, 沈文浩1,2, 原江锋1,3, 孙建瑞1,2, 王梦洋1 1. 河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023;
2. 河南省食品微生物工程技术研究中心，河南 洛阳 471023;
3. 东部战区总医院 药理科，江苏 南京 210002
收稿日期：2020-06-30；接收日期：2020-09-25
基金项目：国家自然科学基金(No. 31401672)，河南省高校青年骨干教师项目(No. 2016GGJS-060) 资助
摘要：纳他霉素是一种对真菌具有广谱抗菌活性的多烯大环内酯类抗生素，它不仅能有效地抑制真菌的生长和繁殖，而且能够抑制一些真菌毒素的形成，已被大多数国家批准为抗真菌食品防腐剂使用，也被广泛应用于农业和医疗领域。纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis和恰努塔加链霉菌Streptomyces chatanoogensis是纳他霉素的主要产生菌，其生物合成过程及调控机制相关研究比较清楚。文中主要归纳了纳他霉素的生物合成和调控机制，探讨了提高纳他霉素产量的方法，并展望了纳他霉素未来的研究方向。
关键词：纳他霉素食品防腐剂生物合成调控机制
Advances in the biosynthesis of natamycin and its regulatory mechanisms
Dahong Wang1,3
, Wenhao Shen1,2, Jiangfeng Yuan1,3, Jianrui Sun1,2, and Mengyang Wang1 1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China;
2. Henan Engineering Research Center of Food Microbiology, Luoyang 471023, Henan, China;
3. Department of Pharmacology, Jinling Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu, China
Received: June 30, 2020; Accepted: September 25, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31401672), Fund of Young Teachers in Colleges and Universities of Henan Province, China (No. 2016GGJS-060)
Corresponding author: Dahong Wang. Tel: +86-379-64282342; E-mail: wangdahong2003@163.com.
Abstract: Natamycin is a polyene macrolide antibiotics with strong and broad spectrum antifungal activity. It not only effectively inhibits the growth and reproduction of fungi, but also prevents the formation of some mycotoxins. Consequently, it has been approved for use as an antifungal food preservative in most countries, and is also widely used in agriculture and healthcare. Streptomyces natalensis and Streptomyces chatanoogensis are the main producers of natamycin. This review summarizes the biosynthesis and regulatory mechanism of natamycin, as well as the strategies for improving natamycin production. Moreover, the future perspectives on natamycin research are discussed.
Keywords: natamycinfood preservativebiosynthesisregulatory mechanism
