山西农业大学 生命科学学院，山西 晋中 030801
收稿日期：2020-07-29；接收日期：2020-11-24；网络出版时间：2020-01-06
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金(No. CARS-21)，山西省现代农业产业技术体系建设专项资金(No. 2020-05) 资助
摘要：二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase，Dfr) 是类黄酮生物合成途径中调控花青素和原花青素合成的关键酶。为探究dfr基因在同一生态环境下不同花色黄芩中的差异，以白色、紫红色和紫色3种花色的黄芩花瓣cDNA为模板，基于同源克隆和RACE技术从中克隆得到3个完整的dfr基因全长序列，分别命名为Sbdfr1、Sbdfr2、Sbdfr3，并采用生物信息学软件对其相关结构进行分析。结果表明，3个Dfr蛋白均存在高度保守的NADPH结合位点和底物特异性结合位点。系统进化分析表明，三者与已知粘毛黄芩(GenBank登录号：ACV49882.1) 聚为一簇，亲缘关系最近；关键结构域和3D模型分析发现3个Dfr蛋白表面催化活性区域均存在差异，其独特的结构特性为研究Dfr底物特异性提供了有利条件。qRT-PCR分析显示，dfr在3种花色黄芩盛花期除根外的其他组织中均有不同程度的表达；在花瓣发育进程中，dfr基因在白花和紫花黄芩中的表达量均呈上升趋势，在紫红花黄芩中的表达量先缓慢上升后下降，之后再迅速上升至最大值。研究结果为进一步深入探究Dfr底物选择性的机理及功能提供一定的理论基础，对阐明黄芩花色差异变化的分子机理具有重要的科学研究价值。
关键词：黄芩二氢黄酮醇-4-还原酶基因克隆序列分析时空表达
Cloning and temporal-spatial expression analysis of dfr gene from Scutellaria baicalensis with different colors
Jiangran Wang, Yufen Wang, Shuting Wang, Fangjuan Zhang, Yanbing Niu, Defu Wang
School of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi, China
Received: July 29, 2020; Accepted: November 24, 2020; Published: January 6, 2020
Supported by: China Agriculture Research System (No. CARS-21), Modern Agro-industry Technology Research System of Shanxi Province, China (No. 2020-05)
Corresponding author: Defu Wang. Tel: +86-354-6287205; E-mail: wanderful226@aliyun.com.
Abstract: Dihydroflavanol-4-reductase (Dfr) is a key enzyme that regulates the synthesis of anthocyanin and proanthocyanidin in the flavonoid biosynthesis pathway. To investigate the difference of dfr gene in Scutellaria baicalensis Georgi with different colors in the same ecological environment, three complete full-length sequences of dfr gene were cloned from the cDNA of S. baicalensis with white, purple-red and purple colors using homologous cloning and RACE techniques. The three genes were named Sbdfr1, Sbdfr2 and Sbdfr3, respectively, and their corresponding structures were analyzed. The results showed that all three Dfr proteins have highly conserved NADPH binding sites and substrate-specific binding sites. Phylogenetic analysis showed that they are closely related to that of the known S. viscidula (ACV49882.1). Analysis of key structural domains and 3D models revealed differences in the catalytically active regions on the surface of all three Dfr proteins, and their unique structural characteristics may provide favorable conditions for studying the substrate specificity of different Dfr proteins. qRT-PCR analysis shows that dfr was expressed at different level in all tissues except the roots of S. baicalensis in full-bloom. During floral development, the expression level of dfr in white and purple-flowered Scutellaria showed an overall upward trend. In purple-red-flowered Scutellaria, the expression first slowly increased, followed by a decrease, and then rapidly increased to the maximum. This research provides a theoretical basis for further exploring the mechanism and function of Dfr substrate selectivity, and are of great scientific value for elucidating the molecular mechanism of floral color variation in S. baicalensis.
