昝逢刚, 吴才文, 陈学宽, 赵培方, 赵俊, 刘家勇^*
云南省农业科学院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远661699
^* 通讯作者(Corresponding author): 刘家勇, E-mail:lljjyy1976@163.com 收稿日期:2014-07-06 基金:本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20-1-1), 云南省应用基础研究面上项目(2010CD003)和云南省重点新产品开发计划项目(2012BB014)资助;

摘要采用AFLP标记技术, 对来自中国、澳大利亚、美国、菲律宾、巴西和法国的118份甘蔗种质进行遗传多样性分析。采用10对引物组合共扩增出1310条谱带, 其中多态性条带为1195条, 多态性条带比率为91.2%。118份种质间的相似性系数在0.583~0.929之间, 平均为0.750, 多态信息量为0.2332, 每个位点的有效等位基因数为1.3789。结果显示在相似性系数0.69处切割时, 可划分为2个类群, 第I类群包括粤糖00-236、云蔗04-622和SP80-1816; 第II类群有115份种质, 在相似性系数0.74处切割时, 可将第II类群划分为5个亚群。各国甘蔗种质亲缘关系较近, 其中美国种质遗传多样性相对较丰富。

关键词:甘蔗; 种质; AFLP; 遗传多样性
Genetic Diversity of 118 Sugarcane Germplasm Using AFLP Markers
ZAN Feng-Gang, WU Cai-Wen, CHEN Xue-Kuan, ZHAO Pei-Fang, ZHAO Jun, LIU Jia-Yong^*
Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 616699, China
Fund:
AbstractAFLP markers were used to assess the genetic diversity of 118 sugarcane germplasm from China, Australia, USA, Philippines, Brazil, and France. A total of 1310 bands were amplified with ten pairs of primers, 1195 of which were polymorphic bands, the percentage of polymorphic loci was 91.22%. The genetic similarity coefficient among 118 sugarcane germplasm ranged from 0.583 to 0.929 with an average of 0.750, the polymorphism information content was 0.2332, and the effective number of alleles per loci was 1.3789. The results showed 118 germplasm were divided into two groups at 0.69 of the similarity coefficient. The group I consisted of YT00-236, YZ04-622, and SP80-1816, which shared lower genetic similarity with the rest of 115 germplasm in another group. The 115 germplasm were divided into five sub-groups at 0.74 of the similarity coefficient. The sugarcane germplasm shared high genetic similarity among countries, and there existed much higher genetic diversity within germplasm introduced from USA.

