袁军#, 秦岭#, 赵家儒, 王银春, 汪世华
福建农林大学生命科学学院, 福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室, 福建 福州 350002
收稿日期：2020-09-23；修回日期：2020-12-11；网络出版日期：2021-03-23
基金项目：国家自然科学基金（31600118）
*通信作者：汪世华, Tel: +86-591-83787126;E-mail: wshyyl@sina.com.
#并列第一作者。
摘要：[目的] Ste50是真菌中重要的衔接子蛋白，在多个MAPK级联通路中起重要的信号衔接与传递作用。本研究鉴定出了黄曲霉AflSte50蛋白，并发现了其对黄曲霉的生长、产孢、致病能力和响应渗透压胁迫等方面的影响。[方法] 首先通过生物信息学方法在黄曲霉NRRL 3357中鉴定出ste50基因，并通过同源重组的方法构建了ste50基因的敲除和互补突变体菌株。而后，对基因敲除在黄曲霉生长发育、次级代谢产物合成和胁迫响应等方面的作用进行了研究。[结果] 与野生型相比，ΔAflste50菌株生长速度和AFB1合成量降低且不能产生菌核，同时对花生、玉米种子的致病能力下降。该基因在渗透胁迫条件下正调控MAP激酶的磷酸化水平，但对细胞壁胁迫无响应。[结论] Ste50（AFLA_002340）是黄曲霉衔接子蛋白，影响黄曲霉的生长、发育和AFB1的合成，能够响应渗透压胁迫，在HOG通路中发挥作用。
关键词：黄曲霉衔接子蛋白AFB1致病性
Effects of adaptor protein Ste50 on growth, development and pathogenicity of Aspergillus flavus
Jun Yuan#, Ling Qin#, Jiaru Zhao, Yinchun Wang, Shihua Wang
Fujian Key Laboratory of Pathogenic Fungi and Mycotoxins, School of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China
Received: 23 September 2020; Revised: 11 December 2020; Published online: 23 March 2021
*Corresponding author: Shihua Wang, Tel: +86-591-83787126; E-mail: wshyyl@sina.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31600118)
#Those authors contributed equally to this work.
Abstract: [Objective] Ste50 is an important adaptor protein in fungi, which plays important roles in signal connection and transmission in multiple MAPK pathways. In this study, Aflste50 protein of Aspergillus flavus was identified and its effects on growth, conidiation, pathogenicity and response to osmotic stress were found. [Methods] Firstly, the ste50 gene was identified in A. flavus NRRL 3357 by bioinformatics method. Then, the effect of gene knockout on growth, secondary metabolite synthesis and stress response of A. flavus were tested. [Results] Compared with the wild type, the growth rate and AFB1 synthesis of ΔAflste50 strain were decreased. And sclerotia formation of A. flavus was blocked when ste50 was absent. At the same time, the pathogenicity to peanut and maize seeds was impaired in ΔAflste50. Also, AflSte50 regulated the phosphorylation of MAP kinase under osmotic stress, but did not respond to cell wall stress. [Conclusion] Ste50 (AFLA_ 002340) is an adaptor protein of A. flavus, which affects the growth and development, as well as the synthesis of AFB1 in this fungus. It can respond to osmotic stress and play a role in the HOG pathway.