Keywords: Scutellaria baicalensisdihydroflavanol-4-reductasegene cloningsequence analysistemporal-spacial expression
类黄酮作为植物重要的次生代谢产物，在植物界广泛存在，主要包括二氢黄酮、异黄酮、黄酮、儿茶素、花青素和原花青素几大类[1]。其参与植物多种生理生化反应，包括UV-B照射光保护、病原体防御、保护植物抵御低温等胁迫以及花色形成等[2-3]，同时在抗氧化、抗衰老、抗癌和心脑血管等疾病预防中发挥重要作用[4-7]。
二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4- reductase，Dfr) 是控制花青素生物合成的关键酶之一，它不仅能引导类黄酮途径流向花青素合成方向[8]，更重要的是它在一定程度上决定着花青素的种类与含量。Dfr在辅助因子NADP (H) 的协助下催化二氢山奈酚(Dihydrokaempferol，DHK)、二氢槲皮素(Dihydroquercetin，DHQ) 和二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DHM) 生成相对应的无色的花青素(无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素)，再经花青素合酶(Anthocyanidin synthase，Ans) 和类黄酮3-O-糖基转移酶(Flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene，Uf3gt) 催化生成不同的花青素使植物组织或器官呈现出不同的颜色。目前，已从玉米Zea mays[9]、矮牵牛Petunia hybrida[10]、非洲菊Gerbera hybrida[11]、银杏Ginkgo biloba[12]、甘薯Ipomoea batatas[13]等多种植物中分离克隆出各种dfr基因。尽管研究表明，在许多植物中Dfr可以同时催化3种底物，但有的Dfr只能催化一种底物，具有一定的底物特异性，如矮牵牛和大花蕙兰不能产生基于天竺葵素的橙色花[14]。因此，研究Dfr底物特异性机理对花色改良和育种具有重要意义。
黄芩Scutellaria baicalensis Georgi作为传统的药用植物，因其干燥根富含黄酮类化合物，具有泻火解毒、清热燥湿、延缓衰老和抗肿瘤等作用而被广泛种植[15-18]。目前，对黄芩的研究大多集中在栽培繁育技术、种植模式、病虫害防控技术、有效成分(黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷) 合成途径以及相关药理作用等方面，但对同一生长环境下同一品种出现黄芩花色的差异以及具体的着色机理还鲜有研究。
本研究采用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增(RACE) 技术从3种花色的黄芩中克隆获得了dfr同源基因，通过生物信息学和qRT-PCR技术对dfr在3种花色黄芩中的蛋白结构及时空差异表达模式进行了分析，为该基因的表达和功能研究奠定了基础，为从分子角度解析黄芩花色差异明显变化提供了思路，为更多物种的花色改良及更深入探讨黄芩类黄酮合成途径中调控网络提供了科学依据。
1 材料与方法1.1 试验材料黄芩的3种花色材料于2019年6月初至7月下旬采自山西省太谷县。分别取4个花发育时期的新鲜花瓣及盛花期各个部位的组织材料于液氮中速冻，?80 ℃保存备用(图 1)。
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| 图 1 不同发育时期的黄芩花瓣 Fig. 1 S. baicalensis petals at different growing stages. From top to bottom: white, purple-red and purple flowers of S. baicalensis. F1: young-bud; F2: medium-bud flower; F3: pre-bloom flower; F4: full-blood flower. |
| 图选项 |
1.2 RNA的提取与反转录样本总RNA的提取采用Trizol法，操作步骤参照说明书进行，琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计检测RNA浓度。合格后再参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司) 说明书进行cDNA的第一链合成。
1.3 Sbdfr基因全长克隆根据NCBI上已发表的其他物种dfr基因的序列，通过Primer Premier 5软件在其保守区设计简并引物进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系及反应程序为：ddH2O 13.5 μL、5×PCR缓冲液5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL、特异引物F/R (10 μmol/L) 1 μL/1 μL、Taq plus DNA polymerse (5U) 0.5 μL、cDNA 2 μL。反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。将目的片段与TaKaRa公司的pMD18-T进行连接、转化，送至武汉金开瑞公司测序。获得基因的保守区序列。
