1. 北京化工大学 生命科学与技术学院，北京 100029;
2. 塔里木大学 生命科学学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300
收稿日期：2020-07-01；接收日期：2020-10-13
基金项目：国家重点研发计划(No. 2017YFA0105900)，京津冀基础研究合作专项(No. 19JCZDJC65800(Z))，中央高校基本科研业务费(No. buctrc201910) 资助
摘要：基因组编辑技术(Genome editing technology) 是一种通过人工手段在基因组水平对DNA序列进行改造的遗传操作技术，包括特定DNA片段的插入、敲除、替换和点突变。其中，依赖核酸酶的基因组编辑技术的基本原理是在基因组的特定位置产生双链DNA断裂(Double-stranded break，DSB) 后通过非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ) 或同源重组(Homologous recombination，HR) 的方式进行修复。随着对核酸酶更深入的研究，基因组编辑技术也得到了快速发展，其中最常使用的核酸酶主要包括巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins (Cas)。文中在介绍上述基因组编辑技术的发展及作用原理的基础上，主要综述了CRISPR/Cas9系统在基因功能鉴定、疾病模型建立、基因治疗和免疫治疗等应用领域的研究进展，并对其未来发展进行了展望。
关键词：基因组编辑CRISPR/Cas9单碱基编辑转录调控肿瘤
CRISPR/Cas9 technology in disease research and therapy: a review
Mengran Shi1, Zongyi Shen1, Nan Zhang1, Luyao Wan1, Changyuan Yu1, Zhao Yang
1. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China;
2. College of Life Science, Engineering Laboratory of South Xinjiang Chemical Resources Utilization of Xinjiang Production and Construction Corps, Tarim University, Alar 843300, Xinjiang, China
Received: July 1, 2020; Accepted: October 13, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFA0105900), Beijing-Tianjin-Hebei Basic Research Cooperation Special Project (No. 19JCZDJC65800(Z)), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. buctrc201910)
Corresponding author: Zhao Yang. Tel: +86-10-64421335; E-mail: yangzhao@mail.buct.edu.cn.
Abstract: Genome editing is a genetic manipulation technique that can modify DNA sequences at the genome level, including insertion, knockout, replacement and point mutation of specific DNA fragments. The ultimate principle of genome editing technology relying on engineered nucleases is to generate double-stranded DNA breaks at specific locations in genome and then repair them through non-homologous end joining or homologous recombination. With the intensive study of these nucleases, genome editing technology develops rapidly. The most used nucleases include meganucleases, zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated Cas proteins. Based on introducing the development and principles of above mentioned genome editing technologies, we review the research progress of CRISPR/Cas9 system in the application fields of identification of gene function, establishment of disease model, gene therapy, immunotherapy and its prospect.
Keywords: genome editingCRISPR/Cas9base editingtranscriptional regulationtumor
1 CRISPR/Cas9技术1.1 CRISPR技术简介1.1.1 CRISPR系统概述CRISPR/Cas系统是来自细菌及古生菌的一种天然免疫系统，由CRISPR序列和高度多样化的Cas蛋白组成。CRISPR序列由重复序列区(Repeats) 和间隔区(Spacers) 组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构，间隔区是被俘获的外源DNA序列。Cas蛋白根据功能可以分为4个模块：适应模块主要参与获取Spacer以及外源基因整合到CRISPR序列的过程；表达处理模块负责pre-crRNA的处理；干扰和效应子模块参与靶标识别和切割；信号转导和辅助模块是一系列功能不同的基因的集合。
基于Cas蛋白的序列、组合差异，CRISPR系统可被分为2个大类。1类CRISPR/Cas系统为多个Cas蛋白组成的效应子模块，而2类CRISPR/Cas系统为单个多域的Cas蛋白效应子模块。Cas蛋白分类示意图见图 1。
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| 图 1 Cas蛋白分类示意图[1] Fig. 1 Schematic of Cas protein classification[1]. |
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1类CRISPR/Cas系统包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型；2类CRISPR/Cas系统结构简单、靶向效率高，目前已广泛应用于基因编辑领域。其中，Ⅱ型的效应蛋白Cas9有两个结构域：HNH和RuvC样核酸酶结构域，每个结构域负责切割DNA的一条链；Ⅴ型效应蛋白Cas12仅包含一个可切割两条链的RuvC样结构域；Ⅵ型效应蛋白Cas13包含两个HEPN域，可靶向切割DNA和RNA[1-3]。
1.1.2 作用原理作为细菌应对外源遗传物质(如噬菌体) 的入侵而形成的适应性免疫，CRISPR系统的不同分型产生防御作用的过程相似，可总结为以下3个阶段：适应阶段、表达阶段及干扰阶段。以CRISPR/Cas9系统为例，当细菌检测到噬菌体DNA时，噬菌体DNA中的被称为前间隔序列的一小段被截取下来整合到细菌的CRISPR序列中，产生“免疫记忆”，此为适应阶段；当同样的噬菌体再次侵入，带有外源遗传物质的CRISPR序列可以迅速转录出前体CRISPR RNA (pre-crRNA)，在RNase Ⅲ的作用下被加工成为成熟的crRNA，与tracrRNA互补形成双链RNA结构，此为表达阶段；这个双链结构可与Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合体，在这个复合体中Cas9蛋白负责识别特定的前间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM)，双链RNA负责与靶序列结合，同时符合上述两个条件，Cas9蛋白的酶切活性才能被激活。被激活的Cas9蛋白可以促使靶基因产生双链DNA断裂(Double-stranded DNA breaks，DSB)，此为干扰阶段。图 2为CRISPR/Cas9技术示意图。