1955年，Struyk等从南非纳他州的土壤中发现一株纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis，从其发酵液中分离并得到匹马菌素(Pimaricin)；Burns等从土壤中分离出一株恰努塔加链霉菌Streptomyces chatanoogensis，从其发酵液中分离得到田纳西菌素，后来研究证实，匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被WHO统一命名为纳他霉素[1]。此外，褐黄孢链霉菌Streptomyces gilvosporeus也是纳他霉素的产生菌。纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗生素，它在极低浓度下就能表现出极强的广谱抗真菌活性，且安全高效。纳他霉素作用机理是与真菌细胞膜的麦角甾醇结合，从而使细胞膜畸变，导致细胞内容物渗漏而死亡。纳他霉素能有效抑制霉菌和酵母菌的生长，还能阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。此外，其对哺乳动物细胞表现出低毒、无副作用，这也使它广泛应用于食品防腐领域，迄今为止，全球已有40多个国家批准将纳他霉素用于水果、饮品、乳制品、肉制品等保鲜和防腐[2]；在医疗方面，它被用于真菌性角膜炎的治疗[3]；在农业保护领域，它作为农作物保护剂用于防止真菌污染。本文阐述了纳他霉素的生物合成和代谢工程改造，同时，对近年来的重大研究成果进行了剖析，揭示了其复杂的生物合成代谢网中的调控机制，最后讨论了提高纳他霉素产量的策略，并对纳他霉素未来的研究方向进行了展望。
1 纳他霉素的结构和性质纳他霉素分子式为C33H47NO13，核心结构是一个四共轭双键二十六元内酯环(图 1)，与大多数糖基多烯化合物一样，纳他霉素结构中含有的海藻糖胺，通过β-糖苷键将内酯环连接到C15上，C4–C5上的含环氧基团由双键衍变而来；C12位环外羧基衍生于甲基，C9的羰基和C13的羟基自环化产生一个内部半缩酮环，其结构中的发色基团含一个平面和刚性的亲脂结构，其羟基化的部分显示柔性和亲水性，使纳他霉素成为强的两性分子，它难溶于水而且几乎不溶于非极性溶剂，在避光条件下以粉末状存在时，处于稳定状态且无活性损失，但其水溶液对光敏感。
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| 图 1 Structure of natamycin[1]. Fig. 1 Structure of natamycin[1]. |
| 图选项 |
2 纳他霉素的生物合成和转运2.1 纳他霉素的生物合成纳他霉素又称匹马菌素，其在S. natalensis和S. chatanoogensis中的生物合成基因簇分别被命名为pim和scn (图 2)。1999年，Aparicio等研究了纳他霉素的生物合成基因；之后pim和scn先后被报道，证实纳他霉素是由12个乙酸单位和1个丙酸单位合成的[4-5]。纳他霉素骨架结构由PKSⅠ类聚酮合酶催化完成，PKS包含13个同源模块和60个催化结构域，这些模块分布在由pimS0-pimS4编码的5个多功能酶PimS0-PimS4中。骨架环再由pimC、pimD、pimF、pimG、pimJ和pimK编码的蛋白进行后修饰，pimA、pimB和pimH编码的蛋白负责纳他霉素的转运，pimT、pimE、pimM和pimR编码的蛋白负责调控纳他霉素合成基因的表达[6]。尽管pim和scn基因簇的编码区域高度保守一致，但不同菌种基因间结构域的差别导致它们的转录机制存在一定的区别，与scn基因簇相比，pim基因簇含有pimH和pimT，两个基因分别位于PKS基因簇的两端，pimH通过编码一种外排泵参与纳他霉素的转运，pimT编码一个氨基酸外排子，通过分泌诱导子2, 3-二氨基-2, 3-双(羟甲基)-1, 4-丁二醇(PI因子) 参与调节纳他霉素的产生[7]；与pim基因簇相比，scnS1的下游含有一个假定转座酶基因scnL (编码酪氨酸磷酸酯酶)。S. natalensis与S. chatanoogensis合成基因簇中各个基因和编码相应的蛋白见表 1。
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| 图 2 S. natalensis中纳他霉素合成基因簇 Fig. 2 The gene cluster for natamycin biosynthesis in S. natalensis. |
| 图选项 |
表 1 纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌基因簇对比Table 1 Comparison of the gene clusters for natamycin biosynthesis from S. natalensis and S. chattanoogensis
| Gene name | Encoded protein | |
