况, 被称为研究植物光合功能的快速、无损伤探针^[30]。初始荧光F_o表示PS II反应中心处于完全开放时的荧光产量。在UV-B胁迫下, 在各处理时间段内, T1组比T0组的F_o显著升高, 并随着处理时间的增加逐渐增大; 喷施不同浓度Ca²⁺处理后, 不同处理组较T1有不同程度的回落现象, 且当处理时间为12 d、浓度为6 mmol L^-1时缓解效果最为显著(图1-A)。

图1

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图1UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄初始荧光(A)和最大光化学效率(B)的影响

不同小写字母表示相同处理时间不同浓度Ca²⁺处理间差异显著(P<0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0 mmol L^-1、2 mmol L^-1、4 mmol L^-1、6 mmol L^-1和8 mmol L^-1。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。
Fig. 1Effects of Ca²⁺ on F_o (A) and F_v/F_m (B) of Atropa belladonna L. under UV-B stress

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca²⁺concentration in the same treating days at the 0.05 level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

F_v/F_m代表PS II的最大光化学效率, 是较为常用的叶绿素荧光指标之一, 此指标在胁迫条件下通常会降低^[31], 同时也可以表明PS II遭受到破坏^[32]。在UV-B胁迫下, T1处理组的F_v/F_m相对T0组显著降低, 随着处理时间的延长, T1处理组的F_v/F_m呈下降趋势, 经不同浓度Ca²⁺处理后, 在各时间段均呈现出先升高后降低趋势, 在处理第12天中, 当Ca²⁺浓度为4 mmol L^-1时, 与T1相比大幅提高, 缓解效果最显著(图1-B)。

2.2 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄叶片中光合色素含量的影响

在植物叶片中, 叶绿素含量与类胡萝卜素含量是表征植物体光合能力的重要指标。由图2可知, T1组随着UV-B处理时间的延长, 颠茄叶片中的叶绿素含量与类胡萝卜素含量逐渐降低; 在各处理时间段内, T1组的叶绿素含量和类胡萝卜素含量比T0对照组显著降低, 经过喷施不同浓度Ca²⁺溶液处理后, 二者均有不同程度的上升趋势。当Ca²⁺溶液浓度为6 mmol L^-1时效果最显著, 如在处理12 d时, T4组相比T1组, 总叶绿素含量与类胡萝卜素含量分别提高了64.8%和56.1%。说明适宜浓度的外源Ca²⁺有助于促进叶绿素和类胡萝卜素的合成, 有效缓解UV-B辐射对光合膜的破坏, 从而有利于颠茄在UV-B迫下增强其光合能力。

图2

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图2UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄叶片中总叶绿素含量(A)与类胡萝卜素含量(B)的影响

不同小写字母表示相同处理时间不同浓度Ca²⁺处理间差异显著(P < 0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0、2、4、6和8 mmol L^-1。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。
Fig. 2Effects of Ca²⁺ on the content of total chlorophyll (A) and carotenoid (B) of Atropa belladonna L. leaves under UV-B stress

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca²⁺concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

2.3 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄抗氧化酶活性和MDA含量的影响

植物体中抗氧化酶活性的变化在一定程度上可反映出植物体抗逆性的强弱^[33]。对于T1处理组, SOD和POD活性的变化基本一致, 均随UV-B处理时间的增加呈先升后降趋势(图3-A, B)。CAT的活性在T1处理下, 随处理时间的延长持续下降(图3-C)。UV-B处理的第8天和第12天, T1组中SOD、POD和CAT三种酶的活性比T0对照组均显著降低, 说明UV-B辐射对颠茄的抗氧化系统产生了胁迫效应, 且随着处理时间的增加其胁迫效应愈加严重。在不同浓度Ca²⁺处理下, 3种抗氧化酶的活性均有不同程度提高, 在各处理时间范围内, 当Ca²⁺浓度为4 mmol L^-1和6 mmol L^-1时缓解效果较为显著。

图3

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图3UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄抗氧化酶活性(A, B, C)、丙二醛含量(D)的影响

不同小写字母表示相同处理时间不同浓度Ca²⁺处理间差异显著(P < 0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0、2、4、6和8。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。
Fig. 3Effects of Ca²⁺ on the activities of antioxidant enzymes (A, B, C) and the contents of MDA (D) of Atropa belladonna L. under UV-B stress

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments of Ca²⁺concentration in the same treating days at the 0.05 probability level. T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.

MDA是膜脂过氧化的产物, 可以作为衡量植物膜脂过氧化的程度。在UV-B辐射处理下, MDA含量比T0对照组大幅升高, 且随着UV-B处理时间的延长呈逐渐升高趋势。在UV-B辐射背景下, 经不同浓度外源Ca²⁺处理后发现, 在3个不同的处理时间段内, MDA含量均显著降低。表明外源Ca²⁺可缓解UV-B辐射对颠茄膜系统的损害程度。其中, 在处理12 d, T4组MDA含量比T1组降低了52.2%, 缓解效果最显著(图3-D)。

2.4 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄氮代谢的影响

硝态氮是能够被植物根部直接吸收的氮源, 植物吸收的无机氮源经一系列的还原与同化作用后形成游离氨基酸、可溶性蛋白等有机含氮化合物^[34], 它们的含量是氮代谢的重要指标, 直接反映氮代谢的基本进程。由表3可知, 随着UV-B处理时间的延长, T1处理组硝态氮含量逐渐增加, 经喷施Ca²⁺溶液后, 各处理组的硝态氮含量随着处理时间的增加呈先降低后升高的趋势, 同时在相同处理时间下, 其含量也随着Ca²⁺浓度的升高而降低。在UV-B辐射下, T1组游离氨基酸含量和可溶性蛋白含量比T0组显著降低, 且随着UV-B处理时间的延长, 游离氨基酸含量逐渐降低, 可溶性蛋白含量在处理第4天有所升高, 随后开始持续降低, 经不同浓度Ca²⁺处理后, 对于相同的处理时间, 两者含量相对T1组升高显著。表明UV-B辐射有利于颠茄叶片中硝态氮的积累, 但不利于对硝态氮的利用, 从而使游离氨基酸和可溶性蛋白等含氮化合物含量降低, 不利于氮代谢的进行。在Ca²⁺处理下, 加速了硝态氮的同化, 使游离氨基酸和可溶性蛋白含量显著升高, 表明外源Ca²⁺可以有效缓解UV-B胁迫对氮代谢进程的抑制, 有利于氮代谢的进行。