依据所得基因的保守区序列，设计5′-RACE和3′-RACE引物，参照SMARTer?RACE 5′/3′Kit试剂盒(TaKaRa) 说明进行5′和3′端扩增。进而得到5′和3′末端序列。利用NCBI中的BLAST工具对获得的保守区序列、5′和3′末端序列测序结果进行检索比对，再运用DNAstar软件包中SeqMan软件对序列进行拼接。根据拼接结果设计特异引物进行Sbdfr基因全长cDNA扩增，获得Sbdfr基因全长。扩增所用引物序列见表 1。
表 1 PCR扩增所用引物Table 1 Primers pairs for PCR amplification
| Primers name | Primers sequences (5′–3′) | Description |
| M13-47 | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC | Universal primers |
| RV-M | GAGCGGATAACAATTTCACACAGG | |
| Sbdfr-5-1 | TCCAGGTCACTCCAACTGGTTTC | 5′-RACE |
| Sbdfr-5-2 | CAGTGTCCCTGCTGAGGTTGTG | |
| Sbdfr-3-1 | AATCTTGGCTGAGAAAGCAGCA | 3′-RACE |
| Sbdfr-3-2 | CCCACCTAGCTTGATCACTGCA | |
| dfr-F | GAYCCYGAGAATGARGTRATHAA | Degenerate primer |
| dfr-R | TCYAVATGBACAWAYTGHCCTTG | |
| Long | CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT | UPM |
| Short | CTAATACGACTCACTATAGGGC | |
| qcdfr-F | AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG | Full length |
| qcdfr-R | TTCTTACTTTTGACACTAGAT | |
| dfr-RT-F | TCCAGCCACGACAGTATG | Real-time quantitative PCR |
| dfr-RT-R | GTGTCAACTTTGTGTCTGCT | |
| Sb18SrRNA-F | GGCTCCAGAAGAGCATCCAAT | |
| Sb18SrRNA-R | AGTTGTACGACCACTGGCAT |
表选项
1.4 生物信息学分析使用NCBI中的Blastn工具对所得序列进行同源性分析。利用ORF finder在线软件查找开放阅读框及翻译获得目的基因编码的氨基酸序列。运用ProtParam、PSORT Ⅱ、SignalP和TMHMM等在线工具分别分析蛋白的氨基酸序列、理论分子量及等电点pI、亚细胞定位、信号肽和跨膜结构域等性质；ProtScale、NCBI Conserved Domains软件分别分析蛋白亲疏水性和保守结构域；运用软件NetPhos 3.1 Server和NetOGlyc 4.0 Server对蛋白进行磷酸化和糖基化位点预测。运用在线软件SOPMA、Swiss-Model分别进行相应的蛋白二级结构和三级结构的预测。氨基酸多序列比对采用DNAMAN软件进行。利用MEGA 7软件邻近结合法(Neighbor-Joining，NJ) 构建蛋白氨基酸序列的系统进化树，bootstrap值为1 000次。
1.5 实时荧光定量PCR及数据分析以3种花色黄芩花发育的4个时期的花瓣及盛花期的不同组织为材料分别提取RNA，进行反转录稀释后，参照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 试剂盒(TaKaRa) 进行实时荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR引物见表 1。20 μL反应体系为：cDNA模板2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各0.8 μL，灭菌超纯水6 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，42个循环。样品均进行3次生物学重复。采用2–△△Ct值法分析dfr基因在3种花色黄芩不同发育阶段和不同组织中的表达情况。基于SPSS22.0软件中的ANOVA法和Duncan’s法进行单因素方差和显著性差异分析。利用GraphPad Prism 7.0软件进行图形分析。
2 结果与分析2.1 Sbdfr基因的克隆以白花、紫红花和紫花黄芩花瓣cDNA为模板，利用简并引物进行保守序列的扩增，分别获得392 bp、389 bp和391 bp的目的片段。进而通过RACE技术扩增5′端及3′端基因组序列，分别获得531 bp、532 bp、540 bp的5′端目的片段和708 bp、700 bp、707 bp的3′端目的片段。利用SeqMan软件对测序结果进行拼接。获得3种花色黄芩的全长序列。测序结果显示3个目的基因片段大小分别为1 436 bp、1 441 bp和1 452 bp，将克隆所得白花黄芩dfr基因序列命名为Sbdfr1 (GenBank登录号为MW148159)、紫红花黄芩命名为Sbdfr2 (GenBank登录号为MW148160)、紫花黄芩命名为Sbdfr3 (GenBank登录号为MW148161)。结果均符合预期的片段长度(图 2)。
