1. 河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046;
2. 河南农业大学 国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州 450046
收稿日期：2020-07-09；接收日期：2020-10-19
基金项目：国家自然科学基金(No. 31802160)，河南农业大学高层次“拔尖人才”项目(No. 30500690)，2020年度河南省留学回国人员科研择优项目(No. 30602136) 资助
摘要：为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰，通过同源重组将马立克氏病病毒(MDV) 超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体(BAC)。将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株，用PCR及限制性片段多态分析(RFLP) 方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆。将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞(CEF)，拯救出重组病毒，命名为Md5BAC。进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株。为了验证被敲除基因功能的特异性，将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株。将构建的重组毒株分别感染CEF细胞，用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功；病毒生长曲线结果表明，lorf10敲除不影响病毒的体外增殖。总之，这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考。
关键词：马立克氏病病毒同源重组细菌人工染色体基因组编辑
A rapid and accurate method for herpesviral gnome editing
Aijun Sun1,2, Xiangru Wang1,2, Shuaikang Yang1,2, Ying Liu1,2, Gaiping Zhang1,2, Guoqing Zhuang1,2
1. College of Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, Henan, China;
2. International Joint Research Center of National Animal Immunology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, Henan, China
Received: July 9, 2020; Accepted: October 19, 2020
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31802160), Starting Foundation for Outstanding Young Scientists of Henan Agricultural University (No. 30500690), Henan Province Advanced Program of 2020 for Returned Overseas Scholar (No. 30602136)
Corresponding author: Guoqing Zhuang. Tel: +86-371-56990163; E-mail: gqzhuang2008@163.com.
Abstract: To rapidly and accurately manipulate genome such as gene deletion, insertion and site mutation, the whole genome of a very virulent strain Md5 of Marek's disease virus (MDV) was inserted into bacterial artificial chromosome (BAC) through homogeneous recombination. The recombinant DNA was electroporated into DH10B competent cells and identified by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis. An infectious clone of Md5BAC was obtained following transfection into chicken embryo fibroblast (CEF) cells. Furthermore, a lorf10 deletion mutant was constructed by two step Red-mediated homologous recombination. To confirm the specific role of gene deletion, the lorf10 was reinserted into the original site of MDV genome to make a revertant strain. All