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| 图 2 CRISPR/Cas9技术 Fig. 2 CRISPR/Cas9 technology. |
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最近几年，研究人员发现CRISPR系统不仅可以用来切割病毒DNA，也可以精确地切割其他的DNA序列，crRNA-tracrRNA被简化为单链导向RNA (Single guide RNA，sgRNA)，可以被简单地设计、合成，通过改变sgRNA的序列即可匹配靶基因，进而引导Cas9蛋白到指定位置切割DNA。针对产生的DSB，细胞有两种相应的DNA断裂修复机制：非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ) 和同源重组(Homologous recombination，HR)。其中NHEJ是一种主要的修复方式。简单来说就是多种修复酶在DNA断裂处强行将两段DNA连接起来，因此这种修复方式比较容易出现错误，造成插入或缺失突变(Indel)。而HR是一种更精确的修复方式，需要提供外源DNA片段，在产生DSB后，这个外源片段可以与切割末端配对重新组合，对断裂的基因进行替换或修复。
1.2 CRISPR/Cas9技术与其他基因组编辑技术的比较1.2.1 巨型核酸酶巨型核酸酶(Meganuclease) 是一种具有较大的切割识别位点(14–40 bp) 的核酸内切酶，由于其识别位点较长，这种基因编辑的方法特异性很高。巨型核酸酶主要以归巢核酸内切酶(Homing endonuclease，HEs) 为代表，可在归巢的过程中引发DSB随后诱导基因重组[4]。
酿酒酵母的线粒体内含子编码的核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ是一种归巢核酸内切酶，负责内含子归巢。有研究证明Ⅰ-SceⅠ可以在小鼠基因组的预测位置引入DSB，并且利用断裂部位两侧的供体分子同源区域修复断裂，这种诱导的同源重组的频率比自发同源重组的频率高大约2个数量级，证明了Ⅰ-SceⅠ在设计基因组重排中的有效性。
Smith等通过半理性设计，首先选择Ⅰ-CreⅠ的几个残基(例如：K28、N30、D75) 进行突变，结合高通量筛选(High-throughput screening，HTS)，从Ⅰ-CreⅠ衍生出了数百种新型核酸内切酶[5]。又对Ⅰ-CreⅠ与DNA结合的亚结构域进行突变，使核酸酶可实现对选定DNA序列的切割。最终，这些突变被组装到一起形成了一个异源二聚体核酸内切酶，在酵母细胞内实现了对RAG基因的特异性切割，证明了通过改造可以生成新型核酸内切酶，扩宽其在基因组工程领域的应用范围。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin-9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PSK9) 可以阻碍有害的低密度脂蛋白(LDL) 胆固醇从血液中移除，增加人患心血管疾病的危险。有研究证明抑制PCSK9可通过降低血清胆固醇来治疗心血管疾病[6]。Wang等对猴子静脉注射Ⅰ-CreⅠ[7]，6个月后，在被处理的猴子中检测到约60%的肝细胞的PCSK9基因被敲除，与对照相比，PCSK9蛋白的血液表达降低约80%，LDL胆固醇降低60%，为不能耐受抗PCSK9蛋白药物的高胆固醇心脏病患者提供了一种治疗策略。
巨型核酸酶本身的编码基因约1 kb，所以很容易包裹在腺病毒载体(Adeno-associated viral vector，AAV) 中进行递送，且识别位点长，所以这种基因编辑的特异性很高。但这种较长的靶标位点即使在大型基因组内也很罕见，虽然可以通过蛋白改造以扩宽巨型核酸酶的识别范围，但该过程成本高且耗时，这也就导致了巨型核酸酶无法广泛应用。
1.2.2 锌指核酸酶锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs) 是较早出现的一种基因编辑方式[8]，模块化架构简单，由可结合DNA的锌指结构域和衍生自FokⅠ限制酶的核酸酶结构域组成，二者通过短的接头序列连接。每个锌指可以特异性识别3–4个碱基，3个锌指最多可以与18 bp的DNA靶序列结合，这样的序列在基因组水平已具有特异性，可以实现基因的定位。由于FokⅠ仅在作为二聚体时才具有酶促活性，所以，当正反两个互补的识别位点间距离为6–8 bp时，两个FokⅠ形成二聚体后进行酶切，从而使DNA双链断裂[9]。图 3为锌指核酸酶技术示意图。
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| 图 3 锌指核酸酶技术 Fig. 3 Zinc finger nuclease technology. |
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Naldini研究组利用整合酶缺陷型慢病毒载体(Integrase-deficient lentivirus，IDLV) 递送ZFN，靶向不同细胞类型的IL-2受体通用γ链基因[10]，并提供在不同细胞类型中进行基因编辑的模板DNA，结果在靶基因处实现了13%–39%的编辑效率。
线粒体疾病是一种因线粒体DNA (Mitochondrial DNA，mtDNA) 突变引起的疾病，通常突变的mtDNA的和野生型mtDNA是共存的，当突变mtDNA的比例超过60%时就会出现相应症状，所以治疗线粒体疾病的一个策略就是将突变的mtDNA比例降至60%以下。由于线粒体内缺少良好的DNA修复策略，所以一旦产生DSB，mtDNA很容易被降解。Minczuk研究组通过AAV将靶向突变mtDNA的ZFN静脉注射入小鼠[11]，随后被运送至小鼠心脏，结果发现中等剂量的注射策略得到了最好的效果，心脏组织中突变mtDNA的比例由73%下降至37%，下降约40%，有效地改善了心脏代谢功能。
亨廷顿基因(Huntingtin，HTT) CAG序列的异常扩增将导致突变蛋白(Mutant HTT，mHTT)的表达，从而引起亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD) 的发生。Zeitler等将锌指蛋白(Zinc-finger protein，ZFP) 与Kox1的转录阻遏结构域Krüppel-associated box (KRAB) 融合表达，所得到的锌指蛋白转录因子(ZFP-transcription factors，ZFP-TFs)，能够靶向致病性重复CAG序列。在源自亨廷顿舞蹈症患者的成纤维细胞和神经元中，ZFP-TFs可抑制99%的致病基因(mHTT) 的表达，而保留了 > 86%的正常HTT基因的表达。上述研究结果证明了ZFP-TFs在HD方面的治疗潜力[12]。
虽然ZFNs的编辑效率较高，但这种基因编辑的方法需要不同锌指核酸酶的组合保证基因编辑的序列特异性；然而为不同的靶序列设计不同的锌指核酸酶工作量大、效率低，限制了其广泛使用。
1.2.3 转录激活因子样效应物核酸酶转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like (TAL) effector nucleases，TALENs) 是ZFNs后出现的另一种基因编辑效应蛋白[13]，其原理与ZFNs相似，主要由与DNA结合的TALE模块和核酸酶结构域组成。其中，TALE的识别模块由34个氨基酸组成，每种碱基都有相对应的TALE模块，所以理论上，按照目标序列将不同的TALE模块连接就可以识别特定序列。FokⅠ与TALE结合后形成TALEN蛋白，当一对TALE识别靶点处的正反序列后，FokⅠ形成二聚体对DNA进行切割。图 4为转录激活因子样效应物核酸酶技术示意图。
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| 图 4 转录激活因子样效应物核酸酶技术 Fig. 4 Transcription activator-like effector nuclease technology. |
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Hockemeyer等首次将TALENs技术用于干细胞领域[14]，在人类胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs) 和诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS cells) 的5个位点评估TALENs进行基因修饰的频率，结果在5个位点处得到了与基因位点相关的不同频率的基因修饰。例如对于OCT4基因的第一个外显子，编辑频率在67%–100%之间，而对于OCT4的终止密码子区域，编辑频率在2%–46%之间。Bacman等通过AAV将靶向突变的mtDNA的TALEN注射入小鼠肌肉，6个月后发现小鼠肌肉内突变mtDNA的比例下降了约50%[15]。