Keywords: Aspergillus flavusadaptor proteinAFB1pathogenicity
黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种广泛分布于自然界中的动物和植物致病丝状真菌，它能够寄生在主要经济农作物(花生，玉米等)上，并产生黄曲霉毒素(aflatoxins)[1]。黄曲霉毒素是黄曲霉产生的主要次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1 (aflatoxins B1，AFB1)是目前发现的致病性最强的真菌毒素[2]。人类或动物在食用被黄曲霉污染后的食品或饲料后，容易造成黄曲霉毒素中毒，严重的可能会导致肝癌的产生[3]。黄曲霉在营养条件充足的条件下，能够通过无性繁殖产生大量分生孢子。分生孢子具有体积小易于传播的特点，能够侵染植物造成曲霉病[4]。而菌核是黄曲霉产生的用来适应恶劣生长环境的菌丝团体，在适宜的条件下能够重新萌发[5]。
丝裂原活化蛋白激酶级联(mitogen-activated protein kinase cascades，MAPKs)是存在于真核生物中保守的磷酸化信号逐级传递网络，对维持真菌包括病原真菌的生长、分化和次级代谢产物的形成至关重要[6]。在模式真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，目前已经鉴定出包括高渗透压甘油信号通路(high osmolarity glycerol signaling pathway，HOG pathway)在内的4条利用MAPK级联的通路[7]。其中，衔接子ScSte50p在3个MAPK介导的信号传导途径中起重要作用，交配信息素反应(mating/pheromone-response)、侵袭/丝状生长(invasive/filamentous growth)和渗透压应激(HOG pathway)通路[8-9]。还有研究表明，罗伯茨绿僵菌(Metarhizum robertsii) Ste50p在细胞完整性通路(cell-wall integrity pathway，CWI)中起信号传导作用[10]。酿酒酵母膜蛋白Opy2p感受到外界渗透压信号时，位于其N端的CR(conserved regions)结构域能够与Ste50p的RA (ras-association)结构域结合，将磷酸化信号传递给Ste50p-Ste11p蛋白复合体[11]。Ste11p是酿酒酵母中典型的MAP激酶激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MAPKKK)，磷酸化的Ste11p转而将信号传递到HOG和Fus3/Kss1通路中，激活MAP激酶Hog1和Fus3来调控细胞的生长与增殖[12]。此外，罗伯茨绿僵菌中MrSte50p能够与CWI通路的MAPKKK MrBck1p直接相互作用，从而激活MAP kinase MrSlt2p[10]。衔接子蛋白Ste50在新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)中正调控无性孢子的生成[13]。在植物病原体禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中，Ste50p的缺失对其生长与次级代谢产物脱氧雪腐烯醇(deoxynivalenol，DON)的生物合成会造成严重影响[14]。在模式丝状真菌构巢曲霉中，由AnSte50-Ste11-Ste7-Fus3组成的MAPK级联控制了其菌丝生长与次生代谢。其中Ste50p作为衔接子蛋白，在将细胞外信号传递给MAPK级联过程中起到至关重要的作用[15]。
炭疽病菌(Colletotrichum fructicola)中ste50对其生长、无性繁殖以及附着孢的形成是不可或缺的，同时还影响其致病性[16]。黄曲霉中已经成功鉴定出MAPK级联通路中3个重要的MAP kinase (sakA，slt2，mpkB)[17-19]，但缺少对MAPK通路的衔接子Aflste50的研究。在本研究中，我们鉴定出了AflSte50p，通过同源重组技术构建了Aflste50的基因敲除与互补菌株，发现Aflste50的缺失影响了黄曲霉的生长、产孢和菌核形成。更重要的是，ΔAflste50菌株表现出侵染和毒素合成能力的降低。同时，实验结果表明，Aflste50参与渗透胁迫的响应，但是对细胞壁胁迫不敏感。这些结果将加深我们对黄曲霉生长发育分子机制的理解，为开发新的抗真菌药物提供潜在的靶标。
1 材料和方法 1.1 供试菌株和培养基 本研究所用的黄曲霉菌株及来源见表 1。利用同源重组技术，以A. flavus CA14 PTS为出发菌株构建Aflste50基因缺失与互补突变体菌株。PDA (BD，USA)培养基用于菌丝生长、产孢量统计，CM (6 g/L蛋白胨，6 g/L酵母粉，10 g/L蔗糖)用于菌核培养，YES (150 g/L蔗糖，20 g/L酵母膏，1 g/L MgSO4·7H2O)用作黄曲霉毒素合成培养基，固体培养基通过添加15 g/L琼脂配制。