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| 图 2 Sbdfr基因的克隆 Fig. 2 Cloning of Sbdfr gene. PCR product of (A) Sbdfr1. (B) Sbdfr2. (C) Sbdfr3. M: DL 2 000TM DNA marker; 1–3: cDNA amplification; CK: control. |
| 图选项 |
2.2 序列分析经Blast比对发现，白花、紫红花和紫花黄芩的3个序列与已知粘毛黄芩dfr基因(GenBank登录号：FJ605512.1) 有较高的相似性，分别为99.48%、99.61%、99.87%。利用ORF finder，ProtParam在线工具对3个dfr核苷酸序列进行分析表明(表 2)，3个基因都包括1 167 bp的ORF，共编码388个氨基酸。3个Dfr蛋白的理化性质较为相近。其中Sbdfr2分子量最大为40.47 kDa。Sbdfr2理论等电点最大为5.29，在组成Dfr蛋白的氨基酸中，含量最丰富的均是苏氨酸(Thr)，其次是谷氨酸(Glu)。不稳定系数均小于40，推测蛋白均比较稳定。总平均疏水值(GRAVY) 均为负，为亲水性蛋白。
表 2 不同花色黄芩的Dfr的理化性质Table 2 Physical and chemical properties of Dfr of S. baicalensis with different colors
| Physical and chemical properties | Sbdfr1 | Sbdfr2 | Sbdfr3 |
| Number of amino acids | 388 | 388 | 388 |
| Molecular weight | 43 426.66 | 43 474.75 | 43 340.48 |
| Theoretical pI | 5.22 | 5.29 | 5.22 |
| Formula | C1936H3035N501O589S21 | C1941H3039N501O588S21 | C1927H3025N501O591S21 |
| Instability index | 33.48 | 34.07 | 35.52 |
| Total number of negatively charged residues | 51 | 51 | 51 |
| Total number of positively charged residues | 34 | 35 | 34 |
| Grand average of hydropathicity | –0.257 | –0.261 | –0.278 |
表选项
2.3 黄芩Dfr蛋白结构分析利用在线工具NCBI Conserved Domains进行结构域分析(图 3)，发现3个Sbdfr基因编码的Dfr蛋白(白花黄芩：SbDfr1；紫红花黄芩：SbDfr2；紫花黄芩：SbDfr3) 都具有两个NADB-Rossmann super family的保守结构域，即NADPH结合结构域和底物特异性结合结构域。疏水性预测分析结果表明，在SbDfr1的氨基酸序列中，第198位氨基酸疏水性最强，Score值为2.389，第355位氨基酸亲水性最强，Score值为–2.900，且亲水氨基酸多于疏水氨基酸，总体平均疏水值为–0.257，推测该蛋白为亲水性蛋白。对SbDfr2和SbDfr3进行疏水性分析，发现均为亲水性蛋白。信号肽预测显示，3个Dfr均没有信号肽，为非分泌性蛋白。推测3个基因在进行蛋白合成时，在核糖体上起始合成后不经蛋白转运直接在细胞质中催化合成。跨膜结构预测结果表明，3个蛋白均无跨膜结构。亚细胞定位的分析显示，预测3个蛋白可能分布在细胞质(55.6%)、线粒体(33.3%) 和分泌的囊泡(11.1%) 中。
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| 图 3 白花黄芩Dfr蛋白的保守结构域预测 Fig. 3 Prediction of the conserved domain of Dfr protein in white Scutellaria. The NADPH binding domain and substrate specific binding domain are marked by red frame. |
| 图选项 |
Dfr蛋白的磷酸化和糖基化位点预测结果显示(图 4)，SbDfr1蛋白中有16个丝氨酸(Ser)、17个Thr、5个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点和12个O糖基化位点；SbDfr2中有16个Ser、19个Thr、5个Tyr磷酸化位点和11个O糖基化位点；SbDfr3中有18个Ser、18个Thr、5个Tyr磷酸化位点和16个O糖基化位点。
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| 图 4 白花黄芩Dfr蛋白的磷酸化位点预测 Fig. 4 Prediction of phosphorylation site of Dfr protein in white Scutellaria. The Ser, Thr, Tyr and Thr phosphorylation site are indicated with red, green, blue and pink lines respectively. |
