删除或更新信息，请邮件至freekaoyan#163.com(#换成@)

OsWR2-RNAi对水稻角质层生物合成和耐旱性的影响

本站小编 Free考研考试/2021-12-26
闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗ù锝堟缁€濠傗攽閻樻彃鈧绱撳杈ㄥ枑闁哄啫鐗勯埀顑跨窔瀵粙顢橀悙鑼垛偓鍨攽閿涘嫬浠х紒顕呭灦瀵偊鎮╃紒妯锋嫼闂備緡鍋嗛崑娑㈡嚐椤栨稒娅犻柟缁㈠枟閻撶喖鏌熼崹顔兼殭濞存粍澹嗛埀顒冾潐濞叉牗鏅舵惔銊ョ闁告洦鍓氭慨婊堟煛婢跺顕滈柣搴㈠▕濮婂宕掑▎鎴犵崲闂侀€炲苯澧伴柛瀣洴閹崇喖顢涘☉娆愮彿婵炲鍘ч悺銊╂偂閺囥垺鐓熸俊顖濆吹閸欌偓闂佸憡鐟ョ€氼噣鍩€椤掑喚娼愭繛鎻掔箻瀹曞綊鎳為妷銈囩畾闂佸壊鍋呭ú鏍倷婵犲洦鐓忓┑鐐茬仢閸旀潙霉閸忓吋绀嬫慨濠冩そ閹筹繝濡堕崨顔锯偓楣冩⒑閼姐倕鏋傞柛搴㈠▕閸┾偓妞ゆ帊绀侀崵顒勬煕濞嗗繐鏆欐い鏇秮楠炲酣鎸婃径鎰暪闂備線娼ч¨鈧┑鈥虫喘瀹曘垽鏌嗗鍡忔嫼閻熸粎澧楃敮鎺撶娴煎瓨鐓曢柟鎯ь嚟閹冲洭鏌曢崱妤€鏆欓柍璇查叄楠炲鎮╃喊澶屽簥闂傚倷绀侀幉锟犳偡閿曞倹鏅柣搴ゎ潐閹哥ǹ螞濞戙垹鐒垫い鎺戝枤濞兼劖绻涢幓鎺旂鐎规洘绻堥獮瀣晝閳ь剟寮告笟鈧弻鐔煎礈瑜忕敮娑㈡煛閸涱喗鍊愰柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍊块柨鏃堟暜閸嬫挾绮☉妯诲櫧闁活厽鐟╅弻鐔告綇妤ｅ啯顎嶉梺绋垮閺屻劑鍩為幋锕€纾兼慨姗嗗幖閺嗗牓姊虹粙娆惧剳闁哥姵鍔楅幑銏犫槈閵忕姷顓哄┑鐐叉缁绘帗绂掗懖鈺冪＜缂備降鍨归獮鎰版煕鐎ｎ偅宕屾慨濠呮閹风娀寮婚妷顔瑰亾濡や胶绡€闁逞屽墯濞煎繘濡搁敃鈧鍧楁煟鎼淬劍娑ч柟鑺ョ矋缁嬪顓奸崱鎰盎闂佸搫绋侀崑鍕閿曞倹鐓熼柟鎯х摠缁€鍐磼缂佹ḿ娲寸€规洖宕灒闁告繂瀚峰ḿ鏇炩攽閻橆偅濯伴悘鐐舵椤亞绱撴担铏瑰笡缂佽鐗撳畷娲焵椤掍降浜滈柟鐑樺灥椤忊晝绱掗悩顔煎姕闁靛洤瀚板顕€鍩€椤掑嫬纾块柛鎰皺閺嗭箓鏌曟径鍫濆姉闁衡偓娴犲鐓熼柟閭﹀墮缁狙勩亜閵壯冧槐闁诡喕绮欓、娑樷堪閸愌勵潟濠电姷顣介埀顒€纾崺锝嗐亜閵忊剝绀嬮柡浣稿€块幃鍓т沪閽樺顔囬梻鍌氬€烽懗鑸电仚闂佸搫鐗滈崜娑氬垝濞嗘挸绠婚悹鍥皺閻ゅ洭姊虹化鏇炲⒉闁荤噦绠撳畷鎴﹀冀閵娧咁啎闂佺硶鍓濊摫閻忓繋鍗抽弻锝夊箻鐎涙ḿ顦ㄦ繛锝呮搐閿曨亪銆佸☉妯锋瀻闁圭儤绻傛俊鎶芥⒒娴ｅ懙鍦偓娑掓櫊瀹曞綊宕烽鐕佹綗闂佽宕橀褏澹曢崗鍏煎弿婵☆垰鎼幃鎴澪旈弮鍫熲拻濞撴埃鍋撻柍褜鍓涢崑娑㈡嚐椤栨稒娅犻悗娑欋缚缁犳儳霉閿濆懎鏆遍柛姘埥澶娢熼柨瀣垫綌闂備線娼х换鍡涘焵椤掆偓閸樻牠宕欓懞銉х瘈闁汇垽娼у瓭闂佹寧娲忛崐婵嬪箖瑜庣换婵嬪炊瑜忛弻褍顪冮妶鍡楃瑨閻庢凹鍙冮幃锟犲Ψ閳哄倻鍘介梺鍝勬川閸嬫盯鍩€椤掆偓濠€閬嶅焵椤掍胶鍟查柟鍑ゆ嫹
王莎1, 贺勇1, 罗光宇1, 姚敏1, 张旭1, 陈信波1,2, 周小云1,2,*
1湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128

2作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128

* 通讯作者(Corresponding author): 周小云, E-mail: xyzhou71@hotmail.com 第一作者联系方式: 王莎, E-mail:
收稿日期:2016-07-20 接受日期:2016-11-02网络出版日期:2016-11-11基金:本研究由湖南省重点研发计划项目(2015JC3102), 湖南农业大学大学生创新计划项目(XCX1504)和国家自然科学基金项目(31300216)资助

摘要植物的角质层在干旱胁迫下对降低植物的非气孔性失水起重要作用。对水稻蜡质相关转录因子基因 OsWR2过表达研究发现, OsWR2对水稻表皮蜡质和角质的含量和组分构成以及非气孔性失水均有影响, 推测 OsWR2是植物角质层代谢途径中重要的调控基因。本研究通过构建 OsWR2-RNAi载体并转入水稻获得抑制 OsWR2表达的突变转基因植株, 发现 OsWR2-RNAi水稻叶片角质层组成和含量明显变化, 其蜡质组分中醛类、醇类和烷烃类的减少导致表皮蜡质晶体的积累和表皮蜡质总量减少14.8%, 角质单体中C16:0 ω-OH、C18:1 ω-OH脂肪酸和di-OH脂肪酸等角质组分含量的显著降低导致 OsWR2-RNAi水稻叶片中角质单体总量减少36.2%。幼苗干旱处理前后, OsWR2-RNAi植株自由脯氨酸含量与野生型相比变化不大, 但其表皮通透性、水分散失率和MAD含量显著增加, 幼苗耐旱性降低。本研究结果进一步证实 OSWR2对水稻蜡质和角质生物合成及对非气孔性失水的调控作用, 有望为水稻耐旱性状的改良提供重要基因资源。

关键词: OsWR2; RNAi; 植物角质层; 干旱胁迫; 非气孔性失水
Influence of OsWR2-RNAi on Rice Cuticle Biosynthesis and Drought Resistance
WANG Sha1, HE Yong1, LUO Guang-Yu1, YAO Min1, ZHANG Xu1, CHEN Xin-Bo1,2, ZHOU Xiao-Yun1,2,*
1 College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha 410128, China

Fund:This study was supported by the Key Research Projects of Hunan Province (2015JC3102), the College Students Innovation Project of Hunan Agricultural University (XCX1504), and the National Natural Science Foundation of China (31300216).
AbstractPlant cuticle plays an important role on decreasing plant non-stomatal water loss under drought stress. Overexpression of wax related transcription factor gene OsWR2 in rice can increase total cuticular wax and cutin amounts, affect cuticular wax and cutin monomer composition, and alter cuticular wax crystallization patterns and cuticle membrane ultrastructure, implying important roles of OsWR2 in rice cuticle biosynthesis and non-stomatal water loss regulation. In this report, we constructed OsWR2RNA inhibition vector ( OsWR2-RNAi), and transformed it into rice callus to obtain OsWR2 knockout rice mutants using Agrobacterium-mediated transforming method. OsWR2-RNAi transgenic rice exhibited reduced total cuticular wax amounts by 14.8% mainly due to the decrease of aldehydes, alkanes and alcohols, and lessened full cutin monomer level by 36.2% due primarily to the decrease of C16:0 ω-OH, C18:1 ω-OH, and di-OH fatty acid components. OsWR2-RNAi transgenic rice also showed enriched leaf chlorophyll leaching, water loss rates and MDA contents, whereas reduced tolerance to water deficit. All these physiologic and biochemical index to support the previous hypothesis of OsWR2 acting as a transcriptional regulator of both cuticle biosynthetic pathways and non-stomatal water loss, providing evidence of OsWR2 exerting direct influence over rice dehydration, and a potential application resource in genetic improvement of crop drought tolerance.