Table 3
表3
表3UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄硝态氮、游离氨基酸和可溶性蛋白含量的影响
Table 3Effects of Ca²⁺ on nitrate nitrogen, free amino acids, and soluble proteins content of Atropa belladonna L. under UV-B stress

指标 Indicator	处理组 Group	处理时间 Treatment time
指标 Indicator	处理组 Group	4 d	8 d	12 d
硝态氮 Nitrate nitrogen (μg g^-1FW)	T0	539.543±19.299 b	545.976±29.480 a	526.677±29.480 a
	T1	693.935±38.598 d	874.059±58.959 c	1112.080±40.174 d
	T2	610.306±40.174 c	803.296±29.480 c	944.822±57.897 c
	T3	462.347±19.299 a	726.100±48.568 b	874.059±62.038 c
	T4	507.378±48.568 ab	597.440±38.598 a	783.997±29.480 b
	T5	494.512±29.480 ab	681.069±44.569 b	861.193±48.568 bc
游离氨基酸 Free amino acids (mg g^-1FW)	T0	352.269±32.459 e	329.930±15.145 d	332.723±14.323 d
	T1	225.763±38.646 b	177.929±25.124 a	134.465±19.857 a
	T2	287.559±33.889 cd	185.213±25.860 a	161.661±18.992 ab
	T3	313.176±25.550 de	255.872±30.828 bc	241.789±24.322 c
	T4	251.137±33.889 bc	286.224±22.980 cd	264.856±17.015 c
	T5	166.153±29.940 a	221.635±35.763 ab	194.076±16.096 b
指标 Indicator	处理组 Group	处理时间 Treatment time
指标 Indicator	处理组 Group	4 d	8 d	12 d
可溶性蛋白 Soluble proteins (mg g^-1FW)	T0	5.879±0.309 a	5.681±0.364 ab	5.570±0.398 c
	T1	6.458±0.401 a	4.953±0.548 a	3.725±0.430 a
	T2	7.901±0.653 bc	5.736±0.432 ab	5.264±0.649 bc
	T3	9.087±0.399 c	7.415±0.572 c	6.953±0.391 d
	T4	6.859±0.491 ab	7.496±0.749 c	4.358±1.058 ab
	T5	5.861±1.526 a	6.535±1.007 bc	3.887±0.456 a

Figures followed by different letters in each column are significantly different (P < 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2 , 4 , 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.
表中同一列数据上标以不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0、2、4、6和8 mmol L^-1。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。

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在氮代谢途径中, 硝酸还原酶(NR)是催化硝态氮转化为NH₄⁺-N的酶, 而NH₄⁺-N与α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶(GDH)的催化下进一步形成Glu; 同时, 谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代谢过程中的另一个关键酶, 能催化NH₄⁺-N和Glu合成谷氨酰胺, 对于高等植物同化NH₄⁺-N具有重要的作用^[35]。由表4可知, UV-B辐射处理使叶片中NR、GS和GDH酶活性显著降低。T1处理组中, 在UV-B胁迫下NR和GS活性随着处理时间的延长逐渐降低, 而GDH则是先增大后减小的趋势。经过不同浓度的Ca²⁺处理后, 相同处理时间内, 3个关键酶的活性均有不同程度的升高趋势。对于NR和GS, 当Ca²⁺浓度为6 mmol L^-1时效果最显著, 对于GDH则是4 mmol L^-1效果最佳。以上结果表明, 短期UV-B辐射可以激活GDH活性的增大, 但是总体来看, UV-B辐射抑制了NR、GS和GDH的活性, 不利于颠茄氮代谢的进行。在适宜浓度外源Ca²⁺处理下, 可显著提高3种关键酶的活性, 缓解UV-B胁迫对颠茄氮代谢关键酶活性的抑制作用, 从而加速颠茄对无机氮源的同化作用。

Table 4
表4
表4UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶活性的影响
Table 4Effects of Ca²⁺ on NR, GS, and GDH activities of Atropa belladonna L. under UV-B stress

指标 Indicator	处理组 Group	处理时间 Treatment time
指标 Indicator	处理组 Group	4 d	8 d	12 d
硝酸还原酶 NR (U g^-1 FW h^-1)	T0	1.290±0.048 c	1.282±0.117 c	1.333±0.052 d
	T1	1.037±0.022 a	0.813±0.053 a	0.557±0.039 a
	T2	1.035±0.061 a	0.939±0.108 a	0.664±0.040 b
	T3	1.121±0.009 b	1.083±0.030 b	0.724±0.047 b
	T4	1.290±0.018 c	1.213±0.035 bc	0.902±0.043 c
	T5	1.135±0.013 b	1.121±0.048 b	0.753±0.080 b
谷氨酰胺合成酶 GS (OD₅₄₀ mg^-1 FW h^-1)	T0	8.349±0.197 c	7.885±0.259 d	7.696±0.670 d
	T1	6.555±0.235 a	4.989±0.767 a	3.952±0.323 a
	T2	6.812±0.297 a	5.666±0.155 b	4.323±0.214 ab
	T3	7.494±0.285 b	6.442±0.138 c	4.883±0.226 bc
	T4	8.037±0.231 c	7.336±0.189 d	5.454±0.201 c
	T5	6.870±0.268 a	6.104±0.105 bc	4.592±0.219 ab
谷氨酸脱氢酶 GDH (U mg^-1 FW min^-1)	T0	5.659±0.402 a	5.756±0.658 b	4.968±0.482 b
	T1	6.109±0.589 ab	4.244±0.579 a	3.344±0.486 a
	T2	6.367±0.841 ab	5.338±0.486 ab	4.887±0.402 b
	T3	7.138±0.880 b	5.916±0.990 b	6.881±0.620 c
	T4	6.045±0.780 ab	8.039±0.678 c	6.431±0.403 c
	T5	5.016±0.696 a	7.395±0.486 c	5.338±0.589 b