表 1. 本研究所使用及构建的菌株 Table 1. Fungal strains used and constructed in this study
| Strains | Genotypes | Sources |
| A. flavus Wild-type (WT) | Δku70, ΔpyrG | [20] |
| A. flavus CA14 PTS | Δku70, ΔpyrG::AfpyrG | [21] |
| A. flavus Δste50 | Δku70, ΔpyrG, Δste50::AfpyrG | This study |
| A. flavus Δste50C | Δku70, ΔpyrG, Δste50::AfpyrG; ste50(p):: ste50::ptrA | This study |
表选项
1.2 生物信息学分析 在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的数据库中通过BLAST (basic local alignment search tool)工具，用S. cerevisiae的Ste50 (NP_009898.1)氨基酸序列比对出黄曲霉Ste50 (XP_002382435.1)氨基酸序列。然后用黄曲霉Ste50氨基酸序列进行BLAST，比对出米曲霉(A. oryzae) Ste50 (XP_001822344.1)、烟曲霉(A. fumigatus) Ste50 (XP_756047.1)、构巢曲霉(A. nidulans) Ste50 (XP_680521.1)等的氨基酸序列。使用MEGA7.0软件中的Clustal W功能先进行蛋白序列多重比对，然后通过Maximum likelihood法构建进化树。采用在线网站SMART (http://smart.emblheidelberg.de)用来预测Ste50蛋白功能结构域。
1.3 黄曲霉ste50基因敲除与互补突变体菌株构建 利用同源重组技术构建突变体，以黄曲霉基因组为模板，使用引物P1和P3扩增ste50基因上游5' UTR同源臂，使用引物P6和P8扩增下游3' UTR同源臂。使用pryG-F和pryG-R引物扩增烟曲霉AfpyrG基因作为筛选标记，通过巢式引物P2和P7，采用Double-Joint PCR构建同源重组片段[22]，然后利用PEG转化法将重组片段转入A. flavus CA14 PTS原生质体。将转化子挑入新的PDA培养基中，并提取基因组进行PCR验证，ORF (open reading frame)片段通过P9和P10引物进行扩增，AP片段通过P1和P907R引物进行扩增，BP片段通过P919R和P8引物进行扩增。突变体初步验证成功后，提取其总RNA，反转录为cDNA，使用qPCR-P9和qPCR-P10引物扩增cDNA片段，并且通过qPCR-F和qPCR-R引物在转录水平验证ste50基因的相对表达量。最后通过Southern blotting验证野生型与敲除突变体AfpyrG基因插入区域。使用同源重组技术进行互补菌株的构建，以黄曲霉基因组为模板，使用引物P11和P13扩增出包含5' UTR同源臂和完整ste50基因片段。使用ptrA-F和ptrA-R引物扩增出ptrA基因片段。使用引物P16和P18扩增出作为3' UTR同源臂pyrG基因片段。利用巢式引物P12和P17将以上3个片段相连接构建同源重组片段，然后利用PEG转化法将重组片段转入Δste50菌株的原生质体，在10 mL上层复苏培养基中添加1 μg吡啶硫胺。将转化子挑入新的PDA培养基中，并提取基因组进行PCR验证，ORF片段通过P9和P10引物进行扩增，AP片段通过P1和S1116R引物进行扩增，BP片段通过P2053F和P17引物进行扩增。突变体初步验证成功后，提取其总RNA，反转录为cDNA，使用qPCR-P9和qPCR-P10引物扩增cDNA片段，并且通过qPCR-F和qPCR-R引物在转录水平验证ste50基因的相对表达量。本研究所使用引物序列见表 2。
表 2. 本研究中所使用到的引物 Table 2. PCR primers used in this study
| Primers | Sequences (5'→3') | Characteristics |
| Δste50-p1 | GAGATTGATCCGCAAGAGG | For 5'UTR of Δste50 |
| Δste50-p3 | GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGC GACACGACACAACGAAGG | |
| pyrG-F | GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC | For A. fumigatus pyrG |
| pyrG-R | GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC | |
| Δste50-p6 | GCATCAGTGCCTCCTCTCAGAC CATTACTACCTGTTGCTTGAG | For 3'UTR of Δste50 |