Keyword: OsWR2; RNAi; Plant cuticle; Drought stress; Non-stomatal water loss
Show Figures
Show Figures
















植物失水主要通过气孔蒸腾和角质蒸腾, 正常生理条件下, 前者占90%而后者占10%左右[1]。但是持续干旱胁迫时, 植物气孔关闭, 水分的气孔蒸腾(气孔性失水)受阻, 而角质蒸腾(非气孔性失水)仍在继续, 造成植物的持续失水。因而, 角质蒸腾已成为植物在持续干旱胁迫下最主要的失水方式, 并已在拟南芥、苜蓿等植物的研究中得到证实[2, 3, 4]。控制植物的角质蒸腾, 将对持续干旱胁迫下植物生命的维持起着至关重要的作用并成为近年来植物干旱胁迫研究的热点[1, 5]。植物的角质层覆盖在植物表皮细胞外, 是由表皮蜡质和角质组成不溶于水而溶于部分有机溶剂的脂质性保护层[6, 7]。植物的角质层除具有限制植物非气孔性水分散失的作用外, 还能阻挡紫外辐射、防止外源病虫害侵入, 以及降低灰尘、花粉和空气中的污染物在植物表面沉积等, 是植物在长期进化过程中形成的抵御外界不良环境的天然屏障[8, 9, 10]。植物非气孔性失水与植物耐干旱反应密切相关, 干旱胁迫能诱导植物表面角质层蜡质晶体的积累, 导致表皮蜡质和角质的结构、成分及含量改变, 进而引起植物表皮通透性改变, 增加植物对干旱胁迫的耐受能力[11, 12, 13, 14]。OsWR2 (Os06g0604000)是水稻AP2/ERF超家族中ERF亚家族转录因子基因, 本研究团队Zhou等[15]研究发现, 过表达OsWR2既影响水稻表皮蜡质的组分和含量, 也影响角质的结构和生物合成, 是水稻角质层合成代谢途径中的重要调控基因, 同时OsWR2过表达的水稻植株对干旱胁迫耐受性明显增加。为阐明OsWR2调控角质层非气孔性失水的生理机制, 本研究构建了OsWR2-RNAi载体并转入水稻, 获得抑制OsWR2表达的转基因突变植株Ri-OsWR2, 通过对Ri-OsWR2与OE-OsWR2转基因植株以及野生型水稻(WT)日本晴植株在表皮蜡质和角质的组分、含量、结构、表皮通透性、失水率和耐干旱胁迫能力等方面的比较, 解析水稻角质层表皮蜡质和角质与非气孔性失水的关系, 以期进一步验证OsWR2基因参与角质层生物合成和耐干旱胁迫的功能, 并为水稻耐旱性状的改良提供重要基因资源。
1 材料与方法1.1 试验材料过表达植株OE-OsWR2由本团队研究所得[15], 粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.)以及载体pCAMBIA1305.1质粒、pCAMBIA1300-Muti质粒、大肠杆菌DH5a、农杆菌EHA105均由湖南省作物基因工程重点实验室保存。
1.2 试验方法1.2.1 OsWR2-RNAi的载体构建和转基因植株的获得 从pCAMBIA1305.1质粒上扩增GUS内含子片段约190 bp (引物: F: 5'-GTAAATTTCTAGTTTTT CTC-3', R: 5'-CTGTAACTATCATCATCATC-3'), 连接到pCAMBIA1300-Muti质粒的35S启动子下游, 构建pCAMBIA1300M-GUS中间载体; 引入不同的酶切位点设计引物OsWR2-RiBamHIF: 5'-ATGGA TCCTTCTCCTACTCTGCCTGCCTCCT-3', OsWR2- RiSmaIR: 5'-ATCCCGGGAGACGCCAATGTGGGA CTTCTC-3'; OsWR2-RiSpeIF: 5'-ATACTAGTTCTCC TACTCTGCCTGCCTCCT-3', OsWR2-RiXbaIR: 5'-AT TCTAGAGACGCCAATGTGGGACTTCTC-3', 从水稻cDNA上分别扩增OsWR2-RNAi的正反向基因片段, 并分别连接到pCAMBIA1300M-GUS质粒的GUS基因片段上下游以构建OsWR2-RNAi载体, 以电激法转入农杆菌EHA105菌株, 农杆菌介导转化水稻粳稻品种日本晴, 获得OsWR2-RNAi转基因植株。
1.2.2 OsWR2-RNAi转基因水稻植株的实时定量PCR分析 从PCR和Southern杂交鉴定阳性的OsWR2-RNAi (Ri-OsWR2)转基因水稻株系中选取3个株系(Ri1, Ri2, Ri3), 采用实时定量PCR法分析OsWR2的表达, 从每个株系取2个单株的幼嫩叶片, 约0.1 g, 液氮速冻后研磨, 采用TRIzol试剂抽提方法提取水稻总RNA, Promega反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA, 以OsUBQ1 (F: 5'-ACCCTGGCTG ACTACAACATC-3', R: 5'-AGTTGACAGCCCTAGG GTG-3')为内源性参照标准, SYBR Green I为染料, 用Applied Biosystems7500实时PCR测定仪检测, 设置3个独立的重复性试验, 参照Zhou等[15]的方法分析数据。
1.2.3 扫描电镜样品的制备与观察 取分蘖后期至拔节期的Ri-OsWR2, 过表达(OE-OsWR2)和野生型日本晴水稻(WT)叶片的同一部位, 用扫描电子显微镜观察成熟水稻叶片的蜡质晶体, 戊二醛固定样品, 保存于4℃的冰箱内, 按扫描电子显微镜的要求脱水干燥后, 将样品于JEOL JFC-1600镀膜机上喷金镀膜, 于JSM-6360LV扫描电子显微镜下观察其形态并拍照。
1.2.4 水稻叶片表皮蜡质提取和蜡质总量、组成成分分析 参照周小云等[16]的加热法提取蜡质, 称取Ri-OsWR2、OE-OsWR2和WT水稻成熟叶片1 g浸没于30 mL 60℃氯仿中30 s后取出, 室温冷却后加5 μ g二十四碳烷内标物, 以氮气吹干后, 加入1 mL吡啶使其完全溶解, 取250 μ L提取液, 加入250 μ L BSTFA 70℃加热40 min衍生后, 采用Chen等[8]方法用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析蜡质组分, 并采用峰面积归一法测定各组分的相对含量。
1.2.5 水稻叶片角质单体组分含量分析 参照Zhou等[15]的方法分析Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因植株和野生型水稻植株叶片角质单体含量。
1.2.6 水稻叶片叶绿素浸提率分析 取分蘖后期至拔节期前的Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因植株和野生型水稻植株的成熟叶片0.1 g, 剪成约2 cm长度, 浸没于40 mL 80%的丙酮溶液中, 黑暗条件下轻轻摇晃, 分别于0、10、20、30、40、50、60、90和120 min等时间点取2 mL浸提液用于测定其在665 nm和649 nm波长下的吸光度值。每次测定后的浸提液倒回相应的瓶中, 参照何旎清等[17]方法计算提取液中每一个时间点各色素的含量与浸提24 h后叶片叶绿素总含量的百分比, 得到每一个时间点的叶绿素浸提率, 试验重复3次。
1.2.7 水稻叶片水分散失率测定 进行非气孔性失水率的测定时, 为减少气孔失水对试验结果的影响, 整个试验在黑暗中操作。失水试验前一晚将处于分蘖后期至拔节期前的试验样品Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因植株和野生型植株的盆钵加满水并套膜使植株处于水分充足、气孔关闭状态来考察水稻植株的非气孔性失水。参照Zhou等[15]方法剪取长势和生长时期基本一致的水稻地上部位于相对湿度为50%, 温度为28℃的暗室里自然干燥, 于0、3、6、9、12、15、18、21和24 h等不同时间段分别检测称重, 通过每个时间段的称重与鲜重的百分比计算失水率, 取不同盆钵的单株重复试验3次。
1.2.8 水稻叶片丙二醛(MDA)含量的测定 分别于干旱胁迫前后称取四叶一心期的Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因植株和野生型水稻植株的叶片1 g, 参照Huvaux等[18]的方法提取其MDA并计算其含量, 每组试验重复3次。
1.2.9 水稻叶片脯氨酸含量的测定 分别于干旱胁迫前后称取四叶一心期的Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因植株和野生型水稻植株的叶片1 g, 参照Bates等[19]的方法提取其脯氨酸并计算其含量, 每组试验重复3次。
1.2.10 材料种植及幼苗干旱处理 将Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因种子和野生型水稻种子去壳消毒后接种于1/2 MS培养基上, 于32℃、光照强度100~150 μ mol m-2 s-1、16 h光照和8 h黑暗的人工气候箱中催芽及培养, 种子萌发1周后选取长势大致相当的水稻幼苗移栽至装有营养土的1.5 mL离心管盒中, 每盒分别种植18株左右转基因和对照幼苗, 生长到四叶一心期, 在正常生长条件下对其断水处理3 d, 复水3 d, 期间观察它的表型变化并照相。
1.2.11 数据统计分析 使用Microsoft Excel 2013录入和整理相关数据, 用SPSS 22.0对数据进行方差分析。