Figures followed by different letters in each column are significantly different (P < 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.
表中同一列数据上标以不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0、2、4、6和8 mmol L^-1。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。

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2.5 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄叶片中托品烷类生物碱含量的影响

莨菪碱和东莨菪碱是托品烷类生物碱最主要的两种生物碱, 也是药用价值最高的两种成分。由表5可知, 在UV-B辐射处理第8天和第12天时, 颠茄叶片中莨菪碱和东莨菪碱含量相比T0对照组均显著降低, T1处理组中, 随着UV-B处理时间的增加, 莨菪碱的含量先升高后降低, 东莨菪碱含量则是持续降低, 表明短期UV-B辐射可以促进莨菪碱的积累, 但中长期辐射不利于托品烷类生物碱的积累。外施不同浓度Ca²⁺处理后, 在相同处理时间下, 莨菪碱与东莨菪碱的含量均比T1组有所提高, 随着Ca²⁺浓度的升高呈先升后降的趋势。处理12 d时, T4组的莨菪碱与东莨菪碱含量较T1组显著提高, 分别提高了15.7%和31.9%。以上结果表明, 短期UV-B辐射可以促进莨菪碱的积累, 中长期辐射不利于托品烷类生物碱的积累, 总体而言, UV-B辐射不利于颠茄对莨菪碱与东莨菪碱的积累, 而适宜浓度的外源Ca²⁺可以有效缓解UV-B辐射对TAs积累的抑制。

Table 5
表5
表5UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄叶片莨菪碱和东莨菪碱含量的影响
Table 5Effects of Ca²⁺ on the contents of hyoscyamine and scopolamine of Atropa belladonna L. leaves under UV-B stress

指标 Indicator	处理组 Group	处理时间 Treatment time
指标 Indicator	处理组 Group	4 d	8 d	12 d
莨菪碱 Hyoscyamine (μg g^-1 DW)	T0	1058.072±37.583 a	1083.528±31.056 d	1052.901±35.189 d
	T1	1100.436±16.571 ab	915.777±20.900 a	717.403±22.549 a
	T2	1108.081±25.848 ab	923.651±17.580 ab	731.083±22.291 ab
	T3	1160.567±33.114 bc	961.774±16.661 b	769.983±19.220 b
	T4	1194.663±54.229 c	1005.077±26.956 c	830.383±16.479 c
	T5	1160.712±22.361 bc	936.849±19.690 ab	764.317±27.984 b
东莨菪碱 Scopolamine (μg g^-1 DW)	T0	705.793±9.434 c	712.340±4.758 c	706.746±6.777 e
	T1	608.653±18.251 a	436.066±42.860 a	322.495±13.838 a
	T2	639.789±29.007 ab	443.938±22.239 a	342.123±13.148 ab
	T3	703.185±23.661 c	491.396±19.175 ab	363.689±24.281 bc
	T4	691.481±28.849 c	533.542±44.175 b	425.387±36.488 d
	T5	665.574±21.782 bc	482.438±38.057 ab	384.401±18.008 c

Figures followed by different letters in each column are significantly different (P < 0.05). T1 to T5 indicate different treatments of Ca²⁺ concentration (0, 2, 4, 6, and 8 mmol L^-1) under UV-B stress. T0 indicates untreated blank control groups.
表中同一列数据上标以不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。T1至T5分别代表UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺处理组, 分别为0、2、4、6和8 mmol L^-1。T0表示未进行任何处理, 即空白对照组。

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2.6 UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄根、叶中PMT、TR I、H6H相对表达量的影响

腐胺N-甲基转移酶(putrescine N-methyltransferase, PMT)、托品酮还原酶Ι (tropinone reductase Ι, TR Ι)、莨菪碱-6-β-羟化酶(hyoscyamine-6-β-hydroxylase, H6H)是托品烷类生物碱合成途径中的3个关键酶, 其相应编码基因的表达量直接决定合成途径的中间产物流向以及生物碱的产量^[36]。以PGK为内参基因, 采用qRT-PCR检测了UV-B胁迫下处理12 d中T0组、T1组和T4组的颠茄根、叶中PMT、TR I和H6H基因相对表达量。PMT和H6H在根中表达量较高, TR I的表达量相对较低, 由T1组和T0组相比可知, 在UV-B处理12 d后, PMT和H6H的表达量均显著降低, 而TR I则有所升高, 但不显著; 由T4组和T1组对比可知, 同样在UV-B处理下, 经6 mmol L^-1外源Ca²⁺处理后, 显著促进了PMT、TR I和H6H的表达(图4-A)。PMT、H6H在叶中几乎不表达, 而TR I明显表达, 且表达水平较高; 在UV-B处理12 d后, TR I的表达量较T0组有所升高但不显著, 经6 mmol L^-1外源Ca²⁺处理后, 显著促进了TR I的表达(图4-B)。

图4

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图4UV-B胁迫下不同浓度Ca²⁺对颠茄根(A)、叶(B)中PMT、H6H、TR I相对基因表达量的影响

标以不同小写字母的柱值在同一个基因不同处理组间差异显著(P < 0.05)。T0组表示未进行任何处理的空白对照, T1组表示UV-B辐射处理12 d, T4组表示UV-B辐射背景下外施6 mmol L^-1 Ca²⁺处理12 d。
Fig. 4Effects of Ca²⁺ on relative expression level of PMT, H6H, TR I gene in roots (A) and leaves (B) of the Atropa belladonna L. under UV-B stress

Bars superscripted by different letters are significantly different among different treatments in the same gene at the 0.05 probability level. T0 group indicates untreated blank control groups; T1 group indicates UV-B radiation treatment for 12 days; T4 group indicates exogenous 6 mmol L^-1Ca²⁺ treatment for 12 days under UV-B stress.