| 图选项 |
通过在线工具SOPMA对dfr基因编码的蛋白质进行二级结构预测及氨基酸序列分析，发现三者结构相似，均由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠结构元件构成。其中SbDfr1、SbDfr2、SbDfr3结构中，α-螺旋(Helix) 比例分别为36.60%、38.66%、36.60%，延伸链(Strand) 比例分别为13.66%、12.37%、12.89%，β-折叠(Turn) 比例分别为6.44%、6.44%、6.96%和无规则卷曲(Coil) 比例分别为43.30%、42.53%、43.56%。进一步分析发现，三者的催化残基位点有所差异，其中SbDfr1和SbDfr3在第136、138、171和175位氨基酸处存在发挥催化作用的位点，而SbDfr2在第136、160、164、171和175位氨基酸处存在催化位点。
为进一步明确Dfr蛋白发挥催化活性的关键结构域，基于PDB数据库中的葡萄属Dfr蛋白(PDB登录号：3bxx.1.A) 三维结构模型进行Dfr蛋白关键结构域的3-D模型的预测(图 5)，利用phyre2和pymol软件对Dfr氨基酸序列进行分析，3个Dfr预测结构显示，与模板结构相似度分别为69.42%、69.94%和69.85%，包含6个β-转角：β1 (15–19位aa)、β2 (38–45位aa)、β3 (88–92位aa)、β4 (130–140位aa)、β5 (192–197位aa)、β6 (257–260位aa)；两对α-螺旋：α1 (24–35位aa)、α2 (98–125位aa)、α3 (170–188位aa)、α4 (239–251位aa)。其中6个β-转角和两对α-螺旋形成了Rossmann折叠区，是辅酶NADP+和Dfr底物特异性结合位点区。本研究发现，在第121位点，SbDfr1是亮氨酸，为疏水氨基酸，SbDfr2和SbDfr3是丝氨酸，属亲水氨基酸；在第164位点，SbDfr2是赖氨酸，SbDfr1和SbDfr3是天冬氨酸。这两个差异位点均处在Rossmann折叠结构中，其位点差异可能导致Dfr选择性催化底物。基于其关键结构域的3D模型分析，发现其表面催化活性蛋白区域有所差异，该结构区域碱基的突变可能会影响催化底物的改变。
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| 图 5 黄芩Dfr蛋白关键结构域的3-D模型构建 Fig. 5 Construction of 3-D model of key domain of Dfr protein in S. baicalensis. The same secondary structure in the same area is marked with the same color. Different color regions in the protein structure on the right correspond to the corresponding secondary structure in the left picture. Construction of 3D model of (A) SbDfr1 protein key domain. (B) SbDfr2 protein key domain. (C) SbDfr3 protein key domain. |
| 图选项 |
2.4 Dfr的序列比对和系统进化分析利用DNAMAN软件将克隆所得的3个Dfr蛋白与其他物种蛋白氨基酸序列进行多重比对分析，分析结果显示3个Dfr氨基酸序列都具有高度保守的功能区域和非常高的同源性。白花、紫红花与紫花黄芩dfr基因编码的蛋白的同源性分别为99.48%和99.23% (图 6)。在其N端第18–38位的氨基酸之间存在高度保守的NADPH结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLLQHGY”。
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| 图 6 SbDfr与不同物种Dfr蛋白的氨基酸序列比对 Fig. 6 Amino acid sequence alignment between SbDfr and Dfr proteins from different species. NADP highly conserved binding regions are marked with red square, and substrate specific binding regions are marked with black line. The red arrow indicates the amino acid site that determines the specificity of the enzyme substrate. NlDfr: Nicotiana langsdorffii Dfr, ACS12835.1; PfDfr: Perilla frutescens Dfr, BAA19658.1; PsDfr: Plectranthus scutellarioid Dfr, ABP57077.1; SaDfr: Striga asiatica, GER27969.1; StDfr: Solanum tuberosum Dfr, AFQ98276.1; SvDfr: Scutellaria viscidula Dfr, ACV49882.1; VvDfr: Vitis vinifera Dfr, CAA53578.1. |