Keyword:Sugarcane; Germplasm; AFLP; Genetic diversity
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甘蔗蔗糖产量约占我国食糖总量的92%, 具有遗传多样性的甘蔗种质资源是甘蔗杂交育种的基础。目前, 甘蔗种质直接用于杂交利用较为普遍, 且作用巨大, 国外种质资源在我国杂交育种中也具有更重要的作用, 我国利用引进种质Co419、CP49-50、NCo310^{[ 1]}和CP72-1210^{[ 2]}, 分别育成了24、26、27和12个优良品种。甘蔗优良品种选育的主要途径是杂交育种, 组合选配则是选育优良品种成败的关键, 组合选配得好, 其后代就会出现较多的优良变异, 就有可能选育出新的优良品种, 因此研究不同种质的遗传关系对组合选配具有重大意义。表型性状极易受环境因素影响而变化, 仅依靠表型性状难以准确反映不同材料间的遗传差别和亲缘关系^{[ 3, 4]}。品种系谱虽然在一定程度上能反映品种之间的亲缘关系, 但由于自交、串粉等因素, 存在一定的局限性^{[ 5, 6, 7]}, 基于分子水平的亲缘关系较基于系谱的亲缘关系具有更高的可靠性^{[ 8, 9]}。
AFLP标记技术综合了RFLP和RAPD的优点, 既具有RFLP的稳定性和PCR反应快速、灵敏的特点, 又具有RAPD的方便性, 同时还克服了RFLP和RAPD的缺点^{[ 10]}。由于AFLP标记多态性强, 结果稳定, 重复性好, 是一种理想、有效的遗传标记, 近年被广泛用于农作物的遗传多样性、遗传图谱、基因定位、指纹图谱等研究^{[ 3, 4, 11, 12]}。李鸣等^{[ 13]}采用AFLP技术, 用5对引物扩增在生产上广泛推广的2个甘蔗品种, AFLP指纹图谱分析区分率达100%。庄南生等^{[ 8]}采用AFLP分子标记技术分析54份甘蔗种质(14份祖亲种、40份栽培品种或品系)的遗传基础, 利用筛选出的4对多态性较强的引物组合, 构建了甘蔗54份种质的AFLP指纹图谱。刘新龙等^{[ 14]}采用SSR和AFLP标记技术, 对构建的2个群体进行PCR扩增和分子遗传连锁分析,构建了甘蔗分子遗传连锁图谱。本文基于AFLP分子标记, 分析国内外118份甘蔗种质的遗传多样性, 旨在明确种质间的亲缘关系, 为甘蔗种质的杂交利用和种质创新提供参考依据。
1 材料与方法1.1 试验材料118份种质采自云南省农业科学院甘蔗研究所的国家甘蔗种质资源圃, 其中中国33份, 澳大利亚19份, 美国16份, 菲律宾22份, 巴西13份, 法国15份(表1)。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 试验种质名称及来源 Table 1 Name and origin of germplasm used in the experiment 序号 No. 名称 Name 来源 Origin 序号 No. 名称 Name 来源 Origin 1 ROC16 中国 China 60 SP83-2847 巴西 Brazil 2 ROC22 中国 China 61 SP84-1431 巴西 Brazil 3 赣蔗8号 Ganzhe 8 中国 China 62 SP84-5560 巴西 Brazil 4 粤糖00-236 Yuetang 00-236 中国 China 63 FR00-183 法国 France 5 粤糖79-177 Yuetang 79-177 中国 China 64 FR00-188 法国 France 6 粤糖86-368 Yuetang 86-368 中国 China 65 FR00-247 法国 France 7 粤糖93-159 Yuetang 93-159 中国 China 66 FR83-1248 法国 France 8 云蔗01-1413 Yunzhe 01-1413 中国 China 67 FR94-498 法国 France 9 云蔗02-2332 Yunzhe 02-2332 中国 China 68 FR96-034 法国 France 10 云蔗02-2511 Yunzhe 02-2511 中国 China 69 FR96-053 法国 France 11 云蔗03-194 Yunzhe 03-194 中国 China 70 FR96-416 法国 France 12 云蔗03-258 Yunzhe 03-258 中国 China 71 FR96-428 法国 France 13 云蔗03-332 Yunzhe 03-332 中国 China 72 FR97-031 法国 France 14 云蔗03-45 Yunzhe 03-45 中国 China 73 FR98-053 法国 France 15 云蔗04-241 Yunzhe 04-241 中国 China 74 FR98-073 法国 France 16 云蔗04-321 Yunzhe 04-321 中国 China 75 FR99-244 法国 France 17 云蔗04-403 Yunzhe 04-403 中国 China 76 FR99-307 法国 France

表1 试验种质名称及来源 Table 1 Name and origin of germplasm used in the experiment

(续表1)
Table 1(Continued)
(续表1)(Table 1(Continued))