3 讨论

光合作用的强弱对植物的生长、产量以及抗逆性都具有十分重要的影响^[37], 植物光合作用受到伤害的最初部位是与PS II紧密联系的, 而逆境胁迫往往会导致叶绿体光合机构的破坏, 降低PS II原初光能转换效率、抑制PS II潜在活性, 导致PS II功能下降^[38]。本试验结果显示, UV-B辐射下, 相比T0对照组, F_o显著升高, F_v/F_m显著降低, 且随着UV-B辐射时间的延长, 初始荧光F_o逐渐增大, 最大光化学效率F_v/F_m逐渐减小, 而在适宜浓度外源Ca²⁺处理下, 相比T1组, F_o显著降低, F_v/F_m明显增大。表明颠茄在UV-B辐射条件下, 叶片中PS II反应中心受到伤害, 导致其原初能量转换发生紊乱, 其叶绿素分子在吸收光能后, 激发态分子多以发出荧光的形式释放能量, 而参与到光合作用的能量有所减少, 不利于光合作用的进行。在此基础上, Ca²⁺可以有效地抵御UV-B对PS II反应中心的伤害, 缓解了叶片产生的光抑制, 可提高PS II的光能转换效率, 使颠茄在UV-B胁迫下依然保持较高的光化学效率。这与秦舒浩等^[39]提出的外源Ca²⁺有利于缓解高温强光对西葫芦幼苗叶片的光抑制和温光破坏现象, 有效保护光合机构的观点相一致。对光合作用而言, 叶绿素与类胡萝卜素是参与光能吸收、传递和转化的重要色素, 因此叶绿素含量会直接影响植物的生长。叶绿素含量的高低直接影响着光合速率和光合产物的形成, 类胡萝卜素除吸收传递光能外, 还可起保护作用^[40]。试验结果显示, UV-B胁迫下, 颠茄叶片中总叶绿素与类胡萝卜素含量都显著下降, 经不同浓度Ca²⁺处理下其含量有所上升。表明UV-B辐射加速了叶绿素和类胡萝卜素的分解, 不利于颠茄进行正常的光合作用。而适当浓度的外源Ca²⁺有助于缓解UV-B辐射对叶绿体膜的破坏, 维持较高的光合色素含量, 保护叶绿体膜结构的完整性。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)是植物体内保护酶系统的主要成员, 是防御活性氧及其他自由基对细胞膜系统伤害的最重要的酶^[41]。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一, 其量的高低是膜脂过氧化强弱和质膜破坏程度的重要指标^[42]。本试验中, SOD和POD活性在UV-B胁迫下先升高后降低, CAT活性则是持续降低, 表明颠茄在UV-B照射初期可以通过自身调节SOD和POD活性的升高抵御逆境胁迫, 但随着UV-B照射时间的推移, SOD、POD和CAT的活性均有所降低, 表明长时间UV-B辐射加剧了颠茄细胞的氧化程度, 不利于正常的生理活动。在外源Ca²⁺处理下, 相比同期处理下的T1组, 3种抗氧化酶的活性呈现出显著升高趋势。同时, 在UV-B胁迫下, 相比T0对照组, 膜脂过氧化主要产物MDA含量大幅上升, Ca²⁺处理后相比同期处理的T1组显著降低, 且当Ca²⁺浓度为6 mmol L^-1时最为显著。以上结果表明, UV-B辐射会导致颠茄细胞膜脂过氧化程度增强, 膜透性增加, 加剧了氧化损伤; SOD、POD和CAT活性的显著降低, 打破了在其共同作用下维持细胞内活性氧的代谢平衡, 无法及时清除体内的超氧自由基和H₂O₂等有害物质。而外源Ca²⁺则有助于刺激颠茄细胞产生更多的抗氧化酶或者提高抗氧化酶的活性, 从而降低活性氧水平, 抑制膜脂过氧化, 有利于提高颠茄在逆境条件下的抗性。这与邢建永等^[43]提出的Ca²⁺能够提高半夏类原球茎的抗氧化性, 提高其抗逆性的观点相一致。

植物的次生代谢是以初生代谢为基础, 初生代谢中氮代谢尤为重要。硝态氮是可被植物根系直接吸收的无机氮源, 经氮代谢途径中相关酶的催化作用合成植物自身需要的含氮有机物, 如氨基酸和蛋白质等。本试验结果表明, 在UV-B胁迫下, 随着处理时间的延长, 颠茄叶片组织内的硝态氮含量逐渐增加, 游离氨基酸与可溶性蛋白含量逐渐降低。在外源Ca²⁺处理下, 游离氨基酸和可溶性蛋白含量显著提高, 有效缓解了UV-B辐射对含氮有机物合成的抑制, 适宜浓度的Ca²⁺有助于提高UV-B胁迫下氮代谢关键酶的活性, 加速颠茄对硝态氮的同化, 从而提高自身含氮有机物的积累, 尤其是促进氨基酸的合成与转化。这与高彦博^[12]提出的外源Ca²⁺可以有效提高唐古特白刺氮代谢中关键酶的活性促进对硝态氮的利用的观点相一致。同时, 通过促进氮代谢的进程, 有利于鸟氨酸和精氨酸的合成, 从而有利于生物碱的前体物质腐胺的积累。