2 结果与分析2.1 OsWR2-RNAi转基因植株中OsWR2基因的表达明显降低qRT-PCR分析Ri-OsWR2转基因植株表明, 和WT相比, 3个Ri-OsWR2代表株系Ri-1、Ri-2和Ri-3中OsWR2基因的表达量都降低, 其中Ri-1-2、Ri-3-1和Ri-3-2中OsWR2 mRNA的相对水平较低, 分别为25%、30%和33% (图1), 说明OsWR2-RNAi转基因植株不同程度地抑制了OsWR2基因的表达, 成功获得抑制OsWR2表达的突变体材料Ri-OsWR2植株。
图1
Fig. 1
Figure OptionViewDownloadNew Window
图1 Ri-OsWR2转基因水稻植株的qRT-PCR分析
误差线表示3次重复的标准误, * 表示P< 0.05显著差异, * * 表示P< 0.01极显著差异。Fig. 1 qRT-PCR analysis of Ri-OsWR2 transgenic rice plants
Error bars represent the standard errors of three replicates. * and * * denote significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.


2.2 OsWR2-RNAi减少水稻叶片表皮蜡质晶体的积累分蘖后期至拔节期的电子显微镜扫描观察结果表明, 与WT相比, Ri-OsWR2植株叶片表皮蜡质晶体密度和乳突上的蜡质分布密度明显稀疏(图2); 与过表达OsWR2 (OE-OsWR2)转基因植株中水稻叶表皮蜡质晶体增多和乳突数量显著增加的表型正好相反。进一步验证OsWR2参与了水稻表皮蜡质晶体的积累, 并且OsWR2的表达与水稻表皮蜡质晶体的积累呈正相关。
图2
Fig. 2
Figure OptionViewDownloadNew Window
图2 Ri-OsWR2转基因水稻叶片表皮蜡质晶体的扫描电镜图Fig. 2 Electron micrograph of wax crystals in Ri-OsWR2 transgenic rice leaves


2.3 OsWR2-RNAi水稻叶片蜡质组分及含量变化为进一步分析OsWR2表达抑制后对水稻叶片角质层蜡质含量和组成成分的影响, 用加热氯仿法提取蜡质后, 气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析仪分析Ri-OsWR2转基因水稻叶片中表皮蜡质组分和含量, 并比较其与WT和OE-OsWR2植株相同部位叶片的差异。结果表明, Ri-OsWR2转基因叶片中总蜡质含量比野生型降低了14.8% (图3-A), 进一步分析Ri-OsWR2转基因水稻叶片各蜡质组分的含量, 发现其中的C30、C32、C34醛含量和C30醇含量显著降低, 而在OE-OsWR2转基因植株叶片中, 这些组分含量极显著升高; 但脂肪酸类、烷烃类和酯类含量在OE-OsWR2、Ri-OsWR2和WT中都无显著差异(图3-B)。
图3
Fig. 3
Figure OptionViewDownloadNew Window
图3 Ri-OsWR2水稻叶片中蜡质组分和含量分析
A: 水稻叶片中各蜡质组分总含量比较; B: 水稻叶片中表皮蜡质组分各种化合物含量比较。误差线表示3次重复的标准误, * 表示P< 0.05显著差异, * * 表示P< 0.01显著差异。Fig. 3 Analyses of wax contents and constituents in rice leaves of Ri-OsWR2
A: quantitative analysis of wax components and contents in rice leaves; B: wax constituents of fatty acids, aldehydes, alcohols, alkanes, and esters in rice leaves. Error bars represent the standard errors of three replicates. * and * * denote significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.


2.4 OsWR2-RNAi水稻叶片角质单体组分和含量的变化GC-MS分析发现, Ri-OsWR2转基因水稻叶片角质单体总量较WT降低了36.2% (Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因水稻和WT水稻叶片中角质单体总量分别为7.98、18.52和12.51 μ g cm-2)。如图4所示, 与WT相比, Ri-OsWR2转基因水稻植株叶片中角质单体的C16:0 ω -OH、C18:1 ω -OH脂肪酸和di-OH脂肪酸等角质组分极显著降低, 而OE-OsWR2转基因水稻叶片中角质单体总量、C16:0 ω -OH、C18:1 ω -OH脂肪酸和di-OH脂肪酸等角质组分显著增加, 表明OsWR2基因参与水稻角质单体生物合成的羟基化反应过程。
图4
Fig. 4
Figure OptionViewDownloadNew Window
图4 Ri-OsWR2水稻叶片角质单体组分和含量的分析
误差线表示3次重复的标准误, * 表示P< 0.05显著差异, * * 表示P< 0.01显著差异。Fig. 4 Cutin monomer composition and loads in rice leaves of Ri-OsWR2
Error bars represent the standard errors of three replicates. * and * * denote significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels,
respectively.


2.5 OsWR2-RNAi降低水稻叶片的非气孔性失水率和表皮通透性植物水分散失率是衡量植物抗旱性的一个重要指标, 水分散失速率越低, 叶片的抗旱保水能力就越强, 其抗旱性也越好。对OsWR2过表达研究发现水稻干旱耐受性有所增强。失水率的结果显示, 随着时间的延长, 3种植株的失水率整体都呈上升趋势, 但Ri-OsWR2转基因水稻的失水率与WT相比稍微升高, 处理24 h后, Ri-OsWR2和WT的总失水率已相差不大, 分别为78.18%和75.58%; 而OE-OsWR2失水率明显比WT和Ri-OsWR2低, 处理24 h后的失水率仅为56.13% (图5-A)。为证明失水率与水稻角质层属性的关系, 进行了反映叶片表皮通透性的叶绿素浸提率试验, 其结果显示叶绿素浸提率与时间呈正相关, 浸提120 min后, Ri-OsWR2、WT和OE-OsWR2的叶绿素浸提率分别为58.95%、49.10%和31.28%, 说明与野生型相比, 抑制OsWR2基因表达的水稻植株Ri-OsWR2叶片表皮通透性高, 而过表达植株OE-OsWR2叶片表皮通透性低(图5-B), 结果与预期一致。
图5
Fig. 5
Figure OptionViewDownloadNew Window
图5 Ri-OsWR2转基因水稻植株叶片非气孔性失水率和叶绿素浸提率的变化
A: 非气孔性失水; B: 叶绿素浸提。A: water-loss rate; B: chlorophyll leaking ratio.Fig. 5 Changes of chlorophyll leaking ratio and water loss rate in different rice leaves


2.6 OsWR2-RNAi转基因水稻植株干旱胁迫下脯氨酸含量变化不大而丙二醛(MDA)含量显著增加植株自由脯氨酸含量在一定程度上反映其体内水分状况, 植物细胞中自由脯氨酸适当的积累, 可以增强植物对逆境胁迫的耐受力[20, 21]。因此体内自由脯氨酸含量可作为抗早品种选育的参考性生理指标。干旱处理前, 转基因和野生型水稻叶片的自由脯氨酸含量差异不显著(Ri-OsWR2 9.09 μ g g-1; WT 10.10 μ g g-1; OE-OsWR2 9.10 μ g g-1), 干旱处理3 d后, 3种水稻叶片的自由脯氨酸含量均明显增加, 其中Ri-OsWR2增加40.58%, WT增加40.46%; 而OE-OsWR2的自由脯氨酸含量极显著增加, 相比处理前增加了2.4倍之多(图6-A)。丙二醛(MDA)是活性氧积累诱发的膜脂过氧化产物, 一旦MDA在植物体内的含量积累到一定程度, 将对膜和细胞造成伤害。通常情况下, 脂质过氧化程度和逆境胁迫造成氧化伤害程度与MDA在体内的含量呈正相关[26]。因此植物体内MDA含量可以作为植物对逆境胁迫耐受力的衡量指标: 体内MDA含量越低的植物, 其受逆境胁迫损伤的程度越低。图6-B显示, 处理前, Ri-OsWR2、OE-OsWR2和WT植株中MDA含量无显著差别, 干旱处理3 d后MDA含量均极显著增加, 分别增加了1.6倍、1.0倍和1.3倍, 处理后Ri-OsWR2转基因水稻叶片中MDA含量明显高于WT, 而OE-OsWR2植株中MDA含量明显降低(图6-B)。逆境特征因子的检测结果表明, Ri-OsWR2转基因植株在干旱胁迫条件下, 其细胞膜损伤程度比野生型和过表达植株OE-OsWR2大, 反向证实OsWR2对植物干旱胁迫的正调控作用。
图6
Fig. 6
Figure OptionViewDownloadNew Window
图6 Ri-OsWR2转基因水稻植株干旱处理后脯氨酸和MDA含量的变化
A: 脯氨酸含量; B: 丙二醛含量。误差线表示3次重复的标准误, * 表示P< 0.05显著差异, * * 表示P< 0.01显著差异。Fig. 6 Changes of proline and MDA contents in Ri-OsWR2 transgenic rice leaves after drought treatment
A: Proline content; B: MDA content. Error bars represent the standard errors of three replicates. * and * * denote significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.