(续表1) 试验种质名称及来源 Table 1(Continued) Name and origin of germplasm used in the experiment 序号 No. 名称 Name 来源 Origin 序号 No. 名称 Name 来源 Origin 18 云蔗04-488 Yunzhe 04-488 中国 China 77 FR99-378 法国 France 19 云蔗04-621 Yunzhe 04-621 中国 China 78 Q107 澳大利亚 Australia 20 云蔗04-622 Yunzhe 04-622 中国 China 79 Q120 澳大利亚 Australia 21 云蔗04-649 Yunzhe 04-649 中国 China 80 Q127 澳大利亚 Australia 22 云蔗04-724 Yunzhe 04-724 中国 China 81 Q158 澳大利亚 Australia 23 云蔗05-181 Yunzhe 05-181 中国 China 82 Q162 澳大利亚 Australia 24 云蔗05-197 Yunzhe 05-197 中国 China 83 Q171 澳大利亚 Australia 25 云蔗05-66 Yunzhe 05-66 中国 China 84 Q174 澳大利亚 Australia 26 云蔗06-102 Yunzhe 06-102 中国 China 85 Q182 澳大利亚 Australia 27 云蔗06-267 Yunzhe 06-267 中国 China 86 Q188 澳大利亚 Australia 28 云蔗06-407 Yunzhe 06-407 中国 China 87 Q192 澳大利亚 Australia 29 云蔗89-7 Yunzhe 89-7 中国 China 88 Q195 澳大利亚 Australia 30 云蔗94-343Yunzhe 94-343 中国 China 89 Q196 澳大利亚 Australia 31 云蔗94-375 Yunzhe 94-375 中国 China 90 Q197 澳大利亚 Australia 32 云蔗99-596 Yunzhe 99-596 中国 China 91 Q198 澳大利亚 Australia 33 云蔗99-91 Yunzhe 99-91 中国 China 92 Q199 澳大利亚 Australia 34 CP33-310 美国 USA 93 Q202 澳大利亚 Australia 35 CP67-412 美国 USA 94 Q207 澳大利亚 Australia 36 CP81-1302 美国 USA 95 Q209 澳大利亚 Australia 37 CP81-1405 美国 USA 96 Q88 澳大利亚 Australia 38 CP85-1382 美国 USA 97 VMC73-229 菲律宾 Philippines 39 CP86-1633 美国 USA 98 VMC81-202 菲律宾 Philippines 40 CP86-1644 美国 USA 99 VMC84-549 菲律宾 Philippines 41 CP88-1546 美国 USA 100 VMC87-599 菲律宾 Philippines 42 CP88-1834 美国 USA 101 VMC87-095 菲律宾 Philippines 43 CP89-2143 美国 USA 102 VMC90-239 菲律宾 Philippines 44 CP89-2376 美国 USA 103 VMC93-331 菲律宾 Philippines 45 CP89-2377 美国 USA 104 VMC93-341 菲律宾 Philippines 46 CP92-1641 美国 USA 105 VMC94-050 菲律宾 Philippines 47 CP94-1100 美国 USA 106 VMC94-266 菲律宾 Philippines 48 HOCP96-540 美国 USA 107 VMC95-018 菲律宾 Philippines 49 TCP83-3196 美国 USA 108 VMC95-009 菲律宾 Philippines 50 RB73-2727 巴西 Brazil 109 VMC95-105 菲律宾 Philippines 51 RB73-9735 巴西 Brazil 110 VMC95-262 菲律宾 Philippines 52 RB75-11 巴西 Brazil 111 VMC95-088 菲律宾 Philippines 53 RB83-5054 巴西 Brazil 112 VMC96-134 菲律宾 Philippines 54 RB83-5089 巴西 Brazil 113 VMC96-169 菲律宾 Philippines 55 RB85-5113 巴西 Brazil 114 VMC96-055 菲律宾 Philippines 56 SP80-0185 巴西 Brazil 115 VMC96-060 菲律宾 Philippines 57 SP80-1816 巴西 Brazil 116 VMC96-084 菲律宾 Philippines 58 SP80-3280 巴西 Brazil 117 VMC97-030 菲律宾 Philippines 59 SP81-3250 巴西 Brazil 118 VMC97-041 菲律宾 Philippines

(续表1) 试验种质名称及来源 Table 1(Continued) Name and origin of germplasm used in the experiment