莨菪碱和东莨菪碱是颠茄次生代谢的产物, 主要在根中合成, 存贮积累在地上部分的幼嫩组织中^[28]。钙盐对半夏类原球茎总生物碱的合成具有显著影响, 适宜浓度的Ca²⁺提高半夏类原球茎有用次生代谢产物的量^[19,43]。UV-B辐射可以诱导生物碱含量的增加, 温泉等^[44]研究发现随着UV-B辐射时间的增加, 黄连中小檗碱含量逐渐增加。本试验结果显示, 在UV-B辐射处理下, 随着辐射时间的增加, 颠茄叶片中东莨菪碱含量逐渐降低, 莨菪碱含量则是先增后降, 不利于总生物碱的积累。随着Ca²⁺浓度的增加, 相同处理时间下莨菪碱与东莨菪碱的含量先增后降, 当Ca²⁺浓度为4 mmol L^-1和6 mmol L^-1时效果较为显著。以PGK为内参基因, 经qRT-PCR检测发现, PMT、TR Ι和H6H在根中均有表达, 在叶片中只有TR Ι表达, PMT和H6H几乎不表达。这与强玮等^[28,29]提出的PMT、CYP80F1、H6H均只在颠茄根中大量表达, TR I在成熟叶片中强烈表达, 其次在花苞和根中少量表达的观点相似。除此之外, 结果显示, UV-B辐射抑制了PMT和H6H的表达水平, 却可以促进TR Ι的表达, 但不显著; 而外源Ca²⁺可以有效激活PMT、TR Ι和H6H的表达, 有助于缓解UV-B辐射对PMT和H6H表达的抑制作用。表明Ca²⁺通过激活PMT的高效表达, 促进腐胺从多胺代谢转向TAs合成, TR I的高表达有利于托品酮生成托品的支流方向, 进而提高莨菪碱和东莨菪碱的产量。

4 结论

UV-B辐射不利于颠茄的正常生长与次生代谢物的积累, 外源Ca²⁺可有效缓解UV-B辐射对颠茄的胁迫效应, 有利于颠茄光合作用, 促进无机氮源的同化, 加速无机氮源转化为自身所需的含氮化合物, 进而有利于颠茄次生代谢途径中前体物质合成。虽然UV-B辐射可促进TR I基因的表达, 但不利于PMT和H6H基因的正常表达, 降低了莨菪碱和东莨菪碱的合成效率, 而适宜浓度的外源Ca²⁺可有效解除UV-B对颠茄次生代谢的抑制效应。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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Regulation of cellular Ca2+ is an essential cell, function that is accomplished by a complex of processes collectively called the Ca2+ homeostat. This review discusses some of the progress that has been made in identifying the components of the Ca2+ homeostat in plants-pumps, secondary transporters, and ion channels-as well as progress in characterizing the operation of the homeostat in Living cells during signal transduction, A current hypothesis for understanding how the Ca2+ homeostat influences cell function suggests that the spatial and temporal properties of changes in Ca2+ levels induced by stimuli are important, An examination of the Ca2+ changes induced by a number of stimuli in plants shows the Ca2+ homeostat to be capable of generating changes in Ca2+ that have characteristic spatial and temporal properties. Thus, the timing and location of Ca2+ changes in the cell, together with changes in the activity of other cellular mediators, can explain the variety and specificity of cellular responses that are triggered by Ca2+.

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唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)是白刺科(Nitrariaceae)白刺属(Nitraria)小灌木,具有很强的耐盐、抗旱、耐瘠薄和防风固沙能力,生态作用明显,是荒漠和半荒漠地区重要的建群植物,也是改良盐碱土的优良植物材料。本研究选取唐古特白刺为试验材料,针对外源Ca~(2+)对不同浓度盐胁迫下白刺的气体交换参数、叶绿素含量和叶绿素荧光参数的影响进行研究,探究盐胁迫对白刺氮代谢途径的干扰作用及外源Ca~(2+)的调控效应。得到以下结论:(1)随着NaCl浓度的升高,叶片相对含水量变化呈波动性趋势,叶绿素含量先升后降,NaCl浓度超过300 mmol·L~(-1)时,叶绿素含量急剧下降。加入外源Ca~(2+)后,在NaCl浓度不超过300 mmol·L~(-1)的处理组中,唐古特白刺叶片相对含水量和叶绿素含量较对照相比升高,且Ca~(2+)浓度≤15 mmol·L~(-1)时效果较好,表明外施一定浓度Ca~(2+)可以缓解因盐胁迫引起的伤害,保持叶片内水分含量,并促进叶绿素合成,使白刺维持较高的生活力。Ca~(2+)(15 mmol·L~(-1))对叶片叶绿素作用不明显,甚至表现为抑制作用。(2)盐胁迫影响唐古特白刺气体交换参数,NaCl浓度超过200 mmol·L~(-1)时,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)呈下降趋势,胞间CO_2浓度(Ci)显著上升。随着NaCl浓度的升高,PSII最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSII)和光化学猝灭系数(q P)先升后降,非光化学猝灭系数(q N)先降后升,当NaCl浓度超过300 mmol·L~(-1)后,对叶绿素荧光参数影响明显,各指标均显著变化。说明当盐胁迫浓度超过白刺可承受范围后,会减少白刺通过气孔与外界的交换,并降低植株对CO_2的利用率,减少PSII电子传递份额,使大量光能转化为热能,降低光合速率,影响PSII光化学效率,破坏光合碳循环途径。(3)添加外源Ca~(2+)能有效提高Pn、Gs和Tr,并使Ci显著降低,以Ca~(2+)浓度为15 mmol·L~(-1)时,处理效果最佳,说明一定浓度Ca~(2+)促进气孔开放,提高白刺与外界的交换值,增加光合效率。高浓度Ca~(2+)(15 mmol·L~(-1))对唐古特白刺气体交换参数表现出不同程度的抑制作用。当Ca~(2+)浓度为15 mmol·L~(-1)时,各NaCl浓度下Fv/Fm、ΦPSII和q P显著高于对照,q N则降低,超过15 mmol·L~(-1)的Ca~(2+)的作用效果则明显减弱。说明适宜浓度的外源Ca~(2+)能够有效增加PSII电子传递份额,增加植物热耗散能力,提升光化学效率,减缓由盐胁迫造成的光抑制。(4)随着NaCl浓度的升高,唐古特白刺氮代谢途径受到影响,硝态氮含量(NO3--N)、硝酸还原酶(NR)活性和谷氨酰胺合成酶(GS)活性均逐渐降低,铵态氮含量(NH_4~+-N)和可溶性蛋白含量升高。说明高浓度盐胁迫减少白刺对硝态氮的吸收和利用,降低NR和GS对氮代谢的调控作用,使植物体内自由铵含量升高,对植物产生毒害作用。随着外源Ca~(2+)浓度升高,NO3--N、NR活性和GS活性均先升后降,NH_4~+-N先降后升。说明外源Ca~(2+)能有效提高氮代谢中关键酶的活性,促进对硝态氮的吸收和利用,催化铵态氮合成氨基酸和蛋白质,减少植株体内自由铵含量,保护氮代谢途径不受损害。