| 图选项 |
为明确3种花色黄芩的进化与起源关系，将所得的核酸序列进行BlastX分析，而后利用MEGA5.2软件将其与具有同源性的其他植物构建氨基酸序列系统进化树(图 7)。结果显示，所选植物的Dfr分成两大分支，克隆得到的3个Dfr蛋白SbDfr1、SbDfr2和SbDfr3与已知粘毛黄芩(GenBank登录号ACV49882.1) 亲缘关系最近，与同为唇形科的丹参、植物钓钟柳等聚为一大簇，亲缘关系较近。与茄科的马铃薯、矮牵牛及辣椒等亲缘关系相对较远。
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| 图 7 基于氨基酸序列构建Dfr系统进化树 Fig. 7 Phylogenetic tree of Dfr constructed based on amino acid sequences. PlDfr: Paeonia lactiflora Dfr, QIC54081.1; NlDfr: Nicotiana langsdorffii Dfr, ACS12835.1; SmDfr: Salvia miltiorrhiza Dfr, AWX67418.1; PbDfr: Penstemon barbatus Dfr, AIY51701.1; AaDfr: Angelonia angustifolia Dfr, AHM27144.1; RsDfr: Raphanus sativus Dfr, AGU42192.1; CmDfr: Chrysanthemum x morifolium Dfr, ABK88310.2; SmDfr: Saussurea medusa Dfr, ABQ97018.1; LrDfr: Lycium ruthenicum Dfr, ATB56299.1; TaDfr: Triticum aestivum Dfr, AAO53552.1; TgDfr: Tulipa gesneriana Dfr, BAH98155.1; AtDfr: Arabidopsis thaliana Dfr, NP_199094.1; RmDfr: Rosa multiflora Dfr, AJT55524.1; MsDfr: Medicago sativa Dfr, AEI59122.1; IbDfr: Ipomoea batatas Dfr, AEQ92209.1; DcDfr: Dianthus caryophyllus Dfr, CAA91924.1; PoDfr: Plantago ovate Dfr, AMR60823.1; AcDfr: Aconitum carmichaelii Dfr, AMR60823.1; SpDfr: Solanum pinnatisectum Dfr, AAX63400.1; CaDfr: Capsicum annuum Dfr, ACN60404.1. |
| 图选项 |
2.5 Sbdfr mRNA表达分析以黄芩紫花F1时期Sbdfr1表达量为基准，研究了dfr在不同花色黄芩中不同发育时期mRNA的表达情况(图 8A)。结果显示，在白花黄芩花期发育过程中，Sbdfr1的表达量从F1至F3期呈缓慢上升趋势，后期迅速增加，F4期表达
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| 图 8 dfr在白花、紫红花和紫花黄芩不同发育时期、不同组织的相对表达 Fig. 8 Relative expression of dfr in different development stages and tissues of white, purple-red and purple S. baicalensis petals. (A) Relative expression of dfr in different development stages. Histograms with different uppercases letters indicate extremely significant differences at different development stages of the same flower (P < 0.01). ****, ** and NS indicate that the expression of dfr in different colors S. baicalensis at same time had significant difference at the 0.01 level, significant difference at the 0.05 level and no difference at the 0.05 level, respectively. (B) Relative expression of dfr in different tissues. Histograms with different uppercases letters indicate extremely significant differences at different tissues of the same development stages (P < 0.01). **** indicate that the expression of dfr in different colors S. baicalensis at same tissues had significant difference at the 0.01 level. |