与ZFN相比，TALEN更容易设计，并且在一项靶向C-C趋化因子受体5 (C-C motif chemokine receptor 5，CCR5) 的特异性实验中[16]，ZFN造成了11%的错误突变，而TALEN的错误突变率仅为1%，证明了TALEN有着比ZFN更高的准确率。TALEN一度处在基因组编辑技术的最前沿，但同时，TALEN的模块组装困难，使得TALEN模块组装周期较长，且组装好的TALEN较大，使用载体向细胞内递送存在障碍。虽然一些研究开发了构建模块的方法[17-19]，但其领先地位在CRISPR技术出现后逐渐被取代[20]。
1.2.4 CRISPR/Cas9技术2013年出现了大量针对CRISPR技术的报道[21-24]，标志着基因组编辑技术进入了一个新的阶段。CRISPR/Cas9技术是通过sgRNA的序列保证基因编辑的特异性，并不涉及与FokⅠ的连接，免疫原性较低。可见，与其他基因编辑方法相比，CRISPR/Cas9技术效率高、安全性高、通量高、方法简单且易实现。
2 CRISPR/Cas9技术的应用2.1 基因敲除2.1.1 基因功能的鉴定随着分子生物学和测序技术的发展，人们对疾病的认识进入了分子水平，发现了人类许多疾病的发生、进展都可能与基因突变相关。例如：某些原癌基因的突变可促使肿瘤的发生，甚至某些抑癌基因的突变可通过导致原癌基因的激活从而使肿瘤发生等[25]。所以确定与疾病密切相关的基因及其功能将有助于为临床治疗提供更好的策略。随着CRISPR技术的迅速发展，基于CRISPR技术的基因组筛选在实验室水平上已得到了广泛的应用，这种筛选方法具有文库设计灵活、操作简单、覆盖范围广等优点。
为了确定急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML) 细胞增殖过程中的关键代谢酶基因，Lowe研究组对AML细胞进行了以代谢酶为靶点的CRISPR/Cas9功能基因组筛选，鉴定出吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase，PDXK)，负责催化维生素B6生成磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate，PLP)，能够促进AML细胞利用维生素B6，进而产生AML增殖所需的关键酶和核苷酸等[26]。当PDXK被抑制或阻断后，AML细胞无法利用维生素B6，增殖受阻。而破坏PDXK对其他肿瘤细胞(如人肉瘤细胞等) 的增殖无显著影响。该研究表明，通过抑制PDXK或阻断维生素B6信号通路的激活是一种潜在的治疗AML的方法。
融合基因是指两种基因的编码区异常结合在一起的现象，经常发生于实体瘤中。目前，已报道的融合基因有20 000多种，但它们在肿瘤发生和进展中的作用尚不完全清楚。Garnett研究组分析了来自43种不同癌症类型的8 000多种融合基因[27]，并利用CRISPR/Cas9文库筛选，首次发现了在胶质母细胞瘤AM-38细胞、卵巢癌ES-2细胞、头颈癌SAS细胞中共同存在的一种融合基因YAP1-MAML2。这种融合基因通过上调表达YAP1，激活Hippo信号传导，进而促进肿瘤细胞的耐药、抗凋亡和进化，最终导致肿瘤患者的不良预后[28]。综上，抑制Hippo信号通路是治疗具有YAP1-MAML2融合基因实体瘤的新思路。
吉西他滨是治疗晚期或转移性胆囊癌的一种有效药物，但某些患者对于这种治疗策略存在抗药性甚至不良反应。为了鉴定胆囊癌的耐药机制，Xu等利用CRISPR/Cas9技术对胆囊癌细胞NOZ进行了功能基因组筛选，鉴定了ELP5基因的缺失赋予了NOZ细胞抵抗吉西他滨的能力[29]。机制方面，ELP5是延伸因子复合物(Elongator complex) 的亚基，它的缺失能够诱导延伸因子复合物的降解。更重要的是，ELP5的缺失显著降低了异质核糖核蛋白Q的表达，从而抑制P53蛋白的磷酸化和激活。最终，P53的表达量下降或活性抑制是胆囊癌细胞抵抗吉西他滨的主要原因。综上，延伸因子复合物-hnRNPQ-P53通路参与调控胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性，增强该信号通路是一种潜在的治疗策略。
在另外一项研究中，Chen等通过mGeCKOa文库处理一株非转移性小鼠非小细胞肺癌细胞[30]，然后将病毒感染的细胞移植给免疫缺陷小鼠，制备皮下移植瘤模型。肿瘤形成后，将原发灶和转移灶的肿瘤分离并进行测序比较、分析sgRNA的富集程度。测序结果表明Nf2、pten、cdkn2a、trim72、fga等基因的缺失与肿瘤转移密切相关。
因此，CRISPR系统的基因组筛选技术的快速发展，有效地推动了致病基因和疾病新型治疗靶点的筛选鉴定，促进了疾病的分子分型和预后预测等诸多领域的研究进程，为开发更特异更有效的诊疗方法奠定了理论基础。
2.1.2 疾病模型建立动物疾病模型可以模拟人类疾病的生物学和病理特征，在疾病发生机理和药物筛选等基础和转化研究中发挥关键作用。CRISPR/Cas9技术因具有编辑效率高、操作简单和适用范围广等优点，已广泛用于肿瘤、神经退行性疾病、白化病等疾病模型的建立[31-34]。
小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是一种高度侵袭性的神经内分泌肺癌，约占所有肺癌病例的13%–15%。SCLC生长速度快、易发生复发和转移。由于缺乏有效的新型治疗方法，SCLC的临床治疗效果在近30年没有明显改善。SCLC动物模型的建立和发病机理的深入研究，对开发新型治疗靶点至关重要。Tyler Jacks研究团队通过CRISPR/Cas9技术同时敲除抑癌基因Trp53和Rb1[31]，成功构建了SCLC的小鼠模型。在此基础上，证明了p107和p130的缺失能够加速肿瘤的生长、显著降低荷瘤小鼠生存期。该研究提供了一种人SCLC的小鼠模型，适用于研究SCLC的致病机理。
肝癌是指发生于肝脏细胞的恶性肿瘤，分为原发性肝癌和继发性肝癌。手术切除和放化疗仍是临床治疗的主要手段，但易造成复发和转移，使得肝癌患者预后很差，5年生存率仅为14.1%[35]。因此深入研究肝癌的发生机制并鉴定特异标志物，对肝癌的早期诊疗具有重大意义。Xue等通过CRISPR/Cas9技术，同时靶向小鼠肝细胞的抑癌基因PTEN和P53。结果表明，3%的肝细胞同时缺失了抑癌基因PTEN和P53。3个月后，所有5只小鼠都生成了具有胆汁分化特征的肝肿瘤，成功构建了肝癌的小鼠模型[32]。
帕金森氏病是一种影响患者活动能力的中枢神经系统疾病，多发生于中老年人群。PARK2基因和PINK1基因中任意一个发生突变都会造成帕金森氏病的发作。为了构建这一疾病模型动物，Zhou等将靶向PARK2和PINK1的CRISPR/Cas9表达载体转染至来自35日龄大的猪的成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts，PFF) 中[33]，通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer，SCNT) 获得重组胚胎，并将胚胎转移给受孕母亲。DNA测序结果表明获得的20只克隆仔猪在预计的靶点处均携带了预期的纯合突变(PARK2–/–/PINK1–/–)。免疫荧光分析表明PARK2–/–/PINK1–/–的猪的脑神经元中未发现PTEN诱导激酶1 (由PINK1基因编码) 和Parkin蛋白(由PARK2基因编码)，成功构建了帕金森氏病的模型猪。虽然在7个月大的模型猪中尚未观察到帕金森氏病的典型症状，但这一模型的成功构建有助于后续对帕金森氏病的症状及治疗策略的研究。
白化病是由于酪氨酸酶缺乏或功能减退引起的一种皮肤及附属器官黑色素缺乏或合成障碍导致的遗传性疾病，有研究表明酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr) 基因291G-T的突变会在有色素的C57BL/6J小鼠中引起白化病[36]。为了构建此类白化病小鼠模型，Mizuno等向C57BL/6J小鼠胚胎中注射了CRISPR/Cas9表达载体以及突变的DNA供体[34]，然后将该胚胎转移给受孕小鼠。在获得的27只具有白化症状的小鼠中有11只Tyr基因发生了291G-T的单核苷酸突变，这11只小鼠中有10只小鼠除291G-T的单核苷酸突变外，在Tyr基因靶点周围还产生了单等位基因的插入缺失，其余16只小鼠在291G处未产生突变但在该靶点周围产生了插入缺失突变。该研究成功构建了白化病小鼠模型，有助于研究白化病的致病机理。
以上研究表明，通过CRISPR/Cas9技术构建动物疾病模型，有助于研究疾病发展的分子机理，为开发针对疾病的精准医疗方案奠定理论基础。
2.1.3 基因治疗基因治疗(Gene therapy) 是指将外源基因导入靶细胞，修正或补偿由于基因异常或缺失导致的疾病的一种治疗方法。CRISPR/Cas9技术凭借其编辑效率高、可同时靶向多个靶基因等特点，已报道被用于肿瘤、神经退行性疾病、造血系统疾病和艾滋病等疾病的基因治疗[37-43]。