2.7 OsWR2-RNAi转基因水稻幼苗对干旱胁迫不耐受如图7所示, 干旱处理3 d后, 四叶一心期3种幼苗之间出现了较明显的表型差异, WT水稻幼苗和Ri-OsWR2转基因水稻幼苗均出现较明显的萎蔫, 其中Ri-OsWR2转基因幼苗叶片卷曲和萎蔫最为明显, 而过表达OE-OsWR2转基因水稻幼苗只在叶片边缘稍有卷曲的表型特征(图7-b); 复水生长3 d后, 3种幼苗的表型形成鲜明对比: Ri-OsWR2转基因幼苗几乎全部死亡, WT幼苗仅有10%~15%恢复正常, 而OE-OsWR2幼苗全部恢复正常生长状态(图7-c)。这进一步证实了OsWR2对干旱胁迫的正调控作用。
图7
Fig. 7
Figure OptionViewDownloadNew Window
图7 干旱胁迫对Ri-OsWR2、OE-OsWR2转基因水稻和WT水稻幼苗的影响
a: 3周龄幼苗处理前; b: 干旱处理3 d后; c: 复水3 d后。Fig. 7 Influences of water deficiency on OsWR2transgenic and WT seedlings
a: 3-week-old seedlings before dehydration; b: 3 days of water deficit; c: 3 days after dehydration-rewatering.


3 讨论植物表皮角质层的生物合成不仅受自身遗传因素和外界环境变化的影响, 还受多个代谢途径中多个转录因子的协同调控[22, 23]。拟南芥AP2/EREBP家族转录因子SHN1/WIN1是第一个被鉴定的既影响表皮蜡质又影响角质生物合成的转录因子基因[24, 25]。水稻中与SHN1/WIN1同源性较高的基因有OsWR1和OsWR2, 都属于AP2/ERF超家族中ERF亚家族转录因子基因。OsWR1受盐、ABA、特别是干旱等胁迫的诱导表达, 在水稻中过表达时导致转基因植株角质层透性降低而增强抗干旱胁迫能力, 而OsWR1突变体植株表皮透性和失水率显著升高, 干旱处理后对耐旱性减弱[26]。OsWR2过表达水稻蜡质晶体的密度、蜡质和角质单体组分的含量发生改变, 且能降低植株水分散失率, 增强植株的耐旱性[15]。本研究通过RNAi方法构建抑制OsWR2表达的突变体植株OsWR2-RNAi, 电镜扫描观察水稻叶片表皮蜡质分布情况, 发现与野生型对照相比, OsWR2-RNAi植株叶片表皮蜡质分布密度显著减少, 且乳突数量有所减少; 这与过表达OsWR2植株OE-OsWR2所表现的叶片表皮蜡质分布密度和乳突数量显著增加的表型正好相反。OsWR2-RNAi植株表皮蜡质晶体密度的减小可能是导致Ri-OsWR2植株干旱耐受力降低的根本原因, 因为蜡质晶体的密度和乳突的多少影响水稻表面积及对热辐射的反射作用, 进而影响水稻的干旱耐受力。事实上, 植物表面蜡质晶体的大小和位置对于决定水分扩散途径起非常重要的作用[27]。Mamrutha等[28]用290个桑葚品种研究发现, 不同品种之间叶片持水量变化与叶片蜡质含量、蜡质晶体大小和密度存在明显的相关性。Park等[29]用扫描电镜观察水稻WDL突变体叶表面, 发现蜡质晶体形状不规则, 有断裂和凝结现象, 进一步分析发现该突变体角质蒸腾速率比野生型高2~3倍, 干旱耐受力明显降低。
表皮蜡质对于植物蒸腾起的重要作用不仅仅取决于其厚度, 也与其成分有关。Oliveria等[30]对巴西卡廷加群落植被和热带高草草原植被的抗旱性研究发现, 前者的保水能力强于后者。卡廷加群落植被叶片角质层蜡质的主要成分是极性较低的三萜醇和C27-C33烷烃类物质, 而热带高草草原植被的蜡质含有大量的极性较高的棕榈酮和熊果酸。Seo等[14]研究发现拟南芥活化myb96-1D突变体叶表面蜡质含量显著增加, 其中以醛类和烷烃类物质增加最为明显, 而拟南芥缺失突变体myb96-1蜡质总量明显减少。另发现与对照相比, myb96-1D叶绿素浸提率和角质蒸腾较慢, 而myb96-1叶绿素浸提率和角质蒸腾较快, 表明角质层蜡质中醛类和烷烃类物质的增加提高了拟南芥的抗旱能力。本试验研究发现, 与WT相比, OsWR2-RNAi植株叶片表皮蜡质的总含量明显减少, 且蜡质组分的醛类、醇类和烷烃类都有不同程度的减少, 而过表达OsWR2植株与之相反, 且蜡质组分的脂肪酸和酯类也都有所增加。说明OsWR2主要影响到水稻植株蜡质组分中的醛类、醇类和烷烃类物质含量, 进而影响水稻表皮蜡质的表型、密度和积累, 最终影响角质层的水分散失。
植物叶片失水率是衡量植株维持水分的重要指标, 水分散失率越高, 越容易导致植物枯萎甚至死亡。叶绿素浸提率也是衡量植物抗旱性的一个重要指标, 表面蜡质的减少将导致叶表皮渗透性和水分散失率增加[31, 32]。Weng等[33]发现拟南芥lacs1 lacs2双缺失突变体叶绿素是野生型的4倍, 其失水率也比野生型高, 对于干旱更为敏感。我们发现叶绿素浸提率和水分散失率, 与WT相比, OsWR2-RNAi较高而OE-OsWR2较低。同时, 与WT相比, OsWR2- RNAi干旱处理后其植株中自由脯氨酸含量降低虽然不明显, 但膜脂过氧化的产物MDA含量增加显著; OsWR2-RNAi幼苗植株对干旱胁迫的耐受能力也较弱。这些试验结果表明, OsWR2-RNAi水稻植株细胞膜的稳定性更差, 处于干旱胁迫的条件下, 植物细胞组织所受的创伤更严重, 导致角质层的非气孔性水分散失率增加, 干旱胁迫耐受性降低。OsWR2-RNAi植株所表现的表皮蜡质晶体密度、含量及蜡质、角质单体成分的改变对水稻叶表面细胞膜通透性和水分散失率的影响, 验证了OsWR2对表皮蜡质和角质生物合成和对干旱胁迫的正调控作用。
4 结论RNAi抑制水稻OsWR2基因的表达后, 植株叶片中OsWR2基因表达量显著降低, 叶表面蜡质晶体密度和表皮蜡质的含量显著降低, 且蜡质组分的醛类、醇类和烷烃类都有不同程度的减少, 角质单体的C16:0和C18:1 ω -OH脂肪酸和 di-OH脂肪酸等角质组分显著降低; 同时植株叶片表皮通透性、非气孔性失水率、膜脂过氧化产物MDA显著增加, 耐受干旱胁迫能力降低。OsWR2-RNAi对水稻角质层生物合成和耐旱性的影响说明了OsWR2基因的功能及对角质层生物合成和干旱胁迫的调控作用。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.