| S. natalensis | S. chatanoogensis | |
| pimS0 | scnS0 | Pks loading module |
| pimS1 | scnS1 | Pks extension modules 1–4 |
| pimS2 | scnS2 | Pks extension modules 5–10 |
| pimS3 | scnS3 | Pks extension module 11 |
| pimS4 | scnS4 | Pks extension module 12, cyclisation and chain release |
| pimA | scnA | ABC transporter (PIM export) |
| pimB | scnB | ABC transporter (PIM export) |
| pimC | scnC | GDP-3-keto-6-deoxymannose aminotransferase |
| pimD | scnD | P450 monooxygenase (C4, 5 epoxidase) |
| pimE | scnE | Cholesterol oxidase |
| pimF | scnF | Ferredoxin |
| pimG | scnG | P450 monooxygenase (C12 hydroxylase) |
| pimH | not found | PIM efflux pump |
| pimI | scnI | Thioesterase (type Ⅱ) |
| pimJ | scnJ | GDP-mannose 4, 6-dehydratase |
| pimK | scnK | Mycosamine transferase |
| pimL | scnL | Tyrosine phosphatase |
| pimM | scnRⅡ | PAS-LuxR regulator |
| pimR | scnRⅠ | SARP-LAL regulator |
| pimT | not found | PIM inducer PI factor secretion |
表选项
纳他霉素骨架的合成从PimS0开始，由CoA连接酶-ACP-KS-AT-ACP催化乙酸形成酰基腺苷酸，为PimS1模块1的KS结构域提供乙酰单元[4]，但是模块0中的KS结构域是失活的；PimS1的4个模块分别完成骨架链延长的前4个循环，并构成大部分的多烯发色团；然后，PimS2、PimS3、PimS4上的8个模块催化8个羧酸模块单元的缩合，并进行适当的结构修饰从而形成纳他霉素的骨架。在PimS2中，模块5负责形成发色团的最后一个双键，模块6–10中缺失DH结构域，模块7中的AT结构域选择的延伸单元为丙酸；PimS2的模块9中的KR是非活性的，β-酮基不能被还原，因此，在模块7中KR结构域的作用下C9羰基和C13羟基形成了纳他霉素结构中的半缩酮环；PimS3负责合成C3和C4，并引入一个双键，之后会形成一个环氧结构；在PimS4的C末端硫酯酶结构域(Terminal thioesterase domain，TE)催化下释放碳链，并形成二十六元内酯环。骨架形成的准确性依赖于基因pimI编码的硫酯酶，该酶能有效地筛选酰基起始单元以及去除错误的延伸单位，它可以被其他的硫酯酶补充，而且与PimS4末端的TE具有互补作用[8-9]。酰基载体蛋白(Acyl carrier protein，ACP) 是PKS中关键功能域，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl transferases，PPTase) 催化磷酸泛酰巯基乙胺基从CoA转移到ACP的活性丝氨酸的残基上，将ACP从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态，PPTase作为PKS的活性开关，对PKS产物的生物合成起着不可或缺的作用[10]。研究证实在S. chatanoogensis中含有1个Ⅰ型PPTase基因(schACPS) 和1个Ⅱ型PPTase基因(schPPT)，SchPPT倾向于催化次级代谢中ACP的辅基化，而SchACPS倾向于催化独立ACP的辅基化[11]。
在S. natalensis中，pimJ编码的脱水酶催化GDP-甘露糖(来源于6-磷酸-果糖) 转化为GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖，并通过自发异构反应生成GDP-3-酮-6-脱氧甘露糖(GDP放线菌糖胺)[12-13]。随后，pimC编码的转氨酶经转氨作用生成GDP-海藻糖胺，通过pimK编码的糖基转移酶催化海藻糖胺与大环内酯的连接，合成糖苷配基后，pimG编码的P450单加氧酶催化环外甲基在C12氧化形成环外羧基，产生12-羧基嘧啶酮。最后，pimD编码的P450单加氧酶催化最后一个氧化反应，将C4和C5双键形成环氧基团，转化为纳他霉素(图 3)。