Guo等将靶向乳腺癌驱动基因之一LCN2的sgRNA-Cas9的核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP) 包裹在一种纳米脂质凝胶中，并在载体表面偶联可特异性识别三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC) 细胞的细胞间黏附分子-1 (Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1) 来提高递送的靶向性。结果发现敲除LCN2显著影响了TNBC细胞的迁移，与对照相比，LCN2敲除组中迁移的细胞比例降低了60%，减弱了TNBC的侵袭性。在此基础上，对荷瘤小鼠尾静脉注射包裹了RNP的脂质凝胶，在小鼠体内实现对LCN2的敲除，结果发现LCN2敲除小鼠肿瘤的体积和重量分别减少了77%和69%。该研究表明敲除LCN2可使肿瘤生长受到抑制，因此敲除LCN2可作为治疗TNBC的有效策略[37]。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS) 俗称渐冻症，是一种神经退行性疾病，会引起肌肉渐进退化，最后瘫痪直至死亡，没有良好的治疗策略。一部分ALS是由超氧化物歧化酶1 (Superoxide-dimutase-1，SOD1)突变引起。Gaj等向ALS小鼠注射Cas9和靶向SOD1的sgRNA，使突变的SOD1蛋白表达降低[38]。与未经过治疗的小鼠相比，经过处理的小鼠腰椎和胸椎区域的突变型SOD1蛋白分别减少了3倍和2.5倍，小鼠的发作期延迟了33 d，平均生存期增加了28–30 d。该研究表明敲除SOD1可有效延缓ALS小鼠的疾病进展，证明了CRISPR/Cas9技术治疗遗传突变引起的中枢神经系统疾病的能力。
包括镰刀状细胞贫血病、β-地中海贫血症在内的β-血红蛋白病，是一类由β-珠蛋白基因突变引起的疾病。该疾病的治疗策略之一是用胎儿血红蛋白(Fetal hemoglobin，HbF) 替代缺陷且不足的成人血红蛋白(Adult hemoglobin，HbA)。但由于HbF启动子HBG1处有阻遏物的结合位点，HbF的表达在一岁左右就被关闭了。Humbert等通过CRISPR/Cas9技术对CD34+的造血干细胞和祖细胞的HBG1处进行编辑[39]，然后将细胞重新注入非人灵长类动物模型中，发现基因编辑细胞的移植率高达30%，持续时间超过1年，外周血中高达18%的红细胞可表达HbF，证明了被编辑的细胞有效且稳定地重新激活了HbF的表达，这种结果足以逆转镰状细胞贫血病和β-地中海贫血症的症状。
年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD) 是一种可导致失明的视力疾病，由于血管内皮生长因子A (Vascular endothelial growth factor A，VEGFA) 高水平表达，造成了脉络膜新血管形成(Choroidal neovascularization，CNV)，血液等流体进入眼睛破坏视网膜，从而导致疾病的发生。Kim等对具有激光诱导产生的CNV的小鼠视网膜下注射了靶向Vegfa的RNP，注射后3 d在CNV区域的视网膜色素上皮细胞中检测到产生的插入缺失频率分别为22%±5%和24%±2%；注射后7 d，通过评估CNV面积评估治疗效果，发现注射RNP的小鼠与对照相比，CNV的区域约减小58%[40]。该研究表明通过敲除Vegfa可有效减小小鼠CNV的面积，因此，通过基因外科手术进行AMD局部治疗是一种可行的策略。
肺表面蛋白活性缺乏症，是由肺表面活性蛋白C基因(Surfactant protein-C，SFTPC) 突变引起的疾病，可导致胎儿出生时或出生不久就死亡，几乎没有治疗选择。Peranteau团队构建靶向敲除突变基因SftpcI73T的CRISPR系统并对患病小鼠进行羊膜腔内注射[41]。结果发现未经过治疗的小鼠在出生后6 h就死亡，而经过治疗的小鼠在出生24 h后可保留8%的生存率，一周后仍有5.7%的小鼠存活。表明羊膜内递送CRISPR/Cas9系统后出生的胎儿携带基因编辑是可行的，这种方法为难治性遗传疾病的治疗带来希望。
毛细胞行使功能离不开跨膜离子通道样蛋白1 (Transmembrane channel-like protein 1，TMC1)，若TMC1突变会导致毛细胞退化、死亡，最终导致听力消失。由于这种突变为单核苷酸突变，而Jeffrey等发现常使用的来自酿脓链球菌的Cas9 (Streptococcus pyogene Cas9，SpCas9) 在该实验中没有良好的矫正单核苷酸突变的特异性，除了在患病小鼠(贝多芬小鼠) 中可进行基因编辑外，在野生型小鼠中也可能产生插入缺失突变。所以选择了可以选择性破坏突变的Tmc1/TMC1等位基因但对野生型基因没有影响的SaCas9-KKH变体进行后续实验[42]。观察小鼠的内耳结构发现，未经处理的贝多芬小鼠毛细胞结构逐渐恶化，在6个月左右完全丧失听力。而经过基因治疗的贝多芬小鼠毛细胞的数量、结构被很好的保留，部分治疗小鼠甚至可以在一年内拥有与正常小鼠相同的听力。此外，该实验还在具有TMC1突变的人类细胞系上进行实验，发现这种CRISPR系统仍然只在突变核苷酸处编辑，不会影响正常基因，有较高的安全性。以上结果表明通过CRISPR/Cas9技术对突变TMC1基因进行校正可以有效缓解贝多芬小鼠的症状，因此可成为治疗TMC1突变引起的耳聋的一条治疗策略。
CCR5编码的蛋白质可以帮助HIV病毒进入细胞，该基因发生突变的人几乎不会受到HIV的侵害。基于此理论，研究人员通过CRISPR/Cas9技术将捐献者CD34+成体造血干细胞的CCR5基因敲除[43]，并将其移植到患有艾滋病伴随白血病的患者体内，在进行的持续19个月的随访中发现，骨髓细胞能持续检测到CCR5的基因编辑，效率为5.20%–8.28%，患者的白血病得到持续缓解。但在抗HIV方面，暂停使用抗HIV药物4周时，血清中的病毒载量从检测不到的水平增加至3?107/mL。虽然该研究在抵抗HIV方面的效果欠佳，但这是世界上首例通过基因组编辑技术敲除人造血干细胞CCR5基因后回输至艾滋病伴随白血病患者的事件，对通过基因组编辑技术治疗艾滋病具有重要的指导意义。
以上研究表明，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术为患者提供了一条不同于传统治疗方法的新的治疗策略，给难治性疾病带来了治疗的希望。
2.1.4 免疫治疗自2018年James P. Allison和Tasuku Honjo获得诺贝尔生理学或医学奖后，针对免疫疗法的实验研究不断涌现。免疫治疗是通过调动患者自身免疫系统杀伤肿瘤细胞的一种方法，主要分为免疫检查点阻断和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)。CRISPR/Cas9技术通过筛选对免疫治疗至关重要的基因、对相关基因进行基因水平改造等手段，为免疫疗法带来了新的突破。
在实际应用中，并不是所有患者都能对免疫治疗产生响应，有些基因突变可能使免疫治疗失效，所以筛选出与免疫治疗相关的基因至关重要。Patel等建立了一个带有超过12万个sgRNA的筛选库[44]，这些sgRNA能靶向细胞内19 050个编码蛋白质的基因。作者利用该筛选文库对人黑色素瘤细胞Mel624的基因进行敲除，在抵抗靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4) 免疫治疗的转移性肺癌细胞中，发现了编码爱帕琳肽的基因APLNR的错义突变。小鼠体内实验结果表明，野生型黑色素瘤细胞A375所形成的肿瘤接受靶向CTLA4的免疫治疗后，50%的肿瘤完全消退；但APLNR基因敲除的A375细胞，获得了抵抗靶向CTLA4免疫治疗的能力，所有肿瘤不仅没有消退，反而全部进展恶化。上述结果证明了APLNR的功能缺失减弱了免疫治疗的有效性。
在免疫疗法中，理想的T细胞是浸润到肿瘤细胞后可以维持杀伤作用并可以自我更新，但大多数T细胞向CD8+T细胞分化过程中都很难保证持续存活[45]。Chi研究组从T细胞代谢入手[46]，构建了靶向代谢酶、小分子转运蛋白等分子的文库，对T细胞进行转染后对荷瘤小鼠进行过继治疗，7 d后发现Regnase-1在肿瘤浸润淋巴细胞中最为富集，敲除Regnase-1可延长CD8+ T细胞的存活，与对照相比，可增加CD8+T细胞在肿瘤中的聚集约2 000倍，回输给荷瘤小鼠后，与野生CD8+ T细胞相比可更有效地抑制肿瘤的生长和延长小鼠生存期。
在通过基因编辑提高免疫治疗效果方面：程序性细胞死亡受体1 (Programmed cell death protein 1，PD-1) 与其配体细胞程序性死亡配体1 (Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1) 或细胞程序性死亡配体2 (Programmed cell death 1 ligand 2，PD-L2) 结合后会导致肿瘤微环境中的免疫抑制。阻断PD-1/PD-L1信号通路的激活可以抑制免疫系统的免疫抑制行为，从而促进抗肿瘤免疫。有研究证明抑制β-catenin可下调PD-L1的表达。在此基础上，He等开发了基于天然聚合物的递送载体并对载体进行表面修饰来提高载体的核靶向能力和细胞穿透能力。通过此载体将CRISPR/Cas9系统的质粒递送到肿瘤细胞核，敲除β-catenin从而下调PD-L1的表达，编辑效率最高约40%[47]。经过编辑的细胞PD-L1的表达水平显著下降，将此细胞与活化的CD8+ T细胞共培养，结果发现CD8+T细胞对编辑后的肿瘤细胞表现出强烈的细胞毒性，可以消除大多数肿瘤细胞，而对未编辑的肿瘤细胞的细胞毒性要弱得多。另一方面，还发现与编辑过的肿瘤细胞共培养后的T细胞增殖远高于与未编辑过的肿瘤细胞共培养的T细胞。γ干扰素(Interferon γ，IFN-γ) 是活化T细胞分泌的典型抗肿瘤细胞因子，实验中发现与编辑过的肿瘤细胞共培养后，IFN-γ阳性的T细胞显著增加。说明这种基因编辑不仅通过影响肿瘤细胞，还通过影响免疫系统，整体提高了对肿瘤的杀伤效果。