参考文献View Option
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1]Borisjuk N, Hrmova M, Lopato S. Transcriptional regulation of cuticle biosynthesis. Biotechnol Adv, 2014, 32: 526-540[本文引用:2]
[2]Medrano H, Escalona J M, Bota J, Gulias J, Flexas J. Regulation of photosynthesis of C3 plants in response to progressive drought: stomatal conductance as a reference parameter. Ann Bot, 2002, 89: 895-905[本文引用:1]
[3]Chen X, Goodwin S, Liu X, Chen X, Bressan R, Jenks M A. Mutation of the RST1 locus of Arabidopsis reveals an association of cuticular wax with embryo development. Plant Physiol, 2005, 139: 909-919[本文引用:1]
[4]Zhang J Y, Broeckling C, Blancaflor E, Sledge M K, Summer L W, Wang Z Y. Overexpression of WXP1, a putative Medicago truncatula AP2 domain-containing transcription factor gene, increases cuticular wax accumulation and enhances drought tolerance in transgenic alfalfa( Medicago sativa) . Plant J, 2005, 42: 689-707[本文引用:1]
[5]Yeats T, Rose J K C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol, 2013, 163: 5-20[本文引用:1]
[6]Lee S B, Suh M C. Advances in the understand ing of cuticular waxes in Arabidopsis thaliana and crop species. Plant Cell Rep, 2015, 34: 557-572[本文引用:1]
[7]Bernard A, Joubès J. Arabidopsis cuticular waxes: advances in synthesis, export and regulation. Prog Lipid Res, 2013, 52: 110-129[本文引用:1]
[8]Espana L, Heredia-Guerrero J, Reina-Pinto J, Fernand ez-Munoz R, Heredia A, Dominguez E. Transient silencing of CHALCONE SYNTHASE during fruit ripening modifies tomato epidermal cells and cuticle properties. Plant Physiol, 2014, 166: 1371-1386[本文引用:2]
[9]Schreiber L, Skrabs M, Hartmann K, Diamantopoulos P, Simanova E, Santrucek J. Effect of humidity on cuticular water permeability of isolated cuticular membranes and leaf disks. Planta, 2001, 214: 274-282[本文引用:1]
[10]Gan L, Wang X, Cheng Z, Liu L, Wang J, Zhang Z, Ren Y, Lei C, Zhao Z, Zhu S, Lin Q, Wu F, Guo X, Wang J, Zhang X, Wan J. Wax crystal-sparse leaf 3 encoding a β-ketoacyl-CoA reductase is involved in cuticular wax biosynthesis in rice. Plant Cell Rep, 2016, 35: 1687-1698[本文引用:1]
[11]Kannangara R, Branigan C, Liu Y, Penfield T, Rao V, Mouille G, Hofte H, Pauly M D, Riechmann J L, Broun P. The transcription factor WIN1/SHN1 regulates cutin biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 2007, 19: 1278-294[本文引用:1]
[12]Zhou X Y, Li L Z, Xiang J H, Gao G F, Xu F X, Liu A L, Zhang X W, Zou J, Peng Y, Chen X B, Wan X Y. OsGL1-3 is involved in cuticular wax biosynthesis and tolerance to water deficit in rice. PLoS One, 2015, 10(1): e116676[本文引用:1]
[13]Zhu X, Xiong L. Putative megaenzyme DWA1 plays essential roles in drought resistance by regulating stress-induced wax deposition in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110: 17790-17795[本文引用:1]
[14]Seo P J, Lee S B, Suh M C, Park M J, Go Y S, Park C M. The MYB96 transcription factor regulates cuticular wax biosynthesis under drought conditions in Arabidopsis. Plant Cell, 2011, 23: 1138-1152[本文引用:2]
[15]Zhou X Y, Jenks M A, Liu J, Liu A L, Zhang X W, Xiang J H, Zou J, Peng Y, Chen X B. Overexpression of transcription factor OsWR2 regulates wax and cutin biosynthesis in rice and enhances its tolerance to water deficit. Plant Mol Biol Rep, 2014, 32: 719-731[本文引用:6]