the constructs were rescued by transfection into CEF cells, respectively. The successful packaging of recombinant viruses was confirmed by indirect immunofluorescence assay. The results of growth kinetics assay and plaques area measurement showed that the lorf10 is dispensable for MDV propagation in vitro. Overall, this study successfully constructed an infectious BAC clone of MDV and demonstrated its application in genome manipulation; the knowledge gained from our study could be further applied to other hepesviruses.
Keywords: Marek's disease virushomologous recombinationbacterial artificial chromosomegenome editing
马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV) 属于α疱疹病毒，能引起以感染宿主发生严重的免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的马立克氏病(Marek’s disease，MD)[1]。MDV分为3个血清型：血清Ⅰ型(MDV-1)，包括致病性MDV及其衍生物；血清Ⅱ型(MDV-2) 和Ⅲ型(MDV-3) 是自然分离的无致病性毒株，MDV-3又称为火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey，HVT)[2]。MD造成世界养禽业每年10–20亿美元的经济损失[3]。虽然可以用疫苗有效控制MD的发生，但不能完全抑制病毒在宿主体内的复制。随着疫苗的使用，MDV的致病力不断进化，高致病力的毒株突破疫苗的保护屏障而导致疾病的不间断发生[4]。到目前为止，依据致病力的强弱，MDV可分为温和型(Mild，mMDV)、强型(Virulent，vMDV)、超强型(Very virulent，vvMDV) 以及特超强型(Very virulent plus MDV，vv+MDV) 毒株[5]。为了更好地控制MD，有必要从分子水平探索MDV的致病机制。
Md5基因组为大小约180 kb的线性双链DNA。包括两个独特区：长独特区(UL) 和短独特区(US)；长末端互补重复区(TRL)、长内部互补重复区(IRL)、短末端反向互补重复区(TRS)和短内部反向互补重复区(IRS)。Md5有338个开放阅读框(ORF)，编码超过100个基因[6]。其中UL区编码多个功能未知的特异基因，包括pp38、meq和lorf10等。利用粘粒作为载体，Reddy等构建了Md5感染性克隆rMd5，并分别敲除了pp38和meq基因，并验证了基因缺失重组毒株的生物学功能[7-8]。美国农业部禽病肿瘤研究所的Silva等利用粘粒载体，将BAC载体(pBeloBAC11) 插入到rMd5的ul3和ul4的下游区域[9]。为了消除以粘粒为载体进行的BAC克隆对rMd5基因组结构可能造成的影响，本研究将Md5基因组与BAC载体直接连接，构建了重组毒株Md5BAC。为了进一步研究lorf10在MDV体外增殖中的作用，利用Red酶介导的两步法重组技术将Md5BAC中的lorf10敲除，构建了Md5BACΔLORF10毒株。将lorf10重新插入敲除位点得到复原突变株Md5BACΔLORF10-Re。体外增殖结果表明，敲除lorf10与MDV的体外复制无关，表明所构建的Md5BAC可以进行基因组的相关修饰。
1 材料与方法1.1 细胞、病毒、质粒及抗体本研究用到的MDV超强毒株Md5由山东农业大学崔治中教授惠赠；BAC载体质粒由英国动物健康研究中心Venugopal Nair教授惠赠；SPF鸡蛋购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司，用于制备鸡胚成纤维细胞(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)；CEF主要用于质粒的转染、病毒的增殖等相关试验。单克隆抗体(Mab) BD4 (MDV-gB) 由山东农业大学崔治中教授惠赠抗MDV lorf9多抗为本实验室制备(未发表)。
1.2 MDV DNA的提取取9日龄的SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，待细胞长成单层后，接种1 000 PFU Md5毒株于T25细胞培养皿，待细胞出现60%的病变时，提取细胞基因组DNA。加入1 mL细胞裂解液(蛋白酶K、SDS、NaCl 100 mmol/L，Tris-Cl 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L)，60 ℃水浴中消化2 h后，苯酚氯仿抽提，最后用–20 ℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，溶于50 μL TE中。