1.2 基因组总DNA的提取从每个材料取5个单株幼嫩叶片混合, 参照吴转娣等^{[ 15]}方法并略加改进提取基因组总DNA, 采用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量和浓度, 将样品稀释到20 ng μL^-1, -20℃保存备用。
1.3 AFLP扩增及检测根据Vos等^{[ 10]}方法进行适当调整, 采用本试验室开发的10对多态性较好的引物构建118份甘蔗种质的AFLP指纹图谱(表2)。基因组DNA经 EcoR I和 Mse I在37℃酶切14 h; 将酶切产物与 EcoR I和 Mse I特定接头在37℃连接2 h, 连接产物稀释10倍作为预扩增模板; EcoR I和 Mse I引物(含1个选择性核苷酸)预扩增的反应条件为94℃ 30 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s, 20个循环。将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增模板, 以含3个选择性核苷酸的 EcoR I和 Mse I引物进行选择性扩增, PCR程序为94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 1个循环, 然后以每循环复性温度逐级降低0.7℃的梯度继续12个循环, 变性和延伸条件同上, 最后以94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s, 23个循环结束。所用PCR仪为德国Eppendorf Master Cycle Gradient。选择性扩增产物经95℃变性10 min后在5%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并参照刘新龙等^{[ 16]}的快速银染法染色。
表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 10对引物组合扩增的AFLP条带 Table 2 Amplification bands with ten pairs of AFLP primer 引物组合 Primer pair 总条带数 Total band number 多态性条带数 Polymorphic band number 多态性比率 Polymorphic rate (%) 多态信息量 Polymorphic Information content 有效等位基因数 Number of effective allele per locus E-ACA/M-CTG 119 99 83.19 0.2138 1.3417 E-ACT/M-CAA 166 161 96.99 0.2530 1.4049 E-AAC/M-CAC 132 126 95.45 0.2438 1.4144 E-ACT/M-CAG 101 86 85.15 0.2454 1.3926 E-ACA/M-CTC 120 108 90.00 0.2142 1.3430 E-ACT/M-CAC 139 135 97.12 0.2547 1.4109 E-AAC/M-CAG 140 131 93.57 0.2142 1.3497 E-ACA/M-CAA 125 119 95.20 0.2670 1.4448 E-ACT/M-CTC 121 102 84.30 0.2183 1.3612 E-ACC/M-CAG 147 128 87.07 0.2075 1.3262 平均Mean 131 119.5 91.22 0.2332 1.3789 总和Total 1310 1195 — — —

表2 10对引物组合扩增的AFLP条带 Table 2 Amplification bands with ten pairs of AFLP primer

1.4 统计分析AFLP扩增条带在相同迁移位置, 有带记为1, 无带记为0。标记位点的多态性条带比率(percentage of polymorphic bands, PPB), PPB= a/( a+ b), 标记位点的多态信息量(polymorphism information content, PIC)按公式PIC=1-∑ p_i 2计算; 标记系统的有效等位基因数(effective number of allele, Ne)按公式 Ne=1/∑ p_i 2计算, p_i表示 i位点的基因频率, 使用POPGEN32软件分析以上数据。同时使用NTSYS pc-V. 2.1计算相似系数, 即 Gs_ij= a/( a+ b+ c), Gs_ij是用来衡量2个体 i和 j的遗传相似性系数的, a为2个体的共享片段数, b和 c为 i个体和 j个体各自拥有的多态片段数。根据相似性系数进行UPGMA聚类分析(un-weighted pair group method analysis)和PCA主效应分析(principal component analysis), 并构建聚类图和主效应图。