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| 图 3 纳他霉素生物合成途径[5] Fig. 3 Natamycin biosynthetic pathway[5]. |
| 图选项 |
2.2 纳他霉素的转运虽然纳他霉素对产生菌没有抗性，但在细胞内大量积累对产生菌是有害的，因此，产生菌体内存在转运系统将纳他霉素排出胞外。在S. natalensis中，pimA、pimB和pimH三个基因参与了纳他霉素的转运，pimA和pimB编码Ⅲ型ABC转运蛋白，它们能结合ATP和跨膜结构域从而发挥转运作用，它们可能会结合形成一个异二聚体[9]。研究发现基因nysH、nysG (pimA、pimB的同源基因) 失活的诺尔斯氏链霉菌Streptomyces noursei突变株也可将制霉菌素运出胞外，说明链霉菌中存在除ABC转运子外还有其他转运系统。因此，推测pimH编码的外排泵也会参与纳他霉素的转运。在S. chatanoogensis基因簇中的编码ABC转运蛋白的基因scnA和scnB，与pimA和pimB的相似度在95%以上，虽然没有发现pimH的相似基因，但发现了可起补充作用的转运蛋白NepⅠ/ NepⅡ和Mfs1，以上4个转运蛋白构成了一个新的纳他霉素转运系统[14]。
3 纳他霉素的代谢工程改造多烯类抗生素与哺乳动物细胞膜内的胆固醇非特异性结合，导致多烯类具有良好的抗真菌效果的同时，也具有严重的溶血毒性和肾毒性，这严重限制了多烯类抗生素的应用[15]。因此，根据纳他霉素生物合成途径，可以通过代谢工程得到一些低毒或水溶性高的纳他霉素衍生物(图 4)。
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| 图 4 纳他霉素的衍生物[17-18] Fig. 4 Derivatives of natamycin[17-18]. |
| 图选项 |
通过基因工程敲除pimD，获得纳他霉素衍生物4, 5-去环氧匹马菌素，其抗真菌活性较纳他霉素明显降低，说明环氧基在纳他霉素发挥抗真菌活性时是重要的[16]。在研究S. chatanoogensis中纳他霉素生物合成的途径时，scnG基因的敲除导致4, 5-去环氧基-12-脱羧基-12-甲基匹马菌素的积累，且该研究证实糖基转移酶ScnK能够将海藻糖胺连接到脱羧糖苷配基上，ScnD催化环氧化作用[17]。Qi等通过敲除scnG不仅导致4, 5-去环氧基-12-脱羧基-12-甲基匹马菌素的积累，同时还有12-脱羧基-12-甲基匹马菌素的积累，证实了ScnD在一定程度上能催化环氧化作用[18]。12-脱羧基- 12-甲基纳他霉素的抗真菌活性是纳他霉素的2倍，其溶血毒性比纳他霉素降低了4.5倍，具有良好的应用前景[19]。随后，又获得了一株产生3-羟基-4, 5-去环氧基-12-脱羧基-12-甲基匹马菌素的突变株，但该衍生物却没有表现出明显的抗真菌和溶血活性。ScnK催化纳他霉素内酯与糖基的连接，将S. chatanoogensis中的scnK基因敲除导致4, 5-去环氧匹马菌素内酯的积累，该物质本身不具有抗真菌活性，如果通过半合成或蛋白质工程等方法引入糖基，就会变成一种很有价值的物质，4, 5-去环氧匹马菌素内酯的积累证实了ScnG (PimG) 在纳他霉素生物合成的糖基化反应之前发挥催化作用[17]。
4 纳他霉素的生物合成调控机制在纳他霉素生物合成过程中，会受到多种因素的调控，如菌体密度、外界环境和信号分子等，纳他霉素合成的代谢调控主要包括途径特异性转录调控和全局多效调控。
4.1 途径特异性转录调控PimR是纳他霉素生物合成中第一个途径特异性转录调节因子，也是一个具有特殊结构的转录激活子，敲除pimR后获得的突变体不能产生纳他霉素，负责内酯环形成的关键酶基因表达量明显降低，且完全中断了pimE的转录，说明PimR是一个正调控蛋白[20]。PimR的N端含链霉菌抗生素调控蛋白(Streptomyces antibiotic regulatory protein，SARP) 的DNA结合结构域，C末端包含同源的半鸟苷酸环化酶和LuxR家族ATP结合调节因子(Large ATP-binding regulators of the LuxR family，LAL)。在其他链霉菌中，菲律宾菌素、尼可霉素和多氧霉素生物合成过程中的调节因子分别为FilR、SanG和PolR，与PimR一样，对生物合成基因簇的启动子区域进行调控而控制化合物的产生，虽然这些化合物的结构不同，但都显示出良好的抗真菌作用[21-23]。PimM是纳他霉素生物合成的第二个转录激活子，pimM缺失的突变体不能合成纳他霉素，说明PimM也是一个正调控蛋白[24]。