[16]周小云, 陈信波, 徐向丽, 刘爱玲, 邹杰, 高国赋. 稻叶表皮蜡质提取方法及含量的比较. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2007, 33(3): 273-276
Zhou X Y, Chen X B, Xu X L, Liu A L, Zou J, Gao G F. On comparison of extraction methods of epicuticular wax and content of rice leaves. J Hunan Agric Univ(Nat Sci), 2007, 33(3): 273-276 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[17]何旎清, 柳周, 张龙, 白苏阳, 田云录, 江玲, 万建民. 一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析及突变基因的精细定位. 作物学报, 2015, 41: 1155-1163
He N Q, Liu Z, Zhang L, Bai S Y, Tian Y L, Jiang L, Wan J M. Genetic analysis of a new yellow-green leaf mutant and fine-mapping of mutant gene in rice. Acta Agron Sin, 2015, 41: 1155-1163 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[18]Havaux M, Lutz C, Grimm B. Chloroplast membrane photostability in chlPtransgenic tobacco plants deficient in tocopherols. Plant Physiol, 2003, 132: 300-310[本文引用:1]
[19]Bates L, Waldren R, Teare I. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant Soil, 1973, 39: 205-207[本文引用:1]
[20]Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J, 2010, 8: 476-488[本文引用:1]
[21]Chen M K, Hsu W H, Lee P F, Thiruvengadam M, Chen H, Yang C H. The MDAS box gene, FOREVER YOUNG FLOWER, acts as a repressor controlling floral organ senescence and abscission in Arabidopsis. Plant J, 2011, 68: 168-185[本文引用:1]
[22]Li S, Wang X, He S, Li J, Huang Q, Imaizumi T, Qu L, Qin G, Qu L, Gu H. CFLAP1 and CFLAP2 are two bHLH transcription factors participating in synergistic regulation of AtCFL1-mediated cuticle development in Arabidopsis. PLoS Genet, 2016, DOI: DOI:10.1371/journal.pgen.1005744[本文引用:1]
[23]Suh M C, Samuels A, Jetter R, Kunst L, Pollard M, Ohlrogge J, Beisson F. Cuticular lipid composition, surface structure and gene expression in Arabidopsis stem epidermis. Plant Physiol, 2005, 139: 1649-1665[本文引用:1]
[24]Aharoni A, Dixit S, Jetter R, Thoenes E, Arkel G, Pereira A. The SHINE clade of AP2 domain transcription factors activates wax biosynthesis, alters cuticle properties, and confers drought tolerance when overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell, 2004, 16: 2463-2480[本文引用:1]
[25]Broun P, Pointdexter P, Osborne E, Jiang C Z, Riechmann J L. WIN1, a transcriptional activator of epidermal wax accumulation in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 4706-4711[本文引用:1]
[26]Wang Y H, Wan L Y, Zhang L X, Zhang Z J, Zhang H W, Quan R D, Zhou S R, Huang R D. An ethylene response factor OsWR1 responsive to drought stress transcriptionally activates wax synthesis related genes and increases wax production in rice. Plant Mol Biol, 2012, 78: 275-288[本文引用:2]
[27]Burghardt M, Riederer M. Cuticular transpiration. In: Riederer M, ed. Biology of the Plant Cuticle. Oxford: Blackwell Publishing, 2006. pp 292-311[本文引用:1]
[28]Mamrutha H M, Mogili T, Lakshmi K J, Rama N, Kosma D, Udaya-Kumar M, Jenks M A, Nataraja K N. Leaf cuticular waxamount and crystal morphology regulate post-harvest water loss in mulberry (Morus species). Plant Physiol Biochem, 2010, 48: 690-696[本文引用:1]
[29]Park J P, Jin P, Yoon J M, Yang J, Jeong H J, Ranathunge K, Schreiber L, Franke R, Lee I J, An G. Mutation in Wilted Dwarf and Lethal 1 (WDL1) causes abnormal cuticle formation and rapid water loss in rice. Plant Mol Biol, 2010, 74: 91-103[本文引用:1]