Gao Y

. Effects of Exogenous Ca ²+ on Photosynthesis and Nitrogen Metabolism of Nitraria tangutorum Bobr. under Salt Stress
MS Thesis of Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, China, 2016 ( in Chinese with English abstract)

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陈露露, 王秀峰, 刘美, 杨凤娟, 史庆华, 魏珉, 李清明 . 外源钙对干旱胁迫下黄瓜幼苗叶片膜脂过氧化和光合特性的影响
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赵娟, 王芳, 李永生, 姚海梅, 张同祯, 方永丰, 王汉宁 . 钙对低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗生长的影响
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【目的】研究外源钙对低温胁迫下玉米幼苗根系保护酶活性、玉米种子萌发及幼苗生长的影响,以期为提高玉米苗期抗寒性及玉米抗寒育种提供理论依据.【方法】以‘郑单958’玉米种子为试验材料,用不同浓度（0、5、10、15、20mmol/L）的CaCl2溶液处理低温胁迫下的玉米种子,研究低温胁迫下CaCl2对玉米种子萌发和幼苗生长的影响.【结果】低温明显抑制了玉米种子的萌发,影响了玉米苗高和根长的增加,抑制了脯氨酸和可溶性糖含量的累积,提高了丙二醛（MDA）含量.一定浓度的外源钙（5～15mmol/L）可提高低温胁迫下玉米种子的发芽率,提高玉米幼苗根系脯氨酸含量的积累,抑制丙二醛含量的增加.【结论】不同浓度钙对低温胁迫的缓解程度不同,适宜浓度的外源钙（5～15mmol/L）能明显改善低温胁迫对玉米幼苗生长的抑制作用,提高玉米幼苗对低温胁迫的适应性,增加玉米种子萌发和幼苗正常生长的能力.浓度为10mmol/L的CaCl2溶液处理对玉米低温胁迫的缓解效果最佳.

Zhao

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强玮 . 颠茄TR I基因的克隆、功能验证及超量表达对颠茄托品烷生物碱合成的影响
西南大学硕士学位论文, 重庆, 2012

DOI:10.7666/d.y2085435 URL [本文引用: 2]