2 结果与分析2.1 AFLP扩增条带的多态性采用10对本试验室开发的引物扩增118份参试材料, 扩增片段的大小主要在30~600 bp范围内, 且分布均匀, 共扩增出1310条带, 其中多态性条带1195条, 多态性比率为91.2%; 每个位点的平均多态信息量为0.2332, 每个位点的平均有效等位基因数为1.3789。从AFLP扩增条带的数量看, 中国材料(1189条) >菲律宾材料(1077条) >美国材料(1076条) >巴西材料(1003条) >法国材料(927条) >澳大利亚材料(888条); 从多态性比率看, 中国材料(86.8%) >美国材料(81%) >巴西材料(79.1%) >菲律宾材料(73.6%) >法国材料(69.9%) >澳大利亚材料(67.9%)。说明本研究筛选的10对引物多态性较高(表2)。
2.2 遗传相似性分析参试的118份种质中, 遗传相似性系数在0.583~ 0.929之间, 平均为0.750。遗传相似性系数最高的是RB85-5113和SP80-0185, 达到0.929; 遗传相似性系数最低的是云蔗04-622和CP89-2376, 为0.583。从各国遗传相似性系数看, 澳大利亚材料(0.801)>菲律宾材料(0.775) >法国材料(0.768)>中国材料(0.753)>巴西材料(0.745)>美国材料(0.725)。说明各国种质之间的遗传基础差异较小, 亲缘关系较近, 其中美国种质遗传多样性相对较丰富。
2.3 聚类分析根据遗传相似性系数, 用UPGMA法对118份甘蔗种质进行聚类分析(图1)。从图1可知, 在相似性系数0.69处切割时, 可划分为2个类群, 第I类群有3份种质材料, 包括粤糖00-236、云蔗04-622和SP80-1816, 这3份种质较早地与其他种质分开, 杂交组合选配中重点考虑; 第II类群有115份种质。在相似性系数0.74处切割时, 可将第II类群划分为5个亚群(A、B、C、D和E)。A亚群包含5份中国种质, 分别是ROC16、ROC22、云蔗94-375、云蔗89-7和云蔗94-343; B亚群包含12份美国和22份菲律宾种质; C亚群包含4份美国和19份澳大利亚种质; D亚群包含15份法国种质; E亚群包含26份中国和12份巴西种质。聚类结果表明, 大部分种质亲缘关系较近, 遗传组成相似; 美国种质在聚类中相对较分散, 说明在这118份种质中美国种质多样性相对较丰富; 第I类群和第II类群A亚群共计8份种质较早地和其他110份种质分开, 其中6份种质在中国已作为主要亲本在应用, 并得到了部分优良后代材料, 这6份种质分别是粤糖00-236、ROC16、ROC22、云蔗94-375、云蔗89-7和云蔗94-343; 其他2份种质云蔗04-622和SP80-1816在中国杂交育种中未见应用, 云蔗04-622突出特点为产量高和宿根性强, SP80- 1816为蔗糖分高和抗逆性强, 在杂交中应给予重点关注。
图1
Fig. 1

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图1 118份甘蔗种质材料的AFLP聚类图Fig. 1 Dendrogram of 118 accessions of sugarcane germplasm with AFLP markers

2.4 主效应分析基于Jaccard系数用PCA法对118份甘蔗种质AFLP标记结果进行主效应分析, 显示了不同种质的分类位置(图2)。22份菲律宾种质和12份美国种质位置集中在一起; 15份法国种质位置集中在一起, 这个区域还零星分布1份巴西和6份中国种质; 27份中国和12份巴西种质位置集中在一起; 19份澳大利亚种质和4份美国种质位置集中在一起。分子主效应分析结果与分子聚类结果一致, 集中在一个区域的种质亲缘关系较为紧密。
图2
Fig. 2

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图2 甘蔗种质AFLP主效应分析图■:澳大利亚种质;▲:巴西种质;□:中国种质;●:法国种质;○:菲律宾种质; △: 美国种质。Fig. 2 Principal components analysis of sugarcane germplasm using AFLP data■: Australia germplasm; ▲: Brazil germplasm; □: China germplasm; ●: France germplasm; ○: Philippines germplasm; △: USA germplasm.