[30]Oliveira A, Meirelles S T, Salatino A. Epicuticular waxes fromcaatinga and cerrado species and their efficiency against water loss. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, 2003, 75: 431-439[本文引用:1]
[31]Islam M A, Du H, Ning J, Ye H Y, Xiong L Z. Characterization of glossyl-homologous genes in rice involved in leaf wax accumulation and drought resistance. Plant Mol Biol, 2009, 70: 443-456[本文引用:1]
[32]Mao B G, Cheng Z J, Lei C L, Xu F H, Gao S W, Ren Y L, Wang J L, Zhang X, Wang J, Wu F, Guo X P, Liu X L, Wu C Y, Wang H Y, Wan J M. Wax crystal-sparse leaf2, a rice homologue of WAX2/GL1, is involved in synthesis of leaf cuticular wax. Planta, 2012, 235: 39-52[本文引用:1]
[33]Weng H, Molina I, Shockey J, Browse J. Organ fusion and defective cuticle function in a lacs1 lacs2 double mutant of Arabidopsis. Planta, 2010, 231: 1089-1100[本文引用:1]
相关话题/植物 基因 生物 水稻 蜡质
闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍤勯柛顐ｆ礀缁犵娀鏌熼崜褏甯涢柛瀣ㄥ€濋弻鏇熺箾閻愵剚鐝旂紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娆撴煟閹寸倖鎴﹀煕閹扮増鍊垫慨姗嗗墻閻撳ジ鏌″畝瀣М鐎殿噮鍣ｅ畷鎺戭潩椤掆偓椤棝姊虹拠鎻掝劉缁炬澘绉撮悾婵嬪箹娴ｆ瓕鎽曞┑鐐村灦鑿ら柡瀣捣閳ь剙绠嶉崕閬嶅箠鎼淬垺鍙忛幖娣妽閳锋垿寮堕悙鏉戭€滄い鏂款樀閺岋繝宕ㄩ姘ｆ瀰濡ょ姷鍋涢崯浼村箲閸曨厽鍋橀柍鈺佸枤濞兼棃姊洪崫鍕垫Ц闁绘鍟村鎻掆槈濮橆厽娈伴梺闈浤涢崨顖ょ闯濠电偠鎻徊鑲╁垝濞嗘挸浼犻柧蹇撴贡绾惧ジ鎮归崶顏勭毢濠⒀勬礋閺岋綁鏁愰崨顓熜╁銈庡亝缁诲嫰骞戦崟顖氫紶闁告洦鍠掗崑鎾诲锤濡や讲鎷洪梺鍛婄箓鐎氼參宕掗妸鈺傜厱闁靛ǹ鍎洪悡鑲┾偓瑙勬穿缂嶄線鐛崶顒佸亱闁割偁鍨归獮妤呮⒒娴ｈ櫣甯涢柨姘扁偓娈垮枛閻栧ジ鐛弽顓炵疀妞ゆ帒顦遍崬鐢告偡濠婂啰鐏遍柛鎺撳笒閳诲酣骞橀搹顐Ｐ氶梻渚€娼х换鍫ュ磹閺嶎厼鍚归柛鎰靛枟閻撳啴鏌涘┑鍡楊仼闁逞屽墯閹倿骞嗛崘顕呮晝闁挎棁袙閹锋椽姊洪崨濠勨槈闁挎洏鍎插鍕礋椤栨稓鍘遍梺鍦亾濞兼瑩宕ú顏呯厵妞ゆ梹鏋婚懓鎸庮殽閻愬弶鍠橀柟顔ㄥ洤閱囨慨姗嗗幖椤忓綊姊婚崒娆戭槮闁硅绻濋獮鎰板幢濞戞ḿ顦ㄩ悷婊冪Ч钘熸慨妯垮煐閳锋垶鎱ㄩ悷鐗堟悙闁绘帗妞介弻娑㈠Ω閵堝懎绁銈冨灪瀹€鎼併€佸鈧幃銏＄瑹椤栨盯鏁滈梻鍌欑閹诧紕绮欓幋锔芥櫇闁靛／鍛槸闂佹悶鍎崝濠冪濠婂牊鐓欓柟浣冩珪濞呭懘鏌ｈ箛濠冩珕妞ゃ劊鍎甸幃娆忣啅椤旂厧澹庢繝娈垮枛閿曘儱顪冮挊澶屾殾婵°倕鎳忛崑鍌炲箹缁厜鍋撻幍鎸庡灴濮婄粯鎷呯憴鍕哗闂佹悶鍔忛崑鎰閹间緡鏁傞柛顐ｆ儕閿曞倹鐓欓柟娈垮枛椤ｅジ鏌￠崨顔藉€愰柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦40%闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗ù锝夋交閼板潡寮堕崼姘珔闁搞劍绻冮妵鍕冀椤愵澀绮剁紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娑氣偓骞垮劚妤犳悂鐛弽顓熺厱闁靛ǹ鍎遍埀顒€缍婇獮鍫ュΩ閵夊海鍠栧畷绋课旈埀顒勫箺閻㈠憡鐓熼煫鍥ㄦ尵缁犱即鎮楀☉鎺撴珚妤犵偛鐗撴俊鎼佸Ψ鎼达絽鏋涚€规洖缍婇、娆撳箚瑜嶇紓姘舵⒒娴ｇ瓔鍤欑紒缁樺姇闇夋慨姗嗗幘椤╁弶銇勮箛鎾跺闁藉啰鍠栭弻鏇熺箾閸喖濮夊┑鈩冨絻閻楁捇寮昏缁犳盯鏁愰崨顒傜泿婵＄偑鍊曟蹇涘箯閿燂拷
闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勬噴褰掑炊椤掑﹦绋忔繝銏ｆ硾椤戝洭銆呴幓鎹楀綊鎮╁顔煎壈缂備讲鍋撳璺哄閸嬫捇宕楁径濠佸闂備線鈧偛鑻晶浼存煕閹烘挸绗ч柟椋庡Т椤斿繘顢欓崗鐓庘偓顖炴⒒娴ｈ鍋犻柛搴灦瀹曟繂鐣濋崟顒€鍓銈嗗姀閹冲洭寮ㄩ懞銉ｄ簻闁哄啫娴傚ḿ锛勬喐閻楀牆绗掗柡鍕╁劦閺屸€愁吋鎼粹€茬暗闂佺粯甯掗敃銉╁Φ閸曨喚鐤€闁规崘娉涢·鈧梻浣虹帛閹歌崵绮欓幋锔光偓锔炬崉閵婏箑纾梺缁樼濞兼瑦瀵奸幇鐗堚拺闁告繂瀚ˉ鐘绘煕閻樺啿濮夐柟骞垮灩閳藉鈻庤箛鏇犵嵁婵犵妲呴崹浼村箹椤愩倗灏电€广儱妫涚弧鈧紒鍓у閿氬褎鐓￠弻鐔虹矙閸喗姣愰梺浼欑悼閸忔﹢鐛幒妤€绠ｉ柡鍐ｅ亾闁哄倵鍋撻梻鍌欑缂嶅﹪宕戞繝鍥х婵﹢顤傞弫濠囨煛閸モ晛浜归柡鈧禒瀣厽闁归偊鍓氶埢鏇㈡煕閵堝洤鏋庨柍瑙勫灴椤㈡稑顫濋悡搴㈩啀缂傚倷娴囨禍顒勫磻閵堝鏄ラ柍褜鍓氶妵鍕箳閹存繍浠鹃梺缁樻尭缁绘﹢寮诲☉銏犵労闁告劗鍋撻悾鍫曟⒑閸濆嫭锛旂紒鎻掓健閸┾偓妞ゆ帒鍠氬ḿ鎰箾濞村娅囩紒杈╁仦缁楃喖鍩€椤掑嫬违濞达絿纭跺Σ鍫ユ煏韫囧ň鍋撻弬銉ヤ壕闁绘垼濮ら悡鍐级閻愰潧顣兼い锕€鍢查…璺ㄦ喆閸曨剛顦ラ梺瀹狀潐閸ㄥ潡銆佸▎鎾村剹妞ゆ劦鍋傜花钘夘熆鐟欏嫭绀嬫い銏★耿閹晠宕楅崫銉ф喒闂傚倷绀侀幖顐ょ矙娓氣偓閹﹢骞囬悧鍫濅画闂佸綊娼ч崯鍧楁偋濮樿埖鈷戦柛娑橈攻婢跺嫰鏌涚€ｎ亝顥㈡い銏＄墵瀹曠喖顢楅崒婊庡晭闂佽娴烽弫鍛婄仚閻庢稒绻堝铏圭磼濮楀棙鐣剁紓浣虹帛鐢帒宓勯梺鍦濠㈡ḿ鐚惧澶嬬厱妞ゆ劧绲跨粻妯汇亜閹惧瓨銇濇慨濠呮缁辨帒螣韫囷絼閭柟顔矫～婵堟崉閾忓湱鏆伴梻浣瑰缁诲倿藝娴兼潙鐓曢柟鐑樺灟閳ь剚甯掗～婵嬵敆娴ｈ鍊峰┑鐐茬摠缁秶鎹㈤崼銉ヨ摕闁挎稑瀚▽顏堟偣閸ャ劌绲绘い顒€顑呴埞鎴︽倷閸欏妫戦梺鎼炲妺缁瑩鐛崘銊㈡瀻闁瑰瓨鏌ㄦ禍楣冩煟閵忋垺鏆╅柕鍡楋躬閺岋紕鈧綆鍋嗘晶鍨叏婵犲懏顏犵紒杈ㄥ笒铻ｉ柧蹇涒偓娑欘敇闂備浇妫勯崯瀛樼閸洖钃熼柣鏂垮悑閸嬵亝銇勯弽銊ф噧闁诡垰鐗忕槐鎾存媴娴犲鎽甸柣銏╁灙閳ь剚鍓氶崵鏇熴亜閺囨浜鹃梺绯曟杹閸嬫挸顪冮妶鍡楃瑨閻庢凹鍙冨畷鎴︽晸閻樺磭鍙嗛梺鍝勫暙閸婂憡绂嶆ィ鍐╃厸闁糕剝岣块惌宀勬煙閸欏鍊愰柟顔ㄥ洤閱囨繝闈涚墱閸庡矂鏌ｆ惔銈庢綈闁规悂顥撳▎銏狀潩鐠洪缚鎽曞┑鐐村灍閹冲洭鍩€椤掑﹦鐣垫鐐差儏閳规垿宕堕埡浣芥嫬闂傚倸鍊风粈渚€骞夐敓鐘冲殞濡わ絽鍟粻鐘诲箹濞ｎ剙濡界紒鐘冲浮濮婄粯鎷呯粙鎸庡€紓浣风劍閹稿啿顕ｉ幓鎺嗘婵犙勫劤瑜版椽姊婚崒姘偓椋庢濮樿泛鐒垫い鎺戝€告禒婊堟煠濞茶鐏￠柡鍛埣椤㈡盯鎮欑划瑙勫闂備礁鍚嬫禍浠嬪磿闁秴鐓曞┑鍌涚箓閳规垿鎮╅崹顐ｆ瘎闂佺ǹ顑囬崑娑樼幓閸喒鏋庨柟鎯х枃琚濋梺璇插嚱缂嶅棝宕板Δ鍛惞閻忕偠濞囬弮鍫熸櫜闁告侗鍘藉▓顓犵磽娴ｅ搫啸闁哥姵鐗犲濠氭偄閻撳海鐣鹃梺缁橆殔閻楁粌螞閸曨垱鈷戦悹鍥皺缁犵儤绻涢崨顔界闁瑰箍鍨归埞鎴犫偓锝庝簻閻庮厼顪冮妶鍡楀Ё缂佽弓绮欏鍐参旈崘顏嗭紳婵炶揪绲捐ぐ鍐╃閻愵剛绡€闁靛骏绲介悡鎰版煕閺冣偓閻楃娀骞冮敓鐘冲亜闁稿繗鍋愰崢鎾绘偡濠婂嫮鐭掔€规洘绮岄埢搴ㄥ箛椤忓棛鐣惧┑鐐差嚟婵挳顢栭崱娑欏亗闁哄洢鍨洪悡鍐煕濠靛棗顏╅柍褜鍓濋褏鍙呴梺鍦檸閸犳鎮″☉銏″€堕柣鎰硾琚氶梺闈╃秬椤濡甸崟顖ｆ晝闁挎繂娲ㄩ悾鐢告⒑娴兼瑧鎮奸柛蹇斆悾鐑藉醇閺囩偟鍘搁梺鍛婂姀閺呮粓鎯侀幒妤佲拻闁稿本鐟︾粊鎵偓瑙勬礀閻忔岸骞堥妸鈺佺骇闁圭偨鍔嶅鑺ヤ繆閸洖閱囨繛鎴烆殕閻繘姊绘担铏瑰笡闁告梹娲熼獮鏍敃閿旇棄