PimM的N末端包含一个PAS (Per ARNT Sim，一种结构域家族) 传感器结构域，C末端含与DNA结合的LuxR型α螺旋-转角-α螺旋基元(Helix-turn-helix，HTH) 结构，PAS能够检测外界物理或化学信号且具有响应该调节效应的活性，PAS位于细胞溶质中，但PimM不属于双组分系统[25]。pimM不仅存在于纳他霉素的合成基因簇中，在其他已知抗真菌多烯的生物合成基因簇中还发现了其同源基因编码的调节蛋白，且已被证明它们的功效与PimM相同。Amphotericin合成基因amphRIV、nystatin合成基因nysRIV和filipin合成基因pteF是PAS-LuxR类的同源调节因子，分别将它们引入到S. natalensis ΔpimM中，突变体恢复了纳他霉素的部分生产能力；将pimM分别导入amphotericin产生菌结节链霉菌Streptomyces nodosus、filipin产生菌阿维链霉菌Streptomyces avermitilis和rimocidin产生菌龟裂链霉菌Streptomyces rimosus，也会提高这些多烯类的产量，所以这些调节因子是完全可交换的[26]。PimR和PimM以协同方式起作用，PimR结合到PimM启动子上并激活其转录，PimM直接激活纳他霉素8个结构基因的启动子(pimS2S3S4、pimS1、pimAB、pimD、pimE、pimI、pimK和pimJ)，并影响其转录[27]。PimM发挥作用并不依赖于PimR调控蛋白，但增加PimM的表达量可以显著提高纳他霉素的产量，而提高PimR表达却不影响纳他霉素的产量[28]。此外，PimM能通过激活其他调节因子间接调节pimC基因的表达(图 5)。
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| 图 5 PimR和PimM对纳他霉素生物合成基因的调控模型 Fig. 5 Model of regulation for natamycin biosynthesis by PimR and PimM. |
| 图选项 |
纳他霉素生物合成基因簇的调控因子有时直接结合在下游靶基因的启动子上激活其转录，有时多个调控基因构成一个级联的调控系统，在大部分情况下途径特异性调控基因所起的作用是激活相关基因簇的表达，虽然这些正调控因子作用相似，但在结构组成上有很大区别，对DNA结合结构域起着不同的调控作用。
4.2 全局多效调控在抗生素的合成、形态分化过程中还存在一些能够调控多个代谢途径的全局多效调控基因，它们常存在于抗生素的合成基因簇之外，通常它们通过途径特异性调控因子实现对抗生素生物合成的调控。
phoR-phoP双组分系统是链霉菌中研究较详细的磷酸双组分调控系统，它由信号激酶和受体调控蛋白两个部分组成，磷酸可以作为信号分子参与代谢以及调控[29]。Mendes等对S. natalensis中的phoU-phoR-phoP区域进行了研究，发现来自天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor的PhoP蛋白能与S. natalensis的phoU-phoRP基因间的PHO盒(phoP基因的操纵子) 结合，说明该系统是自发调控的。在phoP缺失的突变体中，pim基因簇的部分基因表达得到上调，但在pim基因簇中却未发现PHO盒，且PhoP蛋白是不能直接结合到纳他霉素合成基因簇内启动子区域，表明这些pim基因的磷酸调控是由PhoP通过其他调控因子介导的[30]。
纳他霉素的发酵是一个耗氧过程，低浓度氧会限制菌株的生长及纳他霉素的合成，高浓度氧则会升高胞内活性氧水平，破坏细胞组分。在S. natalensis中，细胞内活性氧失衡时，H2O2将PimM作为直接或间接靶点，通过氧化还原机制调控并提高纳他霉素的合成。超氧化物歧化酶sodF的失活导致纳他霉素产量降低；抑制H2O2分解酶，如烷基过氧化氢酶系统中的ahpCD或过氧化氢酶katA1，会导致纳他霉素产量的提高，因此，胞内H2O2与纳他霉素的产生呈正相关。转录分析显示S. natalensis磷酸盐代谢和氧化应激之间有交互作用，sodF或ahpCD的缺失都导致纳他霉素合成基因簇的转录延迟激活，推测该现象与培养液中磷酸耗尽有关。此外，研究发现在氧胁迫条件下，细胞NADPH/NADH的比例和支链氨基酸代谢提供的前体水平是制约纳他霉素合成的主要瓶颈[31-32]。