CAR-T疗法可通过在T细胞表面配有人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA) 使杀伤性T细胞特异性攻击肿瘤细胞。但HLA在个体之间差异很大，所以这种疗法仅针对白血病、淋巴瘤等少数几种癌症。Andrew教授在实验中意外发现MC.7.G5这一T细胞克隆与多种肿瘤细胞，例如肺、皮肤、血液、结肠、乳腺等共培养后，都可以杀死80%以上的肿瘤细胞，而与正常细胞共培养时却没有产生任何杀伤作用，甚至没有分泌任何细胞因子[48]。为了确定MC.7.G5识别靶标必不可少的基因，研究人员通过CRISPR/Cas9技术对人体两万多个编码蛋白质的基因进行筛选，发现了单态MHCI类分子相关蛋白(MHC classⅠ-related protein 1，MR1) 在MC.7.G5识别并杀伤癌细胞中起重要作用。敲除了MR1的癌细胞将不再被MC.7.G5细胞杀伤，该研究筛选并证明了MR1分子表现出了泛癌细胞识别的T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR) 特性，为泛癌、泛人群的T细胞介导的免疫治疗提供新的思路。
CAR-T细胞治疗方法的研究已经有了令人鼓舞的结果，但利用自体T细胞可能因T细胞的质量和数量不佳以及制造自体T细胞产品的时间和费用等使得治疗受到阻碍。这些限制可以通过使用同种异体T细胞来避免，但同种异体T细胞上的内源性TCR可能会识别受体的同种异体抗原，从而导致移植物抗宿主病(Graft versus-host disease，GVHD)。Ren等使用CRISPR/Cas9技术同时靶向内源TCR和HLA-Ⅰ类分子[49]，获得了TCR和HLA-Ⅰ表达不足的T细胞。将此细胞注入NSG小鼠中未发现GVHD，而注入未经编辑的T细胞的5只NSG小鼠中有4只都出现了致死性GVHD，说明TCR和HLA-Ⅰ双敲除的T细胞显著降低了机体的免疫反应。在此基础上继续敲除编码PD-1的基因，得到TCR、HLA-Ⅰ、PD-1缺失的CD19-CAR-T细胞，与未破坏PD-1的CAR-T治疗相比，PD-1破坏的CAR-T治疗后的小鼠肿瘤面积始终更小，体现出更强的抗肿瘤效果。
另外，在CAR-T治疗中通常是使用γ-逆转录病毒载体或其他整合载体将CAR转导到患者的T细胞，可能导致转录沉默、克隆扩增等现象，存在随机性。Eyquem等通过CRISPR/Cas9技术敲除T细胞受体α恒定(TRAC) 基因位点并将CD19特异的CAR插入，结果发现95%的CAR+ T细胞呈现出TCR阴性，成功构建了TRAC-CAR-T细胞[50]。细胞毒性实验结果表明，虽然传统CAR-T与TRAC-CAR-T细胞在肿瘤部位聚集程度相近，但TRAC-CAR-T细胞控制肿瘤生长的效果更好，可明显延长小鼠的中位生存期。
在一例对人类进行免疫治疗的1期临床试验中[51]，研究人员通过CRISPR/Cas9技术敲除了两个编码内源性TCR的基因TCRα和TCRβ，还有编码PD-1的基因PDCD1，又将靶向NY-ESO-1的T细胞受体编码基因插入到T细胞中，然后将这个编辑过的T细胞回输入患者体内。共有3名患者接受了测试，结果发现经过编辑的T细胞可在体内稳定存在9个月；3名患者中只有1名患者出现肿瘤消退的现象，腹部肿块减少约50%并持续了4个月，但其他病变有进展，对3名患者的骨髓活检和肿瘤活检结果表明经过编辑的T细胞均向肿瘤部位转运；截止到2019年12月，3名患者疾病都发生了恶化，1名患者死亡，其余2名患者接受了其他治疗。总之，这项研究初步证明了在临床水平上通过CRISPR/Cas9技术进行多重基因编辑的可行性，但仍需更多临床试验来证明或改善这种治疗方法的安全性。
在免疫治疗中，CRISPR/Cas9技术可以对某些基因进行编辑从而提高治疗的效果，为传统的免疫治疗带来新的契机。随着更多的动物实验和临床实验的进行，免疫治疗的安全性和有效性有望得到进一步提高，成为治疗肿瘤的有力武器。
2.2 基因插入与基因敲除对应的是基因插入，在基因组指定位置插入目的基因，可以实现对指定基因进行功能的评估、示踪等。
2.2.1 疾病模型建立Mou等对野生型B6小鼠注射致癌基因鼠类肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS) 的模板以及靶向抑癌基因TP53的sgRNA[52]，一个月后在小鼠肝脏内发现肿瘤，成功构建了肿瘤模型。在构建致癌基因KRAS的质粒时加入一段荧光素酶基因，然后用同样的方法处理小鼠，用体内生物发光成像可以测量和跟踪肿瘤生长随时间的变化，实现活体肿瘤成像。
Leonetti等将绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP) 标签分裂为GFP1-10与GFP11，在表达GFP1-10的293T细胞(293TGFP1-10) 中，通过CRISPR/Cas9技术将GFP11插入感兴趣的蛋白质基因组[53]。在同一细胞共表达后，GFP1-10和GFP11非共价组装成功能性GFP分子，实现对蛋白质的荧光标记。在293TGFP1-10细胞内靶向的48个基因中，有30个基因(63%) 成功产生了GFP荧光标签，通过共聚焦显微镜分析GFP荧光所在位置与相应蛋白的预期亚细胞定位相匹配，证明了通过CRISPR/Cas9技术在细胞内源基因中添加GFP标签的方法，为在细胞内全面表征蛋白质带来可能。
2.2.2 基因治疗Chen等提出了一种将“自杀基因”插入基因组从而提高癌症模型小鼠生存率的方法[54]：MAN2A1-FER融合基因可能对肝癌、卵巢癌等疾病的发展至关重要，融合基因时会产生一个“断裂点”。研究人员通过CRISPR/Cas9技术将“自杀基因” HSV1-tk插入断裂点的位置，然后用前体药物更昔洛韦处理，发现这种方法可导致27%的细胞死亡。将带有融合基因的肿瘤细胞移植到小鼠体内，成瘤后利用CRISPR/Cas9技术插入自杀基因，协同更昔洛韦对小鼠进行治疗。结果发现肿瘤大小比最高值减小了29%，实验过程中未发生明显的肿瘤转移和小鼠死亡的现象。该研究表明插入“自杀基因”可抑制肿瘤生长，因此该方法可作为治疗携带融合基因的肿瘤的可行策略。
基因插入涉及到的主要DNA修复方式为HR，但其效率受切割位点模板DNA浓度低的限制。Ling等通过将模板核苷酸偶联在经过化学修饰的Cas9蛋白上一起递送进细胞，或者在Cas9上偶联一段短的核苷酸接头[55]，可以通过碱基互补配对与模板DNA偶联，从而提高切割位点模板的浓度。经过这种处理后，细胞内HR的效率可从20%提高至60%，并且在小鼠胚胎内也可以起作用。优化了插入基因的方法，为更有效构建细胞或动物模型提供便利。
为解决基因插入在人细胞，尤其是干细胞内的效率不高的问题。Yu等开发了一种将模板DNA的末端进行化学修饰的方法[56]。该研究共构建了13种化学基团末端修饰的模板DNA，从中筛选出一种C6-聚乙二醇(C6-PEG10) 5′端修饰的方式有最高的插入效率，并且在多种细胞的多个基因位点证实了这种修饰的有效性，在HEK293T细胞中的Lamin A/C位点使用该策略能够实现高达65%的插入效率，是目前报道的最高的基因插入效率。
2.3 单碱基编辑单碱基编辑器(Base editor，BE) 主要分为两大类：胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor，CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor，ABE)。CBE这一概念最早于2016年由David R. Liu团队提出[57]。其工作原理为将胞苷脱氨酶与失去活性的Cas9蛋白(Nuclease dead-Cas9，dCas9) 融合，在sgRNA的引导作用下，在指定的胞嘧啶(C) 位点脱氨基，C脱去氨基后成为尿嘧啶(U) 并暂时改变碱基互补配对的特点，在接下来的DNA复制中与胸腺嘧啶(T) 配对，从而将C转变为T。对于ABE的作用原理，与CBE类似，首先，腺嘌呤(A) 脱氨基后变为肌苷，在后续的DNA复制中，肌苷与鸟嘌呤(G) 配对，从而实现从A到G的转变。所以理论上来说，将腺苷脱氨酶与dCas9融合就可以产生ABE。但实验结果表明经此操作后并没有产生A到G的转变[58]。针对此问题，2017年，David R. Liu团队对蛋白质进行了广泛的定向进化，以开发可作用于DNA底物的腺苷脱氨酶，发现大肠杆菌野生型腺嘌呤脱氨酶可以结合DNA并使DNA上的腺嘌呤脱氨，所以使用ecTadA作为脱氨酶开发了第一代ABE[59]。