托品烷类生物碱(Tropane alkaloids, TAs)是一类主要提取自茄科植物的小分子含氮化合物,它提供了临床上常用的抗胆碱药物莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine),广泛用于用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等,市场需求十分巨大。由于工业合成成本太过昂贵,目前莨菪碱和东莨菪碱主要从茄科植物的颠茄(Atropa belladonna)、莨菪(Hyoscyamus niger)和曼陀罗(Datura stramonium)中提取,产量有限,其中颠茄是中国药典规定的唯一TAs药源植物(国家药典委员会2011版),开展代谢工程以提高颠茄中TAs含量具有十分重要的意义。本研究采用RACE方法克隆了药用植物颠茄的托品酮还原酶(?)(tropinone reductase I, TRI)基因cDNA全长并进行了详细的生物信息学分析,同时构建了该基因的植物组织表达谱和诱导表达谱；原核表达验证酶活后,构建植物表达载体遗传转化颠茄获得转基因发根,经过液体发酵培养至指数生长末期,检测总托品烷生物碱含量和相应的AbTRI基因表达量。最终结果表明：颠茄中AbTR1作为一个控制点酶,它的过量表达能够极大的促进代谢流向莨菪碱和东莨菪碱方向流动,从而显著地提高总托品烷生物碱的产量。 TRI催化托品酮分子上羰基的还原生成α-托品醇(托品),是托品烷生物碱合成途径中间分支处的控制点酶。在莨菪中，TRI基因特异性的仅在根的内皮层和外皮层中强烈表达,曼陀罗和三分三(Anisodus acutangulus)的TRI基因也是克隆至培养的根组织。本研究即以颠茄根为材料,采用RACE技术,基于同源性克隆的方法获得了AbTRI基因全长cDNA,为1079bp,包含一段长度为819bp的CDS、14bp的5’UTR和234bp的3'UTR;polyA长度为13bp,终止密码子为TAA；其编码区编码一段272个氨基酸残基的蛋白序列(AbTRI),预测其分子量大小为29.3KDa,等电点为6.05。对推断的AbTRI基因编码氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明,AbTRI与已报道的茄科其它物种的托品酮还原酶氨基酸序列相似性均在80%以上,而且整体上都很保守,说明它们的TRIs从共同的祖先蛋白开始分化发生在相对较近的时间里；来源于茄科植物、十字花科植物、单子叶植物、细菌的TRIs在发育进化树上明显聚为4支,其中AbTRI与同科不同属的植物三分三TRI的亲缘关系最近,其次是莨菪；保守结构域预测发现AbTRI的氨基酸序列中存在典型的短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR_c)特征性结构域,这与曼陀罗和莨若的TRIs已经被鉴定属于SDR家族这一事实相吻合；进一步的三级结构预测发现,在AbTRI的N端SDR所需要的NADPH结合区域,存在SDR优先结合NADPH的保守氨基酸残基Lys31和Arg53,同时在C端底物托品酮结合区域也发现了两个决定托品酮分子以正确的取向结合在TRI酶蛋白上的保守氨基酸残基His112和Va1168。组织表达谱和诱导表达谱分析表明,该基因强烈地在颠茄成熟叶中表达,花苞和须根也有少量表达,其它部位表达微弱,其表达水平强烈地受ABA、ASA、MeJA、UV-B的诱导和SA的抑制,溶剂乙醇也能起到强烈的诱导效果。以pET28/大肠杆菌Rosetta为诱导表达系统对AbTRI基因进行原核表达功能验证,经1mM IPTG诱导培养4h, AbTRI重组蛋白含量达到了细胞总蛋白的50%以上,主要以包含体形式存在,其分子量约为30Kda,与预测的相符。对AbTRI重组蛋白包涵体进行纯化并透析复性后,以托品酮为反应底物,在NADPH存在下,检测RcTYDC重组蛋白的催化活性,利用HPLC法检测到了反应产物托品的生成,表明本研究克隆获得了颠茄的功能AbTRI基因。构建携带AbTRI基因的植物高效表达载体p1304+-AbTRI转化“卸甲”的根癌农杆菌C58C1获得工程菌C58Cl-p1304+-AbTR],遗传转化颠茄叶片,经检测rolB、rolC、Hygr和AbTRI基因后成功筛选出7个转基因发根系,分别进行液体培养基扩大培养然后检测托品烷生物碱(TAs)含量和基因表达量。在检测的7个转基因发根系中,有4个发根系的总TAs含量得到了大幅度的提高,依次为T9T16T23T11,19的总TAs含量比空菌发根对照和空载发根对照分别提高了3.2倍和8.3倍,莨菪碱的提高幅度平均要高于东莨菪碱；另外3个发根系出现了不同程度的基因沉默,TAs含量显著低于对照。利用实时荧光定量PCR技术检测这七个发根系中相应的AbTRI基因表达量,结果与生物碱含量检测的结果基本一致：四个生物碱含量提高的发根系(T9、T16、T23、T11)的基因表达水平都显著高于对照和其它转基因发根的表达水平；而三个低含量发根系(T10、T5、T15)的基因表达水平也显著低于对照,说明确实发生了基因共抑制现象。本研究的实验结果证明了在颠茄中过量表达AbTRI能够促进代谢流流向目的产物并显著提高总TAs含量,这为进一步开展颠茄的TAs代谢工程提供了新的候选基因和理论支持,结合本实验室之前的研究成果,在超量表达TAs途径上下游限速酶基因PMT和H6H的颠茄中进一步超量表达TRI,有可能最大限度的开发TAs途径的生物碱合成能力,培育出东莨菪碱超高产颠茄株系,为相应行业提供优质药源材料。

Qiang

. Cloning and Characterization of Tropinone Reductase I from Atropa belladonna and Its Overexpression for Enhancing the Tropane Alkaloids Production in Atropa belladonna
MS Thesis of Southwest University, Chongqing, China, 2012 ( in Chinese with English abstract)

DOI:10.7666/d.y2085435 URL [本文引用: 2]

张守仁 . 叶绿素荧光动力学参数的意义及讨论
植物学通报, 1999,16:444-448

DOI:10.3969/j.issn.1674-3466.1999.04.021 URL [本文引用: 1]

The chlorophyll fluorescence kinetics technique is referred to as a quick and nonintrusive probe in the studies of plant photosynthetic function. But there are irregularity and confusion in the nomenclature and interpretation of the parameters. In this paper we discuss the problems and try to solve them.

Zhang S

. A discussion on chlorophyll fluorescence kinetics parameters and their significance
Chin Bull Bot, 1999,16:444-448 (in Chinese without English abstract)

DOI:10.3969/j.issn.1674-3466.1999.04.021 URL [本文引用: 1]

马伏英 . 黄连等中药抗实验性小鼠柯萨奇B₃病毒性心肌炎的实验研究
武警医学, 1998,9(4):187-190

URL Magsci [本文引用: 1]

用柯萨奇B3病毒(CB3V)感染BALB/C小鼠,建立CB3V心肌炎动物模型,然后用黄连、黄芩、栀子及复方制剂对感染鼠进行治疗.结果表明,这4种药物均有抗病毒性心肌炎作用,表现在用药后治疗组心肌组织病毒滴定度明显低于感染+生理盐水对照组,心肌组织光镜及超微结构检查心肌病变程度、病灶范围明显较感染+生理盐水组为轻.为临床应用治疗病毒性心肌炎提供了佐证.