| Δste50-p8 | CGGATAGCGAGGATAATACG | |
| Δste50-p2 | CTGGACAAGTAGGAATAGACA | For fusion PCR |
| Δste50-p7 | AGACAAGAGACAGAAGCAAT | |
| pyrG-907-R | ATGACGGCGATGTAGGGA | For Δste50 mutant screen |
| pyrG-919-F | CGACATCCTCACCGATTTCA | |
| ste50C-p11 | TCGCTTCCTTACTCTATTGA | For 5'UTR of ste50C |
| ste50C-p13 | TAGGAAGTGTGGAGAGACAT TTATAGCACTCCGCCGGGTAGA | |
| ptrA-F | TTAGTGCTTTACGGCACCTCG | For ptrA |
| ptrA-R | ACTTTATCCGCCTCCATCCAG | |
| ste50C-p16 | CTGGATGGAGGCGGATAAAGT GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC | For 3'UTR of ste50C |
| ste50C-p18 | GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC | |
| ste50C-p12 | CCTATCTCAAGTCTCACTATCT | For fusion PCR |
| ste50C-p17 ste50-1116-R ptrA-2053-F | TCCTCCACAACACTCGTA TGGGGGCTGCGGCTAGTGTT AAGGAGGGGTTGAGTTAAAT | For Δste50C mutant screen |
| qRT-abaA-F | TCTTCGGTTGATGGATGATTTC | qRT-PCR for conidial |
| qRT-abaA-R | CCGTTGGGAGGCTGGGT | biosynthesis |
| qRT-brlA-F | GCCTCCAGCGTCAACCTTC | |
| qRT-brlA-R | TCTCTTCAAATGCTCTTGCCTC | |
| qRT-nsdC-F | GCCAGACTTGCCAATCAC | qRT-PCR for sclerotial |
| qRT-nsdC-R | CATCCACCTTGCCCTTTA | formation |
| qRT-nsdD-F | GGACTTGCGGGTCGTGCTA | |
| qRT-nsdD-R | AGAACGCTGGGTCTGGTGC | |
| qRT-aflR-F | AAAGCACCCTGTCTTCCCTAAC | qRT-PCR for AFB1 |
| qRT-aflR-R | GAAGAGGTGGGTCAGTGTTTGTAG | biosynthesis |
| qRT-aflS-F | CCAGACTCGGCCTTAGCTTC | |
| qRT-aflS-R | CGTGGAGGATACGCTCACTC | |
| qRT-aflK-F | GAGCGACAGGAGTAACCGTAAG | |
| qRT-aflK-R | CCGATTCCAGACACCATTAGCA | |
| Δste50-qPCR-p9 | TTGCGAGATGAGCGAATT | ORF validates primers |
| Δste50-qPCR-p10 ste50-qPCR-F ste50-qPCR-R | AGGATTGACTGGCGGATA GCACTGTATATCGTGTATGG GGATTGACTGGCGGATAG | qRT-PCR for ste50 expression level |
| Δste50-probe-p9 | GGACAGCAATACCAGACTC | For Southern blotting probe |
| Δste50-probe-p10 | CGATTACCACGCTCAAGT | |
| actin-F | ACGGTGTCGTCACAAACTGG | For actin |
| actin-R | GCGTATCGTCGTTACCTCATC |
表选项
1.4 黄曲霉Δste50菌株生长发育测定 将1 μL浓度为107个孢子/mL的WT、Δste50和Δste50C菌株孢子悬浮液点在PDA培养基的中央，37 ℃暗培养4 d后测量菌落生长直径，并统计孢子生产量。另取在PDA培养基上培养3 d后的平皿，刮去表面菌丝，切取规则形状带有菌落的培养基，放置在铺有滤纸的载玻片上。37 ℃暗培养10 h后显微(Leica，Germany)观察拍取分生孢子梗。将同样数量的上述菌株孢子悬浮液接种在CM培养基上，37 ℃暗培养7 d后用酒精喷洗平皿表面菌落，拍照并统计菌核生产量。实验设置3个平行，重复3次。