3 讨论3.1 AFLP标记在甘蔗遗传多样性研究中的有效性AFLP标记多态性强, 结果稳定, 重复性好, 是一种理想、有效的遗传标记。本研究采用AFLP标记技术对118份国内外甘蔗种质材料进行遗传多样性分析, 用10对自己筛选的引物扩增共得到1310条谱带, 其中多态性条带数目为1195条, 多态性条带比率为91.2%, 这低于庄南生等^{[ 8]}用4对AFLP引物对54份甘蔗种质扩增所得98.5%的多态性比率, 但远高于劳方业等^{[ 17]}用15对AFLP引物对78份中国自育甘蔗种质亲本扩增所得79.3%的多态性比率。多态性存在一定差异, 可能与引物数量、不同品种材料有一定关系, 但都显现出较高的多态性检出率。聚类结果则表明大部分种质亲缘关系较近, 遗传组成相似。通过对AFLP分子标记数据的相似性分析、主效应分析, 有效准确地反映出各国不同种质间的亲缘关系, 与目前种质材料之间普遍共祖现象相吻合。因此AFLP分子标记适合于各国甘蔗种质遗传多样性研究。
3.2 引进甘蔗种质的应用甘蔗种质的引进是最简单、最经济、最有效的育种方法。一方面用于生产应用, 另一方面可用作亲本或中间材料。近年来, 引进的种质F134、ROC1、ROC10、ROC 16、ROC 22和ROC 25在我国甘蔗生产上取到了非常重要的作用, 尤其是ROC22取到了举足轻重的作用。甘蔗种质的引进和利用, 在中国甘蔗种质创新、甘蔗杂交育种和蔗糖产业发展中起到了重大作用。许多种质都曾经是我国的主栽品种, 目前ROC 22仍然占我国甘蔗栽培面积的60%左右。据不完全统计, 我国利用引进种质Co419、CP49-50、NCo310^{[ 1]}、CP72-1210^{[ 2]}, 分别育成了24、26、27和12个优良品种。桂糖11、ROC 10、ROC 16和ROC 22以及新良种福农94-0403、福农95-1702、桂糖25、桂糖26、粤糖93-159、粤糖00-236、云蔗94-375和云蔗99-596等均含有国外引进种质血缘。本研究从各国的遗传相似性系数看, 美国种质最小, 平均为0.725, 且美国种质在聚类中相对较分散, 表明美国种质遗传多样性相对较丰富, 在杂交利用中应给予关注。在聚类结果中, 我国主栽品种ROC 22分在II类群中的A亚群, 较早地和第II类群中的110份种质分开, 说明在遗传组成上和这110份种质有较大差异; 目前我国甘蔗杂交育种中每年用ROC 22为亲本配制的杂交组合多达200个以上, 且有优良后代材料如柳城03-182和柳城05-136等, 但ROC 22黑穗病较重, 目前的重点是如何利用、改良ROC 22, 为甘蔗产业作出更大的贡献。国外引进甘蔗种质在我国甘蔗产业中起到了重要作用, 在加强自主创新的同时, 应高效率应用好国外引进甘蔗种质, 尤其应加强将这些种质作为杂交亲本。
3.3 AFLP聚类与甘蔗种质系谱的关系甘蔗系谱是杂交组合选配的重要依据。由于甘蔗杂交存在自交串粉等现象, 导致部分系谱不能真实反映其亲缘关系, 且甘蔗遗传背景复杂, 相同组合后代也可能存在较大遗传差异^{[ 8, 9]}。刘家勇等^{[ 9]}采用AFLP标记技术对68份甘蔗种质的亲缘关系研究显示, 来自同一杂交组合NCO310×QN54-7096的Q121、Q124、Q135和Q141, 只有Q121和Q124分在同一组, Q135和Q141被分在不同组中; 庄南生等^{[ 8]}采用AFLP标记技术对54份甘蔗种质研究表明, 来自同一杂交组合CP49-50×F134的广西1号和闽糖70-611, 并未分在一组。本研究中云蔗04-621、云蔗04-622和云蔗04-649都来自同一杂交组合云蔗89-7×崖城84-125, 其中只有云蔗04-621和云蔗04-649分在第II类群中的E亚群, 云蔗04-622分在第I类群, 这3个种质的母本云蔗89-7则分在第II类群中的A亚群。因此, 从分子水平揭示种质的遗传差异, 可为杂交组合选配中亲本的选择提供系谱数据之外的佐证依据。

4 结论118份种质资源的遗传基础差异较小, 亲缘关系较近。各国遗传相似性系数中, 澳大利亚材料(0.801) >菲律宾材料(0.775) >法国材料(0.768) >中国材料(0.753) >巴西材料(0.745) >美国材料(0.725), 表明美国种质遗传多样性相对较丰富。聚类结果显示, 粤糖00-236、ROC16、ROC22、云蔗94-375、云蔗89-7、云蔗94-343、04-622和SP80-1816等8份种质较早地和其他110份种质分开, 其中粤糖00-236、ROC16、ROC22、云蔗94-375、云蔗89-7和云蔗94-343等6份种质已在中国作为主要亲本应用, 并得到了部分优良后代材料, 云蔗04-622和SP80- 1816在中国杂交育种中未见应用, 在杂交组合选配中应给予重点关注。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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