1.3 转染取5 μg Md5感染的CEF DNA与1 μg BAC载体质粒共同转染鸡胚成纤维细胞，5 d后待细胞出现病变时，用含EDTA的胰酶将细胞消化后，接种到长有细胞单层的T75细胞瓶中(含250 μg/mL霉酚酸、50 μg/mL嘌呤及100 μg/mL次黄嘌呤)，5 d后待细胞出现病变时，将感染的CEF消化接种到含有新鲜选择培养基的CEF单层，如此进行4次，以提高同源重组的发生率。最后一次筛选，待细胞出现60%的病变时，消化细胞，提取细胞基因组DNA。
1.4 转化取5 μg经过选择培养基筛选的病毒感染的CEF基因组DNA，在2 000 V、100 Ω、25 μF的条件下电转入感受态细胞DH10B中，电击后，加1 mL SOC培养基，于37 ℃摇床培养3 h后，将菌液涂布于LB琼脂板上(含25 μg/mL氯霉素)，于37 ℃培养箱过夜培养。次日，PCR鉴定，挑取阳性菌落于LB液体培养基中，37 ℃摇床过夜培养。次日提取MDVBAC DNA。
1.5 PCR及RFLP鉴定以提取的Md5BAC质粒为模板扩增meq、ul41、50、lorf9以及BAC载体携带的gpt基因，初步鉴定质粒的正确性；为了验证基因组的完整性，将Md5BAC质粒进行限制性片段多态性分析(RFLP)，用限制性内切酶BamHⅠ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 重组病毒的拯救取10 μL LipfectamineTM2 000于90 μL opti- MEM中；取5 μg重组载体DNA于100 μL opti-MEM中；室温放置5 min后，将两者混匀后室温放置20 min，用opti-MEM补充至1 mL，逐滴加入到长有CEF单层的6孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，6 h后将液体换为含5%胎牛血清的DMEM培养液继续培养至病毒蚀斑形成，将细胞消化，传至新鲜CEF单层。连续传3–4代以扩大病毒量，待病毒感染率达到70%，将其收获，冻存于液氮中备用。
1.7 病毒的体外增殖检测将100 PFU的病毒分别接种于6个铺满新鲜CEF细胞的P60细胞培养皿，在感染后第1、2、3、4、5、6天，分别消化细胞，将消化的细胞按照10倍梯度稀释后，接种于35 mm细胞培养皿，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 d后进行病毒蚀斑计数。根据结果绘制病毒增殖曲线图，比较病毒在体外增殖特性变化。
1.8 lorf10缺失毒株以及复原毒株的构建将MDV超强毒株Md5构建成传染性的BAC克隆，在此基础上可以进行MDV基因组的修饰。我们利用Red介导的两步同源重组法，构建lorf10缺失毒株，首先，设计带有lorf10的同源序列引物，以pEPkan-s为模板，扩增卡那霉素(kana)基因，取30 ng纯化的PCR产物将其电转进含有Md5BAC的感受态细胞中，42 ℃诱导重组酶的表达，将卡那霉素基因取代lorf10；第二步重组利用10%的阿拉伯糖诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达，从而将卡那霉素基因敲除。进而构建Md5BACΔLORF10毒株。
Md5BACΔLORF10复原毒株的构建，与基因缺失过程步骤一致，采用Red介导的两步同源重组法。简要概述如下：在第一轮同源重组的过程中，PCR扩增lorf10和kana基因，PCR产物中两端含有lorf10基因两端的同源臂，取30 ng纯化的PCR产物将其电转进含有Md5BACΔLORF10的感受态细胞中，42 ℃诱导重组酶的表达，将lorf10-kana基因片段同源重组到Md5BACΔLORF10基因组中；第二步重组利用10%的阿拉伯糖诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达，从而将卡那霉素基因敲除，进而构建Md5BACΔLORF10-Re毒株。
1.9 间接免疫荧光法检测重组病毒以及病毒蚀斑大小测定将100 PFU重组病毒接种于6孔细胞培养板上的CEF细胞。培养至细胞出现60%蚀斑后，将生长液倒掉，加入磷酸盐缓冲液(PBS) 冲洗一遍，用冷丙酮︰乙醇(3︰2) 固定液固定5 min，用PBS冲洗1次，加0.5 mL (1︰100稀释) 单克隆抗体(Mab) BD4 (MDV-gB) 或者抗MDV LORF9多克隆抗体，放37 ℃恒温培养箱反应45 min后，用PBS冲洗3次，将水分甩干，加入0.5 mL FITC标记的羊抗鼠IgG荧光抗体二抗(Sigma，USA)，放37 ℃温箱反应45 min，用PBS冲洗3次，在倒置荧光显微镜下观察和成像。随机选取50个病毒蚀斑成像，成像系统采用OLYMPUS荧光显微镜，放大倍数为40，蚀斑大小采用NIH ImageJ软件分析(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)，数据分析采用GraphPad Prism version 8 (GraphPad，USA)。以上数据至少重复3次。
1.10 统计学分析对于病毒增殖试验，每个时间点的数据利用Two-way ANOVA方法分析。从蚀斑计数结果得到的每个数据点表示生物重复的平均值。数据统计分析所用软件为GraphPad Prism version 8 (GraphPad，USA)，P值小于0.05表示统计学差异显著。
2 结果与分析2.1 Md5BAC传染性克隆的构建分别提取BAC质粒与Md5基因组DNA，共同转染CEF细胞(图 1A)。两者在CEF细胞上发生同源重组，BAC质粒插入Md5基因组的US2区域(图 1B)。为了获得整合BAC质粒的重组Md5基因组克隆，利用选择性培养基筛选。将经过4轮的筛选获得的重组Md5基因组DNA进行鉴定(图 1C)，提取鉴定正确的重组Md5基因组DNA，转染CEF后获得Md5BAC传染性克隆(图 1D)。