第一代BE虽然已实现碱基编辑，但也存在活性编辑窗口小、限制特定的PAM序列、存在脱靶现象等，针对不同问题已经涌现出了许多优化的方法。例如：Cheng等通过筛选新的脱氨酶，扩大CBE的活性编辑窗口，降低脱靶效应[60]；Kim等通过使用Cas9变体产生的CBE，可不严格要求将NGG序列作为PAM序列，对于某些位置的NGAN、NGCG、NNNRRT序列，也可作为PAM序列使用，从而靶向基因组位点[61]；Doman等通过使用CBE的变体YE1，在保证底物编辑范围的情况下降低了脱靶效应[62]。
2.3.1 疾病模型建立大多数动物模型都是通过敲除特定基因构建的，这无法完全模拟出由点突变造成的性状改变。所以基于单碱基编辑的点突变在构建模式生物、修饰突变基因方面有较大潜力。
RAG1、RAG2和IL2RG是一组与B细胞、T细胞成熟相关的基因。研究人员通过对RAG1、RAG2和IL2RG位点进行单碱基编辑[63]，产生了终止密码子，提前结束基因的表达。然后将这些胚胎种植给代孕猪。测序证明携带纯合或杂合突变的仔猪都会因肺部感染等原因死亡。对死去的仔猪进行尸检发现它们的脾和胸腺严重发育不足，导致了免疫缺陷，与预计表型相同。证明通过单碱基编辑成功构建出了免疫缺陷的猪，这也是第一次将单碱基编辑技术用于大型动物。
Dmd和Tyr分别是编码肌钙蛋白和酪氨酸酶的两种基因。Kim等将编码BE3的mRNA和sgRNA一同注射到小鼠受精卵中[64]，在Dmd和Tyr两个位点进行点突变，然后移植到代孕鼠中，得到Dmd和Tyr突变的小鼠后代。九只进行Dmd突变实验的小鼠中有一只出现了由C-T转换引起的终止密码子，该小鼠不表达肌钙蛋白。七只进行Tyr突变实验的小鼠中有两只出现了由C-T转换引起的终止密码子，这两只小鼠的眼睛出现白化表型。以上性状都与预期一致，表明成功构建了点突变模型小鼠。
Liu等通过单碱基编辑的方式处理兔子胚胎，然后移植给代孕母亲，结果在8只兔子中有4只(50%) 产生了所需的错义突变，成功构建了模仿人类错义突变的兔子模型[65]。
2.3.2 基因治疗TERT启动子区–124C-T的突变经常出现在肿瘤细胞中。Li等将基因编码序列较短的CjCas9切口酶与腺苷脱氨酶融合得到CjABE，便于用包覆能力有限的AAV递送[66]。对注射了人神经胶质瘤(U87) 和多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM) 而形成的荷瘤小鼠进行CjABE的注射。结果在肿瘤中导致了相似的–124T-C的转化效率(85.2%–90.4%)，减少了TERT的转录和蛋白表达，抑制了胶质瘤生长，与对照相比经过处理的小鼠可延长生存期约20 d。
着色性干皮病C组蛋白(Xeroderma pigmentosum group C，XPC) 是一种DNA修复酶，参与DNA损伤的识别和修复。缺乏XPC的细胞在暴露于化学或物理刺激(包括紫外线照射) 时会积累DNA损伤，进而使某些疾病发生，着色性干皮病就是其中一种。Lee等通过使用ABE对来自着色性干皮病患者的成纤维细胞进行编辑，恢复了关键蛋白XPC的表达并至少维持了4周，在紫外线照射下细胞恢复了对DNA损伤的抵抗，证明通过ABE校正突变的XPC基因可有效恢复细胞XPC蛋白的表达，因此通过ABE校正突变基因可以作为一种治疗着色性干皮病的方法[67]。
苯丙氨酸羟化酶(Phenyalanine hydroxylase，PAH) 缺乏症可导致人体对饮食摄入的必需氨基酸之一苯丙氨酸不耐受，从而产生苯丙酮尿症等疾病。Villiger等对苯丙酮尿症小鼠模型进行尾静脉注射BE，从而靶向校正纯合的Pahenu2 c.835T-C突变。14周后，小鼠肝脏中Pah-mRNA的校正率最高达63%，全肝裂解物中PAH酶的活性恢复至野生酶活性的1.7%–22.8%，小鼠体内苯丙氨酸水平降至正常水平，不再出现苯丙酮尿症的症状[68]。
β地中海贫血是由HBB (–28 A-G) 基因突变引起的疾病。Liang等用CBE对胚胎进行注射并对HBB位点进行PCR扩增。结果表明HBB基因成功扩增到22个胚胎中，其中，10个胚胎(45.4%)的–28G转化为A或C，1个胚胎(4.54%) 的–28G转化为C，其余9个胚胎(40.9%) 的–28G转化为A。表明单碱基编辑对人类胚胎中的突变可以实现特异性很高的修复[69]。
Ryu等通过AAV将ABE转入肌营养不良小鼠模型的肌细胞中，纠正了DMD基因的无义突变。在17%的肌纤维中恢复了肌营养不良蛋白的表达，远超过改善肌肉功能所需的4%，显示了单碱基编辑器在疾病治疗上的潜力[70]。
在研究者们的努力下，单碱基编辑的研究进展迅速，极具临床应用潜力。考虑到单碱基编辑的独特机制，以及现有CBE和ABE在多种细胞和疾病模型中的优良特性，这种单碱基编辑工具对基因编辑领域的发展有重要意义。
2.4 双碱基编辑单碱基编辑器在同一个位点只能实现腺嘌呤或胞嘧啶某一个碱基的转化。近年来，有研究团队陆续开发出了双碱基编辑器，可以在同一个位点实现腺嘌呤或胞嘧啶双碱基的转化，提高了碱基编辑能力。
Joung团队设计了带有腺苷和胞苷脱氨酶的蛋白，构建为双碱基编辑器“SPACE”[71]。“SPACE”可以有效地引入A-G和C-T的编辑，并且可以产生额外的60个密码子的变化(导致18个氨基酸的取代)。这是常规的单碱基编辑器ABE或CBE做不到的。在另一项研究中，研究人员通过将胞苷和腺苷脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9 nickase，Cas9n) 融合，创建了一个新的碱基编辑器A & C-BE[72]，其编辑窗口从C3-C10位扩展到了C2-C17位。因此，双碱基编辑器的出现成功地扩宽了CRISPR碱基编辑器的应用范围。
2.5 基因转录调控基于CRISPR/Cas9技术进行基因调控的原理在于将调控因子与dCas9融合，dCas9虽不能切割DNA双链但仍可与DNA双链结合，在sgRNA的定位下，可以调控指定位点基因的表达。通过将不同功能的调控因子与dCas9结合可以实现对基因的激活、抑制或甲基化等调控。
2.5.1 疾病模型建立基因的特异性失活是神经生物学领域的重要研究方法，虽然基于Cas9的基因敲除技术已相对成熟，但神经元不可分裂，无法通过建立细胞系来研究基因的功能。Zheng等选择Syt1和3个SNARE基因Vamp2、Stx1a和Snap25，将dCas9与转录抑制因子KRAB融合表达，构建为dCas9-KRAB，在培养的海马神经元中抑制基因表达[73]。与RNAi抑制基因表达在50%左右的水平相比，dCas9-KRAB在所选的4个基因处都起到了更强的抑制作用。与对照相比，实验组的mRNA和蛋白质的表达水平都有所降低，效率接近90%。后续又将该抑制系统注射到成年小鼠海马齿状回神经中，结果表明4个基因的mRNA和蛋白表达均被抑制90%以上，证明了dCas9-KRAB在大脑中同样可以实现抑制基因表达的效果。该研究成功构建了特异性降低脑内基因表达的小鼠模型，证明了dCas9-KRAB在神经生物学领域具有广泛的应用空间。
2.5.2 基因治疗Lama2突变会使得编码的层黏连蛋白α2不能正常表达，而这种蛋白对于肌肉发育必不可少，缺失该蛋白可能导致先天性肌营养不良这种疾病。有研究证实了Lama1基因编码的laminin-α1蛋白也可以促进肌肉组织的形成，Lama2的缺陷可以通过Lama1基因的过表达来弥补。研究人员将SadCas9与转录激活因子VP64融合表达，构建为SadCas9-2XVP64[74]。用AAV递送进入3周龄的出现肌肉功能障碍的小鼠颞静脉。结果表明经过治疗的小鼠Lama1基因的表达量明显上调，肌肉组织病理学显着改善，纤维化区域约减少50%，小鼠后肢麻痹程度减轻，运动功能有所恢复。该研究表明CRISPR-dCas9介导的Lama1表达上调可有效缓解肌营养不良小鼠的症状，因此这种基因调控的方法可以作为肌营养不良的一种治疗策略。
SIM1和Mc4r是对人体的食欲调节起至关重要作用的基因，任意一个基因发生突变，另一基因产生的蛋白量不足以支撑相应生命活动(单倍体剂量不足)，这一类人群会因为抑制不住食欲引起肥胖。在一项研究中，研究人员将靶向Mc4r启动子的dCas9-VP64注射进入4周龄Mc4r+/–小鼠的下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)[75]，使得小鼠Mc4r的表达增加2.7倍，与对照相比，小鼠体重明显下降。该研究表明CRISPR-dCas9介导的Mc4r表达上调可有效使得肥胖小鼠体重减轻，因此基因表达调控可作为单基因拷贝数不足造成的疾病的一种治疗方法。
常规的dCas9-转录调节因子融合的方法产生的融合序列较大，AAV包裹困难。Liao等使用了短sgRNA (14 bp或15 bp而不是20 bp)，这些短的sgRNA (Dead sgRNA，dgRNA) 阻止了活性Cas9产生DSB，经过改造的dgRNA可以募集MPH转录激活复合物。将dgRNA系统引入表达活性Cas9的小鼠中，可以实现与传统的dCas9-VP64的系统相近的激活基因表达的效果[76]。Klotho基因编码的Klotho蛋白可保护肾脏免受损害，并且该基因的表达在衰老和急性肾损伤后降低。Interleukin (IL)-10是一种抗炎细胞因子，可减轻顺铂治疗后的肾损伤。针对急性肾损伤小鼠模型，研究人员构建了dgRNA-MPH激活系统，并对成年小鼠进行尾静脉注射。通过此激活系统靶向上调Klotho、IL-10的表达。注射12 d后分析肝脏组织，结果表明与对照组相比，实验组中IL-10的表达上调158倍，klotho的表达上调2 553倍。为评估治疗效果，研究人员在对小鼠注射dgRNA-MPH后第8天进行顺铂治疗，发现顺铂导致了肾损伤。但在第12天时分析发现由于Klotho、IL-10表达的上调，小鼠肾功能又得到改善。证明了通过CRISPR系统上调功能蛋白的表达，为疾病进行预防性干预提供可能性。