γ-丁内酯(γ-butyrolactones，GBL) (图 6) 是由一些链霉菌合成的、具有群体效应功能的小分子信号分子，链霉菌将GBL作为自身诱导剂，通过这些自动诱导因子与受体的相互作用介导信号传导，受体从DNA解离，从而引导了目的基因转录。GBL受体属于TetR家族的转录调节子，在S. natalensis和S. chatanoogensis中发现了与GBL受体同源的蛋白(SngR和SprA)，却没有发现这两种菌产生GBL。但在S. natalensis中发现了一种新型的诱导化合物——PI因子(2, 3-diamino- 2, 3-bis (hydroxymethyl)-1, 4-butanediol，PI factor) (图 6)，PI因子能诱导丧失纳他霉素合成能力的S. natalensis突变株合成多烯类物质，这些物质通过氨基酸转运子PimT从细胞内运出，但PI因子的详细作用机制未知[33]。寇美辰等通过化学合成PI因子，在发酵过程中添加PI因子纳他霉素发酵产量可达5.456 g/L，是对照组的2.22倍[34]。同时，S. natalensis可能会结合不同的群体感应信号分子，如灰色链霉菌中的A因子(一种高效的GBL类自动调节子)，虽然S. natalensis并不会合成A因子，但是在不产纳他霉素的突变体中加入A因子后却恢复了纳他霉素的生产能力[33]。此外，研究还发现添加一定浓度的PI因子结构类似物，如丙三醇、乙二醇和1, 2-丙二醇等，也能促进纳他霉素的合成[35]。
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| 图 6 The structure of γ-butyrolactone and PI factor[33]. Fig. 6 The structure of γ-butyrolactone and PI factor[33]. |
| 图选项 |
5 纳他霉素产量的提高从自然界分离的野生型菌株中纳他霉素产量过低，不能满足工业化生产的需要，一些研究者采用菌株选育、基因工程和代谢调控等方法提高纳他霉素的发酵产量。
5.1 菌种选育Wang等采用亚硝基胍诱变褐黄孢链霉菌，使纳他霉素的产量提高了340%[36]；Luo等采用递归原生质体融合进行基因改组，使突变菌株纳他霉素的产量提高了379%[37]。笔者课题组为了提高纳他霉素菌株的产能，选用纳塔尔链霉菌为出发菌株，以紫外线作为诱变剂获得1株突变株S. natalensis HW-2 (0.8 g/L)，优化发酵工艺后，纳他霉素产量较原始菌株提高了242.6%[38]；以S. natalensis HW-2为初始菌株，采用紫外-常温室压等离子体-硫酸二乙酯(Diethyl sulfate，DES) 复合诱变，选育出1株遗传性状稳定的优良突变株S. natalensis DES-26，较初始菌株提高了86.36%，通过对差异菌株的转录组学分析发现，优良菌株的丙酮酸激酶、葡萄糖酸激酶、异柠檬酸脱氢酶等基因的表达水平上调，脂肪酸代谢平衡被打破，与纳他霉素生物合成相关的大部分基因的表达水平上调，如pimB、pimC、pimD、pimR等，使调节纳他霉素骨架结构合成、修饰和转运能力得到提高，纳他霉素合成能力增强。
5.2 基因工程基因工程是提高代谢产物产量的常用方式，可以通过提高纳他霉素基因的表达水平而提高其产量，降低了诱变技术的盲目性和随机性[39]。在S. natalensis中过表达pimM，增加pimM的基因表达量，纳他霉素产量提高了1.4倍[24]；将透明颤菌Vitreoscilla的血红蛋白vgb基因整合到S. gilvosporeus中，纳他霉素产量增加了407%[40]。本课题组采用基因工程方法过表达S. natalensis HW-2中编码乙酰乙酸合酶的基因ilvH，得到1株工程菌S. natalensis ZS101较原始菌株纳他霉素产量提高了37.93%[41]。为了获得更多的前体物质，如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，我们过表达支链氨基酸(Branched-chain amino acids，BCAAs) 降解的关键酶支链氨基酸转氨酶(BCAT) 的基因ilvE，在S. natalensis HW-2中同源表达，获得的工程菌S. natalensis LY08的纳他霉素产量提高了78.72%，达到了1.52 g/L。以上结果表明，通过代谢工程提高BCAAs合成和代谢能力，提高前体物质的供应，能有效促进纳他霉素的合成。其他提高产量的策略包括高表达PPTase[42]、增加强启动子groESp[43]和多效调节基因wblA[44]等。近年来，随着合成生物学的发展，PKS异源表达已获得成功，通过对纳他霉素基因簇的异源表达可以获得产量的提高[45]。以S. chatanoogensis L10为改造对象，针对纳他霉素生物合成途径，通过敲除副产物合成途径、过表达相关激活子及基因表达浓度梯度技术全面优化了纳他霉素的生物合成途径，构建的高产菌株发酵水平最高达15.9 g/L[46]。