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| 图 1 构建Md5BAC传染性克隆流程图 Fig. 1 Construction of Md5BAC infectious clone. (A) BAC vector. (B) Md5 genome with homologous arms. (C) Recombination of Md5 and BAC Bone. (D) Md5BAC infectious clone. |
| 图选项 |
2.2 Md5BAC传染性克隆的鉴定为了鉴定Md5BAC，分别设计引物扩增Md5BAC的meq、UL41、UL50、lorf9基因以及BAC载体携带的gpt基因，扩增结果如图 2A所示，与预期结果相同。为了验证Md5BAC基因组的完整性，用限制性内切酶BamHⅠ酶切Md5BAC重组质粒，进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，结果显示，Md5BAC酶切后的片段分布与模拟预测一致(图 2B)，表明构建Md5BAC成功且保持了基因组的完整性(图 2C)。
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| 图 2 Md5BAC的PCR分析以及BamHⅠ酶切鉴定 Fig. 2 PCR and RFLP analysis of Md5BAC. (A) PCR analysis using primers of Md5BAC specific genes. 1: amplification of meq; 2: amplification of UL41; 3: amplification of UL50; 4: amplification of lorf9; 5: amplification of gpt. (B) Prediction of Md5BAC digestion by BamHⅠ. (C) Electrophoresis analysis of Md5BAC digested by BamHⅠ. M: DNA marker. |
| 图选项 |
2.3 Md5BACΔLORF10传染性克隆的鉴定利用Red酶介导的两步重组法构建lorf10缺失毒株。将pEPkan-S质粒扩增的KanR-Ⅰ-SceⅠ片段电转到含有Md5BAC的菌株中。阿拉伯糖诱导Ⅰ-SceⅠ酶表达以敲除KanR序列。RFLP分析表明，相比较于Md5BACΔLORF10，Md5BAC与Md5BACΔLORF10-Re基因组中有2 784 bp序列的缺失(图 3A)。以Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re基因组DNA为模板，均能PCR扩增出meq。从Md5BAC和Md5BACΔLORF10-Re中能扩增出包含lorf10的全长序列，而Md5BACΔLORF10由于lorf10的缺失，导致PCR扩增条带变小(图 3B)。DNA测序结果与预期完全一致。以上结果表明，成功将lorf10从Md5BAC基因组中敲除。
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| 图 3 lorf10基因敲除和复原毒株PCR分析以及RFLP鉴定 Fig. 3 RFLP and PCR analysis of Md5BAC, Md5BAC ΔLORF10 and Md5BAC ΔLORF10-Re. (A) RFLP analysis of genomic DNA digested by SalⅠ. 1: Md5BAC; 2: Md5BACΔLORF10; 3: Md5BACΔLORF10-Re; *: specific band. (B) PCR analysis of meq and lorf10 gene from Md5BAC (lanes 1 and 4); Md5BACΔLORF10 (2 and 5); Md5BACΔLORF10-Re (3 and 6). M: DNA marker. |
| 图选项 |
2.4 间接免疫荧光试验(IFA) 鉴定重组病毒用LipfectamineTM2 000分别转染500 ng Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10- Re获得重组病毒。接种100 PFU Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re于CEF细胞单层，用抗MDV gB单克隆抗体进行IFA检测，结果显示，Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re均能在CEF细胞上形成MDV特异性蚀斑(图 4A)。用抗MDV LORF9多克隆抗体进行Western blotting检测，结果显示，从Md5、Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re感染的细胞中均能够检测到LORF9的表达(约30 kDa) (图 4B)。这些结果表明，BAC重组入Md5基因组，以及lorf10的敲除和复原毒株都没有影响病毒的包装和复制。