| 图选项 |
量达到最大值，极显著高于其他时期和其他花色(P < 0.01)；在紫红花黄芩花期发育过程中，Sbdfr2在花蕾开始着色的F1期的表达量最高，显著高于Sbdfr1和Sbdfr3 (P < 0.05)，花瓣完全盛开时期，其表达量最低；在紫花黄芩花期发育过程中，Sbdfr3的表达量在F1至F3期整体保持极缓慢上升趋势，在F4期时显著上升，表达量是F3期的3倍。
为进一步研究dfr基因在3种花色黄芩盛花期的组织特异性表达情况，以紫花黄芩茎部的dfr表达量为基准，通过实时荧光定量PCR技术进行了研究(图 8B)，发现dfr基因在3种花色黄芩地上部分的不同组织中均有不同丰度的表达，其中在各花色中花瓣的表达量最高，均极显著高于茎和叶(P < 0.01)。其中紫花在叶中的表达量高于茎中的表达量，而白花和紫红花在叶中的表达低于茎中。
3 讨论本研究通过RACE技术从白色、紫红色和紫色的黄芩花中成功克隆Sbdfr1、Sbdfr2和Sbdfr3的cDNA序列，将其CDS进行Blast比对，发现3个序列具有很高的相似性。在对其理化性质、亲疏水性、跨膜结构、亚细胞定位及结构预测中发现，3个基因相似性较高，均为亲水性蛋白，都不具有信号肽，为非分泌性蛋白。亚细胞定位预测结果显示，Dfr蛋白主要集中在细胞质中，符合上述推断。最后阶段花色苷的形成需要经过一系列糖基化、磷酸化、甲基化等的修饰，在对3个蛋白的磷酸化位点和糖基化位点预测分析中，发现白花、紫红花和紫花的磷酸化位点和糖基化数目均不相同，推测这些差异可能是黄芩不同花瓣颜色中的Dfr催化底物不同所致。将Sbdfr1、Sbdfr2和Sbdfr3编码的序列与已登录的其他物种Dfr进行多重序列比对，发现都具有高度保守的NADPH结合位点和底物特异性位点。Johnson等[12]通过对非洲菊的研究表明，其底物的特异性则是由其第134位至145位间的氨基酸残基直接决定的。依据第134位的氨基酸残基种类将Dfr分为3类，第一类为天冬酰胺(Asn，N) 型Dfr，大多数植物的Dfr为此类型，其氨基酸残基为Asn；第二类为天冬氨酸(Asp，D)型Dfr，其氨基酸残基为Asp，此类Dfr则不具有催化DHK的活性，如矮牵牛；第三类为非Asn/Asp型Dfr，其氨基酸残基既不是Asn也不是Asp。Chen等[19]对鳞毛蕨中决定底物特异性位点的精氨酸进行了研究验证，推测精氨酸(Arg，R) 型Dfr是一种新的功能性Dfr。根据此特点，研究人员通过进行花色改良来提高其观赏价值。如Chu等[20]将月季的RcDfr基因导入矮牵牛中，表现出与原色不同的颜色。本研究中3种花色黄芩的SbDfr均为Asp型，但却表现出不同的表型，推测可能是花青素合成途径中其他结构基因及转录因子调控dfr基因表达所致，或者是Dfr催化底物异构化所致。
Dfr选择性地催化3种二氢黄酮醇(DHK、DHQ、DHM) 形成相应的花色素，显示出特定的底物偏好性。三种二氢黄酮醇在结构上仅在B环上的羟基数目不同，因此Dfr的底物特异性是由底物结合区域编码的蛋白和底物B环之间不同的相互作用引起的[21-22]。Katsu等[23]对荞麦FeDfr研究发现，Dfr的底物特异性不仅仅由决定底物特异性的区域中第3位氨基酸的类型决定，而且它的邻近残基也参与了底物口袋的形成，在决定底物偏好性方面起着重要的作用。因此，本研究基于其关键结构域进行了分析和3D模型的构建，发现其表面催化活性蛋白区域有所差异，推测其独特的结构是决定Dfr选择性催化底物的关键。
植物中花青素的合成途径中受一系列关键酶催化及相关转录因子共同协作影响[24]，如苯丙氨酸解氨酶(Pal)、查尔酮异构酶(Chi)、类黄酮-3′-羟基化酶(F3′h)、类黄酮-3′, 5′-羟基化酶(F3′-5′h)花青素合酶(Ans) 和糖基转移酶(Ufgt) 等。其在植物不同组织的表达以及在不同花期的花瓣的表达模式，与植物的颜色表型具有一致性。Meng等[25]研究证实MYB激活因子WP1能够与bHLH家族蛋白MtTT8和MtWD40-1互作形成复合体，共同调节蒺藜苜蓿的花瓣颜色。Li等[26]发现bHLH3异常表达会导致桑葚果实色素成分差异。dfr作为类黄酮花青素成途径的一个决定性的关键酶基因，对其在3种花色黄芩中的表达模式进行了研究。结果发现Sbdfr在黄芩地上部分各组织均有表达，但表达丰度有所差异，均在花瓣中最高，其中Sbdfr3在叶中的表达量高于茎，Sbdfr1和Sbdfr2则相反。推测该基因参与调控植物各组织的着色，影响类黄酮途径中的代谢流向。在花瓣发育进程中，Sbdfr在3种花色黄芩中基本都是在F1至F3时期呈缓慢上升趋势，而后在F4时期表达量迅速增加，且白花中dfr的表达量最高，显著高于其他花色，在紫花和紫红花黄芩花瓣中均检测到花色苷的大量积累，而在白花黄芩中几乎检测不到，推测可能白花在花瓣着色过程中，dfr基因正常表达，下游基因ans和ufgt表达异常所致。黄芩花色出现差异是由单基因dfr作用影响还是由多个基因叠加作用后的结果，以及如何调控和协同作用，还需进一步的深入研究。后续试验将从构建3种底物(DHK、DHQ、DHM) 分子复合物和SbDfr对接模型和克隆花色苷合成途径中的其他关键酶基因及转录因子两方面着手，为阐明黄芩花色差异和Dfr底物选择性分子机制奠定基础。
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