Ma F

. Experimental study of Coptis chinsis Franch etc. against coxsackievirus B₃ myocarditis of rats
Med J Chin People’s Armed Police Forces, 1998,9(4):187-190 (in Chinese with English abstract)

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尹永强, 胡建斌, 邓明军 . 植物叶片抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应研究进展
中国农学通报, 2007,23(1):105-110

DOI:10.3969/j.issn.1000-6850.2007.01.025 URL Magsci [本文引用: 1]

植物体内存在着一套负责清除活性氧产生的抗氧化系统。在植物正常生长情况下，它使活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。在逆境条件下，体内抗氧化系统清除活性氧能力下降，这种平衡被打破。综述了植物叶片内存在的抗氧化系统及其防御机制，重点论述了植物叶片抗氧化系统对干旱、低温、重金属等逆境胁迫的响应。并基于以上研究提出了一些需要进一步研究的问题。

Yin Y

, Hu J

, Deng M

. Latest development of antiosidant system and responses to stress in plant leaves
Chin Agric Sci Bull, 2007,23(1):105-110 (in Chinese with English abstract)

DOI:10.3969/j.issn.1000-6850.2007.01.025 URL Magsci [本文引用: 1]

郝敬虹, 易旸, 尚庆茂, 董春娟, 张志刚 . 水杨酸处理对干旱胁迫下黄瓜幼苗氮素同化及其关键酶活性的影响
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该实验以2年生黄连幼苗为材料,在100mmol·L-1的NaCl模拟盐胁迫条件下,经不同浓度的外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理后,测定黄连幼苗光合色素含量、叶绿素荧光参数及气体交换参数等光合生理指标的变化,探寻提高黄连幼苗在盐胁迫条件下抗性能力的途径。结果显示:(1)NaCl胁迫下黄连幼苗的光合生理受到显著抑制,在经过不同浓度的ALA处理后,显著提高了叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素等光合色素的含量。(2)盐胁迫下,黄连植株的的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)及叶片蒸腾速率(Tr)均发生下降,并且随着胁迫时间和胁迫浓度的增加下降幅度逐渐增大,胞间CO2浓度(Ci)则呈上升趋势,说明盐胁迫下黄连净光合速率降低的主要影响因素是非气孔因素。(3)用ALA处理后,黄连的Pn、Gs及Tr均有不同程度的提高,Ci也有不同程度的降低,并且不同的浓度梯度存在着显著的效果差异。(4)ALA处理还提高了最大荧光(Fm,1.234)、最大光化学效率(Fv/Fm,0.849)、PSⅡ有效光化学效率(Fv′/Fm′,0.685)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ,0.545)和光化学淬灭系数(qP,0.872)的水平,有效降低了初始荧光(F0,0.211)和非光化学淬灭系数(NPQ,0.251)的水平。研究表明,外源ALA通过提高黄连幼苗叶片的光合色素含量,减少过剩激发能的耗散,提高光合电子传递效率,有效缓解了盐胁迫对黄连叶片PSⅡ的伤害,提高了植株的抗盐能力。

Zhang C

, Zhou

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以中国春-Synthetic 6x小麦染色体代换系及其亲本为材料,在不同生育时期对其叶片叶绿素、类胡萝卜素含量进行测定。结果表明,正常水分条件下(对照),5A5、B代换系叶片的叶绿素含量与5B代换系叶片的类胡萝卜素含量在孕穗期、开花期和灌浆期均显著或极显著高于中国春。干旱胁迫下,叶绿素和类胡萝卜素含量低于对照,3A、4D代换系叶片的叶绿素含量与2A、4D代换系的类胡萝卜素含量始终显著或极显著高于中国春。由此表明,正常水分条件下,Synthetic 6x的5A、5B染色体上可能存在诱导叶绿素含量增高的有利基因,5B染色体上可能存在诱导类胡萝卜素含量增高的有利基因。干旱胁迫下,Synthetic 6x的3A、4D染色体上可能存在诱导叶绿素含量增高的有利基因,2A、4D染色体上可能存在诱导类胡萝卜素含量增高的有利基因。

Bai Z

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邢建永, 王康才, 汤兴利, 刘海琴 . Ca ²+对悬浮培养半夏类原球茎生长及次生代谢物累积的影响
中草药, 2011,42:376-379

[本文引用: 2]

Xing J

, Wang K

, Tang X

, Liu H

. Effect of Ca ²+ on growth in protocorm-like bodies of
Pinellia ternata and accumulation of secondary metabolites during suspension culture
Chin Traditional Herbal Drugs, 2011,42:376-379 (in Chinese with English abstract)

[本文引用: 2]

[44]

温泉, 张楠, 曹瑞霞, 周心渝, 唐娟, 吴能表 . 增强UV-B对黄连代谢及小檗碱含量的影响
中国中药杂志, 2011,36:3063-3069

DOI:10.4268/cjcmm20112201 URL [本文引用: 1]

目的:测定黄连根中小檗碱含量对不同UV-B辐射强度的响应,为提高黄连小檗碱含量提供理论参考。方法:实验设置了CK(自然光),UL(0.05 W.m-2),UM(0.10 W.m-2),UH(0.20 W.m-2)4个处理组,探讨UV-B辐射下初生代谢中光合特性、PPP途径和次生代谢中酪氨酸酶及黄连根中的小檗碱含量的变化特性。结果:在UH辐射胁迫下,黄连叶片中光合色素、PSII非光化学猝灭系数(qN),初始荧光(Fo),电子传递速率(ETR)以及6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性、根中小檗碱含量均较其他组低。而处于UM辐射下的黄连,光合作用能力、PPP途径、酪氨酸酶活性以及小檗碱含量均高于对照组,产生了胁迫应激反应来抵御适度的UV-B辐射。结论:黄连处于UM辐射时,通过增强光合作用及PPP途径,能提供较多的次生代谢物前体物及次生代谢物所必需的NADPH,进而小檗碱的含量也相应提高,为黄连栽培种植中提高小檗碱含量提供参考。

Wen

, Zhang

, Cao R

, Zhou X

, Tang

, Wu N

. Effect of enhanced UV-B radiation on metabolism and berberine content of Coptis chinensis
China J Chin Mater Med, 2011,36:3063-3069 (in Chinese with English abstract)

DOI:10.4268/cjcmm20112201 URL [本文引用: 1]