1.5 黄曲霉Δste50菌株AFB1合成测定 20 μL浓度为107个孢子/mL的WT、Δste50和Δste50C菌株孢子悬浮液接种于10 mL YES液体培养基中，29 ℃黑暗条件下培养7 d。吸取1.5 mL含有次级代谢产物的培养基，添加等体积的二氯甲烷进行抽提。置于通风橱风干后，加入50 μL的二氯甲烷复溶。利用薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)检测菌株AFB1的合成量[23]。实验设置3个平行，重复3次。
1.6 黄曲霉Δste50菌株致病性测定 选取相似体积与形状的花生、玉米种子，用75%酒精(0.02%曲拉通水配制)浸泡洗涤5 min，洗涤后的种子用曲拉通水冲洗3次。在平皿中铺两张滤纸，均匀摆放花生与玉米种子。3 μL浓度为107个孢子/mL的WT、Δste50、Δste50C孢子悬浮液接种于种子表面，29 ℃条件下每12 h更换暗/亮环境培养。每隔24 h向平皿滤纸上添加500 μL曲拉通水，保持湿润。7 d后观察拍照，统计孢子生产量，并提取侵染后种子中的黄曲霉毒素AFB1。实验设置3个平行，重复3次。
1.7 黄曲霉Δste50菌株对胁迫的响应 1 μL浓度为107个孢子/mL的WT、Δste50、Δste50C菌株孢子悬浮液接种于含有渗透压胁迫1.2 mol/L NaCl的固体YES培养基，37 ℃黑暗条件下培养4 d，测量菌落直径并拍照。在细胞壁胁迫实验中，孢子悬浮液接种于含有100 μg/mL的荧光增白剂(calcofluor white，CFW)、50 μg/mL的SDS (sodium dodecyl sulfate)固体PDA培养基上，37 ℃黑暗条件下培养4 d，测量菌落直径并拍照。胁迫抑制率=[(对照组菌落直径–胁迫组菌落直径)/对照组菌落直径]×100%。实验设置3个平行，重复3次。
1.8 RNA提取与real-time PCR 20 μL浓度为107个孢子/mL的WT、Δste50和Δste50C菌株孢子悬浮液接种于铺有玻璃纸的PDA、YES和CM培养基，37 ℃黑暗条件下培养24 h。刮取玻璃纸表面菌丝，液氮研磨菌丝直至粉末。使用RNA试剂盒(Tian mo，China)抽提total- RNA，通过反转录试剂盒(Trans，China)将RNA反转录为cDNA。通过PikoReal 96荧光定量PCR仪(Thermo scientifics，USA)检测相关基因相对表达量[24]。
2 结果和分析 2.1 黄曲霉ste50的生物信息学分析 在A. flavus NRRL3357基因组数据库中，通过S. cerevisiae S288C的Ste50 (NP_009898.1)氨基酸序列比对推断的AflSte50 (XP_002382435.1)蛋白序列。然后通过黄曲霉Ste50氨基酸序列BLAST筛选出亲缘关系较近的米曲霉(A. oryzae RIB40，XP_001822344.1)、烟曲霉(A. fumigatus AF293, XP_756047.1)、构巢曲霉(A. nidulans FGSC A4, XP_680521.1)等丝状真菌的氨基酸序列。将黄曲霉Ste50蛋白的氨基酸序列与比对出的其他真菌的Ste50蛋白的氨基酸序列进行系统发育进化分析(图 1-A)。同时通过在线网站SMART预测上述物种Ste50蛋白的功能结构域(图 1-B)。结果显示Ste50蛋白在真菌中具有高度保守性，且A. flavus中的Ste50与A. oryzae和A. fumigatus具有100%相似性。
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| 图 1 Ste50蛋白的生物信息学分析 Figure 1 Bioinformatic analysis of Ste50 proteins from different fungi. A: phylogenetic analysis of Ste50 homologous proteins in different species; B: homologue domain analysis of Ste50 proteins in different species. |
| 图选项 |
2.2 黄曲霉ste50基因缺失与互补菌株构建 为了研究黄曲霉衔接子ste50基因的功能，我们通过同源重组技术，对ste50基因的开放阅读框ORF进行了基因敲除与互补，构建原理分别如图 2-A、D。利用烟曲霉pyrG基因替换黄曲霉目标基因ste50，挑取敲除与互补菌株阳性转化子，提取其基因组，通过多对引物进行PCR初步验证，野生型和互补菌株中存在的ORF在敲除菌株中未能检测到，且敲除和互补菌株中都能检测到AP与BP片段(图 2-B)。然后提取敲除与互补阳性转化子菌株的总RNA，并反转录为cDNA，在cDNA水平上进行PCR验证，以Actin为内参，Δste50菌株的cDNA中未能检测到ORF (图 2-C)。我们还通过Southern blotting验证野生型与ste50敲除菌株的AfupyrG插入区域，敲除菌株中能够杂交出大小为3574 bp的目标条带，野生型则没有条带，表明AfupyrG插入到了指定位置(图 2-E)。qRT-PCR测定ste50基因在WT、Δste50和Δste50C中的相对表达量，在敲除菌株中未能检测到ste50基因的表达，且其在WT和Δste50C菌株中具有相似的表达量。以上结果皆在分子水平上证明了ste50基因的成功敲除与互补菌株的正确构建。