娈濋柣鐔哥懃鐎氥劍绂嶅⿰鍫熺厵闁绘垶锚閻忋儵鏌嶈閸撴瑧绱炴繝鍌滄殾闁瑰瓨绻嶅ḿ銊╂煃瑜滈崜鐔奉嚕婵犳艾鍗抽柣鏃囨椤旀洟鎮峰⿰鍐ら柍褜鍓氶崙褰掑闯閿濆拋鍤曢柟鎯板Г閸嬫劗绱撴担楠ㄦ岸骞忓ú顏呪拺闁告稑锕﹂埥澶愭煥閺囨ê鈧鍒掗銏犵闁规崘灏欑粻姘渻閵堝棗濮х紒鏌ョ畺钘熼柛顐ゅ枍缁诲棙銇勯幇鈺佺仾闁搞倕娲弻娑㈠煛鐎ｎ剛鐦堥悗瑙勬磸閸旀垿銆佸▎鎾崇畾鐟滃秹宕ｆ繝鍥ㄢ拻闁稿本鐟ㄩ崗宀€绱掗鍛仸鐎规洘绻堥弫鍐磼濮橀硸妲舵繝鐢靛仜濡瑩宕濋弴鐘愁偨闁绘劗顣介崑鎾荤嵁閸喖濮庡銈忕細閸楁娊骞冮垾鏂ユ瀻闁圭偓娼欓埀顒€鐏氱换娑㈠箣閻愬灚鍠楃紓鍌氬€归懝楣冣€﹂懗顖ｆ闂佸憡鎸鹃崰鏍ь嚕婵犳碍鍋勯柛蹇曞帶閸擃剟姊洪崨濠勭細闁稿骸鐤囬埅闈涒攽鎺抽崐妤佹叏閻戣棄纾绘繛鎴欏灪閻撯偓闂佹寧绻傚Λ鏃傛崲閸℃稒鐓熼柟杈剧稻椤ュ骞嗛悢鍏尖拺闂傚牊渚楀褍鈹戦垾铏缂佸倸绉撮悾锟犲箥閾忣偅鏉搁梻浣虹帛閸旀牕岣垮▎鎾村€堕柨鏃囧Г閸欏繐鈹戦悩鎻掝仾闁搞倐鍋撴俊鐐€ら崢濂告倶濠靛缍栨繝濠傜墕閻掑灚銇勯幒鎴濐伀鐎规挷绶氶弻娑㈠箛閳轰礁顥嬮梺鍝勫暙閻楀棗顔忓┑鍥ヤ簻闁哄啫娲よ闂佺粯绻嶉崑濠囧蓟閿濆棙鍎熼柍銉ュ暱鏉堝懘姊虹粙娆惧剱闁圭懓娲璇测槈閵忕姷鐤€濡炪倖鎸鹃崑娑欐叏閵忕姭鏀介柣鎰皺婢с垽鏌涚€ｎ偅灏甸柟骞垮灩閳藉顫濋敐鍛闂佹眹鍨诲▍銉ㄣ亹閹烘繃鏅涢梺瑙勫劤婢у海澹曢悾灞稿亾楠炲灝鍔欑紒鈧担鍦洸濡わ絽鍟埛鎺戙€掑锝呬壕濠电偘鍖犻崗鐐☉铻栭柛娑卞幘閺屽牓姊洪崷顓℃闁哥姵鐗滅划濠氭偐缂佹ḿ鍘棅顐㈡处濞叉牕鏆╅梻浣告惈濡顢栨径鎰摕闁斥晛鍟欢鐐哄箹濞ｎ剙鐏柕鍡楋躬濮婅櫣鎷犻垾铏彲闂佺懓鍤栭幏锟�40%闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗ù锝夋交閼板潡寮堕崼姘珔闁搞劍绻冮妵鍕冀椤愵澀绮剁紓浣插亾濠㈣埖鍔栭悡娑氣偓骞垮劚妤犳悂鐛弽顓熺厱闁靛ǹ鍎遍埀顒€缍婇獮鍫ュΩ閵夊海鍠栭獮鎰償閿濆啠鍋撻幇鏉跨骇闁冲搫鍊荤粻鐐存叏婵犲懏顏犵紒顔界懇楠炴劖鎯旈姀鈥愁伆缂傚倸鍊峰ù鍥敋瑜忕划鏃堟偡閹殿喗娈鹃梺姹囧灩閹诧繝寮插┑瀣厓鐟滄粓宕滈悢鍑よ€垮〒姘ｅ亾婵﹨娅ｇ槐鎺懳熼崗鐓庢珣闂備胶顢婂▍鏇㈠礉濡ゅ啫鍨濋柡鍐ㄧ墱閺佸棝鏌涢弴銊ュ闁告﹩浜铏瑰寲閺囩偛鈷夊銈冨妼閹虫ê顕ｉ幎鑺ュ亜闁稿繗鍋愰崢鐢告倵閻熸澘顏鐟版缁棃鎮滃Ο闀愮盎闂侀潧绻嗛崺妤咁敂閸繄鍘撮梺纭呮彧缁犳垿鎮欐繝鍕枑婵犲﹤瀚閬嶆煕閳╁啰鈯曢柍閿嬪笒闇夐柨婵嗘噺閸熺偤鏌熼姘卞ⅵ闁哄矉绲借灃濞达綀娅ｉ悡澶愭倵鐟欏嫭绀冪紒顔肩焸閸┿儲寰勯幇顒夋綂闂佺偨鍎遍崢鏍箣闁垮绻嗛柣鎰典簻閳ь剚鐗犻幃褍螖閸愵亞鐓撻梺鍦亾閻綊鍩€椤掆偓閹虫﹢骞冨⿰鍫熷殟闁靛鍎伴崠鏍р攽閻愯埖褰х紒韫矙楠炴饪伴崼鐔告珫閻庡箍鍎卞ú銊у閻撳寒鐔嗛悹铏瑰皑閸旂喎霉閻橆喖鐏叉俊顐＄劍瀵板嫮鈧綆鍓涢惁鍫ユ偡濠婂啰绠查柟渚垮姂楠炴﹢顢欓懖鈺傜劸婵＄偑鍊栭悧婊堝磻濞戞氨涓嶆慨妯垮煐閻撴洜鈧厜鍋撻柍褜鍓熷畷鎴︽倷閻戞ê浜楅梺闈涱檧婵″洨绮绘ィ鍐╃厵閻庣數枪閳ь剚鍨垮畷鐑筋敇濞戞ü澹曞┑顔矫畷顒勩€傞懖鈺冪＜缂備焦岣垮ú鎾煙椤旂懓澧查柟顖涙閸┿儵宕卞Δ鈧敮缂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓瀹曟劙宕妷褏鐓嬮悷婊呭鐢洭鍩€椤戣法绐旂€殿喗鎸虫慨鈧柣娆屽亾婵炵厧锕铏圭磼濡墎绱伴梺杞扮劍閻℃洟鍩呴敓锟�9闂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍤勯柛顐ｆ磸閳ь兛鐒︾换婵嬪炊瑜庡Σ顒勬⒑閸濆嫮鈻夐柛鎾寸懅缁辩偛顫滈埀顒€顫忕紒妯肩懝闁逞屽墴閸┾偓妞ゆ帒鍊告禒婊堟煠濞茶鐏￠柡鍛埣椤㈡岸鍩€椤掑嫬钃熸繛鎴炵懅缁♀偓闂佸憡鍔忛弲娑㈠焵椤掍礁濮嶉柡宀€鍠栭、娑橆潩椤掍焦顔掑┑鐘愁問閸犳帡宕戦幘缁樷拺闂傚牊绋撴晶鏇㈡煙閾忣偄濮嶉挊婵囥亜閹板爼妾柍閿嬪灩缁辨帡顢涘☉娆戭槬婵犫拃鍐ㄧ骇缂佺粯鐩幊鐘活敆閳ь剟寮稿☉銏＄厵妞ゆ洖妫涚弧鈧梺绯曟櫔缁绘繂鐣烽妸鈺婃晩閻熸瑥瀚褰掓⒒閸屾瑧顦﹂柟璇х節楠炴劙宕卞☉妯碱槰閻熸粌绉硅棢婵ǹ鍩栭埛鎴炴叏閻熺増鎼愰柣鎺撴そ閺屾盯濡搁埡鈧幉鐐殽閻愭潙濮嶉柟鐓庣秺椤㈡洟鏁嶉崟顓犳毎闂備浇顕х€涒晝绮欓幒鏇熸噷濠电姵顔栭崹閬嶅箰閹惰棄绠栫€瑰嫭澹嬮弸搴ㄧ叓閸ャ劍鎯勫ù鐘层偢濮婂宕掑顑跨敖闂佹悶鍔忓▔娑綖韫囨稒鎯為悷娆忓閸樺綊姊洪崨濠佺繁闁搞劋鍗抽幃褍顫濋懜纰樻嫼缂備礁顑呭ḿ锟狀敁濡ゅ啠鍋撶憴鍕闁告挾鍠庨敃銏℃媴缁洘鏂€濡炪倖鏌ㄩ～鏇熺濠婂牊鐓曢悗锝庡亝瀹曞矂鏌″畝鈧崰鏍€佸▎鎾澄╅柕澶涢檮閹瑩姊虹紒妯哄闁挎洦浜璇差吋婢跺﹣绱堕梺鍛婃处閸嬪懎鈻撻弻銉︹拺閻犲洠鈧磭浼堢紓鍌氱С缁€渚€锝炶箛鎾佹椽顢旈崟顓у敹闂佺澹堥幓顏嗗緤閸濆嫀锝夊醇閵夛腹鎷洪梺绋跨箰閸氬濡甸悢鍏肩厱闁靛ě鍕瘓婵犵绱曢弫濠氱嵁閸ヮ剙绾ч悹渚厜缁辨煡姊绘担铏瑰笡闁告梹岣挎禍绋库枎閹惧秴娲、鏇㈡晜鐟欙絾瀚奸梻浣告啞缁诲倻鈧艾鍢插嵄閻熸瑥瀚ㄦ禍婊堟煙鐎电ǹ浠ч柟鍐叉川閳ь剝顫夊ú妯兼崲閸繄鏆﹂柕濞р偓閸嬫挸鈽夊▎瀣窗闂佸憡蓱閹倿骞冨Δ鍐╁枂闁告洦鍓欓棄宥夋⒑閸涘﹦绠撻梺甯到閻ｇ兘骞囬弶璇狙冾熆鐠虹尨鍔熼柡灞界墦濮婃椽宕滈幓鎺嶇按闂佺ǹ瀛╅悡锟犲箖閿熺姴鍗抽柣妯哄暱閺嬫垿鏌熼懝鐗堝涧缂佹彃娼￠幆灞解枎閹捐泛褰勯梺鎼炲劘閸斿酣鍩ユ径鎰厽闁圭儤鍨规禒娑㈡煏閸パ冾伃妤犵偛顑夐弫鎰板川椤撶倫銉╂⒒娴ｅ懙鍦崲閹版澘瀚夋い鎺戝€瑰畷鍙夌箾閹存瑥鐏╃€瑰憡绻冮妵鍕箛閳轰胶浠煎銈庡墮椤﹂潧顫忛搹瑙勫珰闁炽儱纾禒顓炩攽閳藉棗浜滈柛鐔告綑椤曪綁顢曢敃鈧粈鍐煃閸濆嫬鈧悂顢撻幘鍓佺＝濞达絽澹婇崕鎾寸箾婢跺绀冪紒鍌涘浮椤㈡﹢濮€閳锯偓閹风粯绻涙潏鍓у埌闁硅绻濆畷顖炴倷閻戞ḿ鍘介梺闈涒康婵″洭鎯岀€ｎ喗鐓欑€瑰嫮澧楅崵鍥殽閻愬瓨宕屾鐐村笒椤撳ジ宕担璇℃％婵犵數濮烽弫鎼佸磻閻樿绠垫い蹇撴缁€濠傘€掑锝呬壕閻庢鍠楅悡锟犲箠閻樻椿鏁嗛柛鎰╁壉閿熺姵鈷戦悷娆忓閸旇泛鈹戦鍝勨偓婵嬪箖閿熺姴鍗抽柣鏂垮缁犳岸姊洪棃娑氬閻庢凹鍣ｈ棟闁挎洖鍊归悡娆撴煕韫囨挸鎮戦柛濠冨姍閺岋紕浠﹂悾灞濄儲銇勮缁舵岸寮诲☉婊呯杸闁哄啫鍊堕埀顒佸笧缁辨帡顢欓懖鈺侇杸闂佺懓鍢查幊妯虹暦閻戠瓔鏁囩憸搴ㄦ煥閵堝鈷掑ù锝呮啞閹牊绻涚仦鍌氬鐎规洑鍗抽獮妯兼嫚閼碱剙骞嬮柣搴＄畭閸庨亶藝椤栨粎涓嶉柟鎯板Г閻撴瑩鏌熼婊冾暭妞ゃ儱顦甸弻锝夊箳閹寸姳绮甸梺闈涙搐鐎氫即鐛€ｎ亖鏀介柛顐ｇ矎濡炬悂姊绘担鍛靛綊鏁冮妷銉庯絿鈧綆鍓涚壕浠嬫煕鐏炴崘澹橀柍褜鍓熼ˉ鎾跺垝閸喓鐟归柍褜鍓欓锝夋偨閸撳弶鏅㈤梺閫炲苯澧撮柍銉︽瀹曟﹢顢欓挊澶屾濠电姰鍨归崢婊堝疾濠婂牊鍎庢い鏍ㄦ皑閺嗭妇绱掔€ｎ収鍤﹂柡鍐ㄧ墕閻掑灚銇勯幒鎴濇殶缂佺姾濮ょ换婵嬫偨闂堟稐鍝楅梺瑙勬た娴滅偟妲愰悙鍝勭劦妞ゆ帊鑳剁粻楣冩煕濠婂啫鏆熺紒澶樺枤閳ь剝顫夊ú鈺冪礊娓氣偓瀹曟椽鍩€椤掍降浜滈柟鍝勭Х閸忓瞼绱掗悩鑽ょ暫闁哄瞼鍠撻埀顒傛暩鏋ù鐙呯畵閺岋綁骞橀崡鐐插Б缂備浇椴哥敮鈩冧繆閹间焦鏅滃┑顔藉姃閾忓酣姊绘担铏广€婇柡鍌欑窔瀹曟垿骞橀幇浣瑰瘜闂侀潧鐗嗗Λ妤呮倶閿曞倹鍊电紒妤佺☉閹虫劙鎯岄崼婢濆綊鎮℃惔锝嗘喖闂佺粯鎸鹃崰鎰板Φ閸曨喚鐤€闁圭偓娼欏▍銈夋煟韫囨捇鐛滅紒鐘虫崌瀵鎮㈢喊杈ㄦ櫓闂佸吋浜介崕顖涚閵忋倖鈷戦弶鐐村閸斿秹鏌涢弮鈧悷銉╂偩閻戣棄閱囬柡鍥╁仧閸樻悂姊虹粙鎸庢拱缂佸鍨垮畷婵嗩潨閳ь剙顫忔繝姘＜婵炲棙鍩堝Σ顕€姊虹涵鍜佸殝缂佺粯绻堥獮濠傗攽鐎ｎ亞顦悷婊冾樀瀹曟垿骞橀幇浣瑰兊闂佺粯鎸告鎼佸煕鐎ｎ偆绡€缁炬澘顦辩壕鍧楁煛娴ｇ瓔鍤欓柣锝囧厴瀹曞ジ寮撮妸锔芥珜闂備胶枪閺堫剙顫濋妸鈺佄ч柨鏇炲€归埛鎺懨归敐鍛暈闁哥喓鍋ら弻娑㈠籍閳ь剟鎮ч悙鍝勎﹂柟鐗堟緲缁€鍐┿亜閺冨倹娅曢柛妯诲姍濮婄粯绗熼崶褍顫╃紓浣割槺閺佸骞冮檱缁犳稑鈽夊▎鎴濆箞闂備礁鐤囧Λ鍕涘Δ鍛祦婵°倕鎳忛崐鍨叏濡厧浜鹃悗姘炬嫹

Free考研考试FreeKaoYan.Com
欢迎来到Free考研考试，"为实现人生的Free而奋斗"

© 2020 FreeKaoYan! . All rights reserved.