5.3 代谢调控通过添加前体和诱导物、优化发酵条件等代谢调控方式也是提高纳他霉素产量的有效方法。Elsayed等在S. natalensis发酵液中添加乙酸和丙酸(7:1)，使纳他霉素的产量提高了50%[47]；Li等发现在培养基中添加过丙醇也可以提高其产量[48]；Zeng等采用固定化S. gilvosporeus的方法进行发酵，使纳他霉素产量提高了1.8倍[49]；Elsayed等采用连续补糖30 h，在7.5 L发酵罐中纳他霉素的产量提高了1.6倍[50]；Zeng等采用固态发酵方法，使每克干底物能产纳他霉素9.62 mg，比液态发酵减少50.05%成本支出[51]。笔者课题组在S. natalensis HW-2发酵24 h时添加源于产黄青霉AS 3.5163的真菌诱导子，使纳他霉素产量提高了2.3倍，添加真菌诱导子后，菌落、菌丝形态差异显著，细胞干重下降了17.7%，葡萄糖的利用率显著提高，胞内Ca2+浓度提高了32.8%，胞内活性氧浓度提高了一倍[52]；采用RNA-seq对诱导后转录组学分析发现，碳代谢、氮代谢、氨基酸代谢和脂肪代谢等途径中的关键酶的基因转录水平出现明显变化，大部分与纳他霉素生物合成相关的酶的转录水平得到提高；研究发现在纳他霉素发酵至36 h时添加0.5 g/L L-缬氨酸，纳他霉素产量比对照组提高了80%，菌体内与糖代谢有关的关键酶活力得到不同程度的提高；RNA-seq代谢组学分析显示，与支链氨基酸(BCAAs) 代谢有关酶的转录水平上调，从而提高了BCAAs的降解能力[53]。纳他霉素的发酵是好氧的，供氧水平对其产量高低有重要影响，研究发现大豆油可以作为氧载体，添加1% (V/V) 的大豆油可使纳他霉素产量提高43.9%[54]。在纳他霉素发酵过程中采用发酵-吸附耦合工艺，通过优化HPD450添加工艺后，发酵产量提高了66.27%[55]。
6 展望纳他霉素主要应用于食品、医疗、农业等行业，从它的发现、研究到使用已超过60年，是国际上唯一获得批准的高效、安全的抗真菌生物防腐剂。当前，纳他霉素的生产和应用已取得了巨大进步，但仍然存在生产成本高、菌种性能低、使用面窄等缺点。因此，接下来的研究可以集中于以下几个方面：(1) 阐明纳他霉素的全局多效调控。该调控对链霉菌抗生素的产生、形态分化等进行控制，除了phoR-phoP调控、丁内酯-受体调控和AdpA调控外，机体内是否存在其他对纳他霉素产生有重大影响的调控因子，如TetR、Lrps家族调节因子。可以采用诱导的方法并结合基因组学、转录组学等系统生物学技术鉴定该调控因子，可为纳他霉素生物合成的全局性调控和提高产量提供更好的思路。(2) 采用高通量筛选方法选育高产菌株。虽然诱变育种、定向进化等非理性菌种选育技术具有工作量大、效率低等缺点，但其在基因突变的广度方面具有巨大的优势。近年来，代谢产物生物传感器的开发推动了高通量筛选方法的迅猛发展[56]，若能借助系统生物学研究方法找出响应纳他霉素的合成生物学元件，构建高通量筛选方法，再结合常规诱变、离子束诱变和常压室温等离子体诱变等技术，可以获得较为理想的纳他霉素高产菌种。(3) 结合CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 技术高效改造纳他霉素生物合成途径。CRISPR/Cas9系统能够进行高效基因编辑、沉默基因簇激活、生物合成机制解析、生物合成元件构建和目标化合物产量提升等，该技术已在天蓝色链霉菌等多个放线菌中实现基因删除、插入和定向突变等功能，极大地促进了放线菌的合成生物学研究及其天然产物的开发[57]。根据纳他霉素的代谢调控策略，在该技术下对纳他霉素的合成途径中关键基因的表达实行精细调控，构建基因组尺度代谢网络模型，改变代谢通量，解决限制支链氨基酸代谢等产生前体供应的瓶颈问题，调控全局和特效转录调节因子，实现纳他霉素合成的高效和高产。(4) 强化纳他霉素的外排能力。PimA和PimB是纳他霉素的2个转运蛋白，可利用基因工程或插入强启动子等方法对其进行过表达，不仅可以加强纳他霉素向胞外的运输能力，而且还能解决因胞内积累产生的毒性和反馈调控问题，可为发酵法生产纳他霉素提供推动力。(5) 提高发酵强度，实现环境友好型生产。筛选合适的前体和诱导子，优化添加和中间补料工艺，设计和实现基于多尺度理论的发酵过程优化控制系统(溶氧、pH、补料等参数的控制)，缩短发酵周期，提高发酵强度；有针对性地开发氮源，降低发酵培养基中酵母粉的使用量，降低发酵成本；研发环境友好型的纳他霉素提取和精制工艺，减少或停止下游过程中甲醇的使用。(6) 拓宽纳他霉素的使用范围。受限于《食品安全国家标准食品添加剂使用标准GB 2760-2014》的使用范围[58]，纳他霉素目前只能用于糕点、烤肉、果酱、火腿、发酵酒等食品中，因此需要加强纳他霉素或与其他食品防腐剂(乳酸菌素和聚赖氨酸) 联用在食品中应用的基础研究，为大范围推广提供理论支撑；与药物研究人员加强合作，研究纳他霉素治疗真菌疾病的药理和药效，扩大纳他霉素在医疗上的应用。
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