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| 图 2 黄曲霉ste50基因敲除与互补菌株构建 Figure 2 Construction of ste50 deletion and complement mutants in A. flavus. A, D: schematic illustration for ste50 disruption and complement; B: verification of Δste50 and ste50C mutants by diagnostic PCR; C: verification of ste50 deletion and complement mutants with reverse transcription-PCR; E: verification of ste50 deletion strain by Southern blotting; F: expression levels of ste50 in WT, Δste50 and Δste50C strains detected by qRT-PCR. ND: not detectable. |
| 图选项 |
2.3 ste50影响黄曲霉的生长发育 黄曲霉在营养充足条件下产生的分生孢子是其重要的无性繁殖的方式之一[4]。将WT、Δste50和Δste50C孢子悬浮液接种于PDA培养基，在黑暗条件下37 ℃培养4 d后，统计菌落直径与孢子生产量，发现Δste50菌株生长速率小于野生型(图 3–C)。显微观察生长10 h时分生孢子梗形态，发现此时Δste50菌株还未能产生分生孢子，但是野生型和互补菌株分生孢子梗上已经产生分生孢子(图 3-D)。通过qRT-PCR检测了孢子合成相关基因abaA和brlA的表达水平，结果表明所测基因的相对表达量在各菌株中均明显降低(图 3-E)。将平皿上孢子收集到EP管中并拍照，由图 3-F可看出，Δste50菌株孢子液与野生型明显不同，分别呈浅绿色和深绿色。将菌株接种在CM培养基上37 ℃培养7 d后，用酒精喷洗平皿表面菌丝，统计菌核数量同时显微观测平皿局部。实验结果表明，与野生型产生大量菌核不同的是，ste50缺失菌株不再产生菌核(图 3-G，H)。qRT-PCR测定菌核生产相关基因nsdC和sclR的相对表达量，两者在敲除株中均极显著降低(图 3-I)。以上结果表明，ste50基因影响黄曲霉的生长且与无性孢子及孢子色素的合成相关。同时，ste50基因对黄曲霉的菌核形成起着不可或缺的作用。
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| 图 3 ste50缺失对菌株生长发育的影响 Figure 3 Influence of ste50 deletion on the development of A. flavus. A: colony morphology of WT, Δste50 and ste50C in PDA; B: colony diameters of A; C: the number of conidia produced; D: microscopic analysis of conidial structures (magnification: ×200); E: relative expression levels of brlA and abaA genes in indicated strains; F: different colors of indicated strains' conidial suspension; G: colony morphology of indicated strains after washed; H: number of Sclerotial in G; I: relative expression levels of nsdC and sclR genes in indicated strains. ND: not detectable. **: P < 0.01; ***: P < 0.001. |
| 图选项 |
2.4 ste50参与黄曲霉AFB1的合成 微生物次级代谢产物如青霉素、洛伐他汀等对人类生活至关重要[25-26]，但是黄曲霉次级代谢产物AFB1却因其严重危害人体健康而备受关注。为了探究ste50基因对黄曲霉毒素AFB1合成的影响，我们将WT、Δste50和Δste50C孢子悬浮液接种于YES液体培养基中，黑暗条件下29 ℃培养7 d。采用TLC法检测提取的黄曲霉毒素，并通过半定量法检测AFB1产量。实验结果表明，Δste50中AFB1产量显著低于野生型与互补菌株(图 4-A，B)。目前，黄曲霉AFB1合成的基因簇已经被清晰地鉴定出来，我们通过qRT-PCR测定了该基因簇中毒素合成的调控基因aflR、aflS和结构基因aflK的相对表达量，结果表明3个基因的表达均显著降低(图 4-C)。