肥胖小鼠Fabp4 mRNA的水平比非肥胖小鼠的高，可作为解决肥胖问题的一个标志物。Chung等对肥胖模型小鼠腹膜注射dCas9/sgFabp4从而靶向下调脂肪细胞内的Fabp4[77]。处理6周后小鼠体重降低约20%，血清中的游离脂肪酸，甘油三酸酯等物质的表达水平降低50%，对于由肥胖引起的肝部脂肪变性等问题有一定的逆转作用。
X染色体易裂症(Fragile X syndrome，FXS)是一种遗传性智力低下的疾病，由于FMR1基因CGG重复序列过度扩增伴随不正常的甲基化，使FMR1基因的启动子异常从而无法正常编码FMRP蛋白。Liu等将dCas9与甲基化修饰酶Tet融合构建了甲基化修饰工具，通过sgRNA引导至病理性FMR1基因处诱导其去甲基化[78]，打破了FMR1的沉默。与野生型细胞相比，成功表达dCas9-Tet的细胞FMR1 mRNA的表达水平恢复至野生型水平的90%，FMRP表达水平恢复至野生型水平的73%，甲基化水平由开始设置的100%降至4%。将包裹dCas9-Tet的慢病毒载体注射入神经元前体细胞，然后注射入小鼠大脑，发现编辑过的神经元可以表达FMRP，说明这种去甲基化修饰注射入体内后仍可以维持，这为治疗FXS提供了有力的工具。
2.5.3 免疫治疗自身的抗肿瘤免疫反应中最主要的一步就是免疫系统识别肿瘤特异性抗原，但大多数情况下肿瘤会下调或沉默抗原的表达来逃逸免疫系统杀伤。Chen的研究团队开发了基于CRISPR技术的集成内源基因激活疗法(Multiplexed activation of endogenous genes as an immunotherapy，MAEGI)[79]。以TNBC为例，该研究首先筛选出与TNBC相关的所有基因突变并建立了相应的“激活库”，然后靶向激活可产生抗原的突变基因对肿瘤细胞进行“标记”，让免疫系统攻击“标记”的细胞。结果发现与对照相比，经处理的小鼠肿瘤体积明显减小，半数小鼠都可以产生完全应答或近完全应答，80%以上的小鼠体内肿瘤细胞被完全清除，流式分析肿瘤微环境中的免疫细胞群发现，经MAEGI治疗的小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的浸润增强，有利于增强小鼠体内的抗肿瘤免疫反应。该研究表明通过CRISPR/dCas9技术上调突变基因的表达成功提高了免疫治疗的效果，因此这种基因调控的方法有望用于临床实验中，使得免疫治疗为患者带来更大的益处。
基于CRISPR/Cas9系统的基因转录水平调控，不产生DSB、安全性更高、在临床前和临床试验中可以产生良好的治疗效果，是一种非常有前景的疾病治疗手段。
3 存在问题及解决方案虽然针对CRISPR/Cas9技术的研究越来越多，但仍存在一些问题限制其在实际环境中的应用。例如：脱靶效应、自身免疫带来的安全问题，PAM序列的限制等。分析产生问题的原因并找出相应的解决策略可为CRISPR/Cas9技术尽早投入广泛应用奠定基础。
3.1 脱靶效应Cas9蛋白识别PAM序列，待sgRNA与靶序列配对后，Cas9就可以开始切割，但有时在非目标序列也会发生切割，也就是脱靶。
3.1.1 产生原因(1) 识别错误的PAM序列。PAM序列大概2–5 bp，对于经常使用的来自SpCas9，其对应的PAM序列通常为NGG (N代表任意核苷酸)。但Cas9可能与低频率出现的NAG识别，因此导致脱靶。但总的来说，与其他导致脱靶的原因相比，CRISPR/Cas9技术对PAM序列的错配容忍度低，相应产生脱靶事件的概率小[80]。(2) sgRNA与靶序列错配。sgRNA本身是一段20 bp左右的序列，它与靶序列的互补配对是保证Cas9切割特异性最重要的因素，但sgRNA具有容错性，在与靶序列存在1–5个碱基错配时，切割仍然可以发生。所以Cas9也可以切割与靶序列类似的DNA序列[81]。有研究证明PAM序列下游(+4) 到(+7)位置是一段“核心”序列，一旦在此区域内出现错配，基因编辑的效率也会降低。此外CRISPR系统对PAM序列远侧的突变比近侧突变耐受性更高[82]。对于单碱基错配或双碱基错配的情况，靶序列对sgRNA不同位置的错配敏感性不同，总体来说，sgRNA 5′端错配的敏感性低于3′端，但当引入三碱基错配时，Cas9的切割活性就会消失[83]。Lin等发现了另一种脱靶形式[84]：若脱靶序列比靶序列多或少一个或多个碱基时，会通过“DNA凸起”或“RNA凸起”使得DNA与sgRNA仍然可以配对。Cas9可以切割sgRNA的两个末端以及PAM序列下游的第7个碱基发生“DNA凸起”时错配的DNA序列，但不能切割临近PAM序列的位点发生“DNA凸起”以及发生大于5 bp的“RNA凸起”时错配的DNA序列。
3.1.2 解决方案(1) sgRNA的合理设计与修饰。Hsu等通过对100个预测的脱靶位点及设计的700个sgRNA进行评估[85]，提出了设计sgRNA时应减少sgRNA与脱靶序列的匹配度来提高Cas9的切割特异性。另外，常规使用的sgRNA长度为20 bp，有研究表明将sgRNA适当缩短到17–18 bp可在保证与靶序列结合的情况下降低脱靶效应5 000倍[86]。在sgRNA的5′端加上“GG”序列也可降低脱靶效应[87]。此外一些sgRNA的设计网站包括预测脱靶效率的功能[88]，因此可在网站上进行脱靶效率的预估，找到特异性更高的sgRNA后用于后续实验。
对sgRNA进行修饰方面，Ryan等证明在sgRNA的位点掺入2-O-甲基-3-膦酰基乙酸酯或(2’-O-methyl-3’-phosphonoacetate，MP) 的化学修饰可显著降低对脱靶位点的编辑效率而不影响对正确位点的编辑效率[89]。在人外周血CD34+ HSPC中证明修饰的sgRNA对HBB基因的作用，发现在sgRNA的第5位和第11位掺入MP修饰后，对脱靶位点OFF1的编辑效率从50%降低到2%。(2) 使用Cas9突变体。Cas9的REC3结构域负责检测sgRNA与靶序列结合的准确度，确定二者准确配对后，REC3指示REC2向外翻转，为HNH结构域发挥作用提供位点。Doudna研究团队通过突变REC3的某个氨基酸残基后得到了HypaCas9，在存在错配的情况下可降低HNH被激活的可能，提高Cas9切割DNA的特异性[90]。Choi等将编码蛋白的DNA分为几部分，构建了948个突变体，其中几种构建的突变体不能兼容常用的U6启动子，而筛选出的Opti-SpCas9的活性与野生型SpCas9相近，但脱靶活性显著低于野生型[91]。Charpentier团队发现Cas9蛋白的结构域中R63和R66在存在错配的情况下可通过稳定R环来降低Cas9特异性，Q768可以降低Cas9对原间隔子相邻基序远端错配的敏感性，基于此理论，研究人员对结构域进行突变，得到的变体R63A/Q768A在人MCF-7细胞中可表现出很高的特异性[92]。Ran等将Cas9突变为只能切割一条DNA链的单切口酶D10A，与一条sgRNA形成复合物，所以若想产生DSB需要设计两条sgRNA，构建两个这样的复合物起作用，两条sgRNA均错配才会脱靶，所以这种方法在细胞系中可降低脱靶效应50–1 500倍又能保证与野生型Cas9相同的编辑效果[93]。利用同样的原理，将dCas9与FokⅠ融合得到fCas9，由于FokⅠ二聚化才能切割DNA的特性，fCas9仍需设计两条sgRNA才能产生DSB，所以可提高整个体系的特异性，实验证明fCas9在具有高度相似的脱靶位点处的特异性比成对的双切口酶至少高4倍[94-95]。(3) 通过“开关”调节Cas9活性。CRISPR/Cas9技术可用作许多疾病的基因治疗手段，但其脱靶效应给基因治疗带来很大的风险。脱靶效应一方面是序列上的错配使得Cas9在错误的位点切割，另一方面由于Cas9的活性无法控制，基因编辑一旦开始就无法中断，只能等待自然结束，所以若能有效调节Cas9的活性则也可以一定程度上解决脱靶问题。
已经鉴定出了一些可以影响Cas9作用活性的蛋白。例如：Bondy-Denomy等鉴定出AcrF1、AcrF2和AcrF3，可通过阻断CRISPR–Cas复合物与DNA结合、与Cas9的亚基结合等不同机制调节CRISPR/Cas9的作用[96]。Harrington等从已经鉴定出的可抑制Cas9活性的蛋白中选择了ACRⅡC1和ACRⅡC3来研究其作用机制[97]，发现ACRⅡC1可以占据Cas9本应与DNA结合的位置，从而使Cas9不能与DNA结合，无法进一步切割DNA；ACRⅡC3则通过将两个Cas9距离拉近，改变了Cas9的结构，通过影响其与DNA结合从而影响其行使功能。这些大分子抑制剂虽然有效，但由于其分子较大可能存在递送问题，且可能被蛋白酶降解引起一些免疫反应。针对这些问题，研究人员开发了小分子筛选平台，可快速有效的筛选出能抑制Cas9活性的小分子。通过该平台，研究人员筛选出了小分子BRD0539[98]，通过阻断Cas9与DNA结合从而干扰DNA的切割。与大分子抑制剂(例如ACRⅡA4) 相比，BRD0539的抑制作用有明显的剂量依赖和时间依赖的特征，并且BRD0539在血浆中十分稳定，因此可作为CRISPR/Cas9开关的有利候选。