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| 图 4 重组病毒感染CEF的IFA及Western blotting分析 Fig. 4 IFA and Western blotting analysis of recombinant virus infected CEF. (A) a, b, k, l represent negative control; c, d, m, n represent Md5; e, f, o, p represent Md5BAC; g, h, q, r represent Md5BACΔLORF10; i, j, s, t represent Md5BACΔLORF10-Re. Among of them, a, c, e, g, i are IFA images of plaque recognized by MDV-specific antibody gB (100×); k, m, o, q, s are IFA images of plaque recognized by MDV-specific antibody LORF9 (100×); b, d, f, h, j, l, n, p, r, t are regular images of plaque recorded by write light (100×). (B) 1: Md5BACΔLORF10-Re; 2: Md5BACΔLORF10; 3: Md5BAC; 4: Md5; 5: CEF; M: protein marker. |
| 图选项 |
2.5 lorf10是病毒体外增殖非必需基因为了检测lorf10是否为病毒体外复制所必需，将100 PFU Md5、Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re病毒分别感染CEF细胞，在感染后第0、1、2、3、4、5、6天进行病毒蚀斑计数定量。结果表明，Md5、Md5BAC、Md5BACΔLORF10和Md5BACΔLORF10-Re在CEF上的增殖无显著性差异(图 5A)，并且lorf10敲除及复原毒株与亲本毒株的蚀斑大小也无明显差异(图 5B)，这些结果说明lorf10不是MDV体外增殖所必需的基因。
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| 图 5 重组病毒在CEF细胞上的增殖比较 Fig. 5 Viruses propagation analysis in CEF cell culture. (A) Viruses growth curve. (B) Plaque size assay. |
| 图选项 |
3 讨论基因编辑是研究基因功能的生物工程手段。通过对生物遗传特性的改变，达到反向研究基因功能的目的。BAC技术广泛应用于分子生物学、细胞生物学和病毒学等领域，常用于基因治疗和生物定向改造等[10]。过去几十年里，基因编辑技术得到了极大的发展。从序列特异性的核酸内切酶(Cre/loxp)、锌指核酸酶(ZFNs) 和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，直至新兴的基因编辑技术CRISPR，CRISPR介导的基因编辑有着简便高效的优点，但由于技术不十分成熟，仍然存在着脱靶、特殊引物设计和特殊基因完整敲除难度大等问题[11-12]。另外一种成熟的基因编辑技术，BAC技术，在大基因组病毒，如疱疹病毒的研究领域中应用，可以对病毒编码的基因进行非常精确且高效的敲除、插入和点突变等修饰[13-14]。例如，利用BAC技术验证了与MDV致肿瘤相关的microRNA和vTR等基因的功能[15-16]。
我们成功构建了分离MDV野毒株GX0101的细菌人工染色体GX0101BAC (vvMDV) 和MDV特超强毒株686的细菌人工染色体686BAC (vv+MDV)[17-18]。在GX0101BAC中，利用Cre/loxp介导的同源重组技术成功敲除meq、1.8 kb mRNA等基因[19-21]。以686BAC为基因组修饰平台，利用Red酶介导的同源重组技术敲除了686BAC中的meq、RR、vIL8等基因[22]。对MDV基因组功能的研究，较早采用的是粘粒系统，该系统将180 kb的MDV基因组分成5个基因组片段，完成基因组修饰后，将5个片段在鸡胚成纤维细胞上进行共转染，以获得重组病毒[7]。Silva等利用粘粒为载体将BAC载体克隆到rMd5基因组[9]。该修饰平台操作过程烦琐，成功率低，在同源重组过程中容易发生错配现象，可能会造成重组毒株生物特性的改变。为了消除这些潜在的影响，本研究首次将Md5基因组与BAC载体直接连接，构建了重组毒株Md5BAC (图 1)。重组病毒的体外增殖并没有因为BAC的插入而改变(图 4、5)。在此基因修饰平台上，利用Red酶介导的两步重组法成功敲除lorf10也不影响病毒在体外细胞中的复制(图 5)，但lorf10缺失是否影响病毒在体内的生物学特性有待于进一步验证。
Red酶介导的同源重组是基于Red重组酶(Exo、Beta、Gan蛋白) 的基因重组技术，利用这个技术能够高效且精准地对MDV基因组进行基因敲除、插入和点突变等修饰[23-25]。相对于Cre/loxp进行基因修饰后会留有22 bp的FRT位点在基因组中，为下一次基因修饰埋下隐患，Red酶介导的同源重组技术可以任意精准地敲除、插入MDV基因组中的一个或多个基因，以及进行任何基因的点突变，相比于CRISPR技术[26]，Red酶介导的同源重组技术可以方便和精准地制备复原毒株以验证敲除基因的正确性[5, 16]。本研究也首次利用Red酶介导的同源重组技术成功敲除了MDVlorf10基因，体外试验表明，lorf10的敲除不影响病毒增殖，其在体内的功能仍需进一步验证。本研究为进一步构建其他疱疹病毒，尤其是大基因组双链DNA病毒的基因组编辑平台进而进行相关的基因功能以及疫苗研发打下了良好的基础。
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