在另一项研究中，研究人员从sgRNA入手，选择茶碱这种细胞渗透性好的配体插入sgRNA中，可通过改变sgRNA的构象影响CRISPR/Cas9系统的作用效果[99]。在设计的86条sgRNA中有10条有良好的茶碱响应，其中9条为配体激活型(ligRNA+)，1条为配体抑制型(ligRNA–)。在细胞内进行的茶碱剂量依赖的实验表明在一定浓度范围内ligRNA的作用效果与茶碱浓度呈现良好的线性关系，证明了作为“开关”的ligRNA可以以精确的剂量来控制Cas9对DNA的切割。Liu等构建了程序化的sgRNA[100]，在无外界信号的情况下，sgRNA的引导区与设计的茎环自身互补而不与DNA互补，不能产生相应的作用。当有外界信号与sgRNA内相应的适体识别后，导致sgRNA的构象变化，使得引导区与靶DNA结合，在dCas9或dCas9-VP64存在的情况下对某些基因实现激活或抑制。NF-κB和β-catenin是在肿瘤细胞中高表达而在正常细胞中未高表达的蛋白，Bcl2/Bax的比例与细胞凋亡显著相关。由此出发，研究人员构建了一个“与”门的回路，用响应NF-κB的sgRNA配合dCas9抑制Bcl2的表达，用响应β-catenin的sgRNA配合dCas9-VP64激活Bax表达，因此，相较于正常细胞，肿瘤细胞中Bcl2/Bax的比率被显著改变。这种设计的回路可更有效地诱导肿瘤细胞凋亡，接受了这种治疗的荷瘤小鼠与对照相比，肿瘤的大小和重量都明显降低。
3.2 PAM序列的限制PAM序列是CRISPR系统起作用的决定因素之一，但也为CRISPR的广泛应用带来限制，对于距离PAM序列较远的靶序列很难实现基因编辑。SpCas9识别的PAM为NGG，为了扩展Cas9对不同PAM的兼容性，科学家们先后进行了很多尝试与开发：开发可识别NGA的SpCas9-VRQR变体以及可识别NGCG的SpCas9-VRER变体[101]。开发可识别NG的SpCas9-NG变体[102]。通过连续进化的方法得到可识别包括NGG、NG、GAA和GAT在内的多种PAM序列的xCas9变体[103]。开发可识别NRNH的变体，其中R为A/G，H为A、C或T[104]。开发变体SpG和SpRY，SpG可以识别NGN，对SpG优化得到了SpRY变体，几乎摆脱了Cas9对于PAM序列的识别限制，可识别NNN (NRN或NYN) 的PAM序列(R为A/G，Y为C/T，NRN > NYN)[105]。
3.3 递送方式的影响CRISPR系统的递送方式分为物理递送、病毒递送、非病毒递送，其中物理递送使用的方法为电穿孔，难以在体内应用，而其他不同的递送方式也将对CRISPR发挥出的效力产生影响。
逆转录病毒是整合型载体，会将外源DNA整合到宿主染色体中，但这种整合是随机整合，因此会给宿主带来插入突变等潜在风险。慢病毒也是一种整合型载体，最多可容纳8.5 kb的外源DNA片段，因此可容纳大多数sgRNA/Cas9表达元件，但可能造成细胞毒性。AAV是最常使用的病毒递送载体，免疫原性低，最多可容纳4.7 kb的外源DNA片段，外源DNA不整合到宿主基因组内。但最常使用的SpCas9自身大小在4.2 kb左右，连同sgRNA、模板DNA在内，整体大小会超过AAV的负载能力。因此通常会将Cas9和sgRNA分为两个载体进行递送或选择使用更小的SaCas9等。但AAV在体内可长期存在，使得外源基因持续表达，长期可能带来副作用。对于非病毒递送载体，例如可以利用脂质体或利用聚合物来包裹CRISPR的组分进行递送。但该方法存在靶向性差、对溶酶体的逃逸率低、包裹后产生的颗粒粒径大等问题。
纳米材料尺寸小，还可以通过表面修饰来提高靶向性，基于纳米材料的递送载体是目前研究的热点。Wang等合成了基于金纳米颗粒-脂质体体系的光控释放纳米递送系统[106]：金纳米颗粒表面修饰一层TAT而带正电，与靶向Plk-1的Cas9-sgRNA的带负电的质粒结合，在最外层包裹一层脂质体结构，从而得到具有核壳结构的纳米颗粒。由激光产生的金纳米颗粒的热效应可以使整个核壳结构进入细胞，释放Cas9-sgRNA的质粒，在TAT的引导下进入细胞核，实现对指定基因的切割。
将sgRNA与Cas9蛋白的RNP直接递送起效快，并且不会长期表达，具有细胞毒性小、插入突变风险低等特点，所以直接递送RNP也是一种理想的策略。Chen等设计了一种直径在25 nm的表面涂有一层谷胱甘肽(Glutathione，GSH) 的纳米胶囊[107]，可以包裹设计好的RNP进入细胞，在细胞质基质等富含GSH的位置释放RNP。由于核定位信号的作用使得RNP可以进入细胞核，对细胞内的基因进行编辑，细胞毒性验证实验表明这种纳米胶囊在293细胞内仅造成 < 6%的细胞死亡，有较低的细胞毒性。
3.4 其他安全性方面，除了脱靶带来的安全问题，还有很多其他方面的报道：p53是抑癌基因，Haapaniemi等提出CRISPR/Cas9会激活p53的表达，使细胞启动一种应激的保护机制，出现细胞周期停滞等现象来保护自身免受DNA损伤的影响[108]。另一项研究还发现在78%的捐献者血清中检测到抗SaCas9的T细胞，67%的捐献者产生抗SpCas9的T细胞[109]，说明人体本身可能对Cas9蛋白存在免疫，这也成为基因编辑的一大安全隐患。
另外，基因编辑技术是一种能够直接干预人类遗传基因的强大工具，其不仅蕴含了巨大的健康、进化和遗传风险，还可能导致一系列的社会伦理风险。贺建奎“基因编辑婴儿事件”突显出我国相关法律或治理架构的不足。因此，制定相关法律法规和医学伦理规范，对基因编辑技术进行合理引导和严格监管，是基因编辑技术从基础走向临床的必要环节。
4 总结与展望自2013年以来，作为一种新型基因组编辑技术，CRISPR/Cas9经历了迅速的发展，它可应用于基因敲除、插入、碱基编辑等操作，具有效率高、适用范围广的优势，可应用于基因功能鉴定和筛选、疾病模型建立和治疗等诸多领域。例如：在基因功能筛选方面，鉴定出PDXK是对白血病进展至关重要的酶；在疾病模型的建立方面，成功构建了肝癌、SCLC动物模型并进行了基因功能的研究；在疾病治疗方面，通过敲除SOD1基因延缓了ALS小鼠的疾病进展。可见，上述研究进展加深了人们对疾病发生发展机理的理解，为探索新的治疗策略奠定了理论基础。
但CRISPR/Cas9基因编辑工具仍存在一些问题，最主要的就是脱靶效应、安全性和医学伦理等问题。脱靶效应指的是，在CRIPSR/Cas9工作过程中，因为识别错误的PAM序列或者sgRNA与DNA的错配等原因，导致的非靶向性识别和切割。对此问题，研究人员可通过合理设计sgRNA、使用Cas9变体或者给CRISPR/Cas9系统加“开关”等方法，提高基因编辑的特异性，降低脱靶效应。
除了脱靶问题，能否将基因编辑工具安全地、准确地靶向递送到指定部位也是影响安全性的一大难题。对此，使用非病毒递送载体是一种更有利的选择。以纳米材料为例，其尺寸小，对其进行表面修饰还可以实现特异性更高的递送，提高递送的靶向性，这对于在体内进行基因编辑来说更利于提高安全性。另外，使用CRISPR/Cas9进行的研究多局限于临床前研究，进入临床的实验较少，所以在改进CRISPR/Cas9系统的同时还要在动物研究中进行更严格的测试，确保其在临床实验中的安全性和可行性后再进入临床应用。
基因编辑附带产生的医学伦理问题也非常值得关注。最新研究结果显示，使用CRISPR/Cas9在胚胎中进行基因编辑仍有未预期的结果发生。例如，在利用CRISPR/Cas9敲除胚胎中的POU5F1基因的实验中却发现有22%的胚胎都在POU5F1基因座附近出现了未预料的数千个碱基的缺失[110]；在另一项利用CRISPR/Cas9校正胚胎中携带的EYS突变的实验中，发现有50%的胚胎因DSB未被修复而导致了EYS所在染色体的丢失[111]。上述研究均表明CRISPR/Cas9在进行基因编辑的过程中可能导致胚胎内大片段的基因缺失、染色体缺失的现象。不同于体细胞水平的基因编辑，胚胎内的基因组或染色体组水平的不稳定将有机会传递给后代，造成不可逆的群体影响。另外，国际上，人类胚胎干细胞研究的伦理准则是：开展人类胚胎体外研究的过程中，在体外培养人类胚胎的时间不得超过14 d (自受精之日起)，研究后需销毁，不得出生。所以，以生殖为目的进行生殖细胞的基因编辑操作是严重违背科学道德的，“基因编辑婴儿”的出生严重违背了相关国际(伦理) 准则。对此，我国在2019年7月通过了《国家科技伦理委员会组建方案》[112]，成立国家科技伦理委员会，标志着我国已着手建立经得起伦理考验的法律制度体系，防范科学伦理道德不端的事件发生。
综上，CRISPR/Cas9是一种极具发展潜力的新型基因编辑工具，随着基础研究和临床应用的不断革新，CRISPR/Cas9将会在更广泛的领域为疾病治疗带来新希望。
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