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| 图 4 ste50对黄曲霉AFB1合成的影响 Figure 4 Roles of ste50 in AFB1 biosynthesis in A. flavus. A: AFB1 production of WT, Δste50 and ste50C strains detected by TLC assay; B: data analysis of AFB1 production in indicated strains; C: relative expression levels of aflatoxin biosynthesis structural gene and regulatory genes in different strains. ND: not detectable.**: P < 0.01; ***: P < 0.001. |
| 图选项 |
2.5 ste50影响黄曲霉对作物种子的致病能力 黄曲霉能够寄生在农作物上，导致严重的经济损失[1]。我们的研究发现，ste50可影响黄曲霉生长以及AFB1的合成，于是推测ste50和黄曲霉的致病能力可能也存在关联。将WT、Δste50和Δste50C孢子悬浮液接种于经无菌处理过的花生、玉米表面，置于黑暗条件下29 ℃培养7 d。将侵染后的种子进行观察并拍照，发现接种Δste50菌株的种子表面菌丝量明显减少(图 5-A，B)。收集种子表面的分生孢子进行统计发现，Δste50菌株在花生与玉米表面的产孢量显著低于野生型与互补菌株，侵染传播能力下降(图 5-E)。通过二氯甲烷提取侵染后种子中的黄曲霉毒素，并采用TLC法检测AFB1的合成量。检测结果显示，在侵染花生和玉米后，野生型和互补菌株中的AFB1合成量显著高于ste50基因敲除菌株(图 5-C，D，F)。
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| 图 5 ste50缺失对菌株致病力的影响 Figure 5 Effect of ste50 deletion on pathogenicity of strains. A, B: phenotype analysis of indicated strains cultured on peanuts and maize, respectively; C, D: AFB1 production in infected peanut and maize seeds detected by TLC assay, respectively; E: quantification of conidia collected from the infected peanut and maize seeds; F: quantification of AFB1 production from the infected peanut and maize seeds. ND: not detectable. ***: P < 0.001. |
| 图选项 |
2.6 Ste50参与黄曲霉HOG通路对渗透压的响应 酿酒酵母中，Ste50是HOG通路中的重要衔接子蛋白，响应外界渗透压刺激[8]。为了验证黄曲霉Ste50是否参与HOG通路响应渗透胁迫，将WT、Δste50和Δste50C孢子悬浮液接种于含有1.2 mol/L NaCl的YES培养基上，并以正常YES培养生长为对照，黑暗条件下37 ℃培养4 d。测量平皿上菌落直径并计算生长抑制率，同时对平皿进行拍照(图 6-A，B)。提取培养在YES培养基上的WT和Δste50的蛋白，设置对照组和处理组(1.2 mol/L NaCl)。通过Western blotting检测HOG通路中蛋白激酶Hog1的磷酸化水平，以Hog1蛋白为上样对照(图 6-C)。结果显示，ste50基因参与对HOG通路渗透压胁迫的响应，并正调控Hog1蛋白的磷酸化水平(图 6-C)。
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| 图 6 Δste50菌株对渗透压胁迫的响应 Figure 6 Response of strains to osmotic stress. A: colony phenotype of indicated strains under 1.2 mol/L NaCl; B: growth inhibition rate in A; C: phosphorylation level of Hog1 in WT and Δste50 strains under 1.2 mol/L NaCl. **: P < 0.01. |
| 图选项 |
2.7 ste50缺失不影响细胞壁完整性通路 衔接子蛋白Ste50在罗伯茨绿僵菌中与CWI通路的MAPK激酶Bck1互作[10]，黄曲霉中Ste50是否也能够接收外界细胞壁胁迫刺激，从而传递磷酸化信号至CWI通路还未知。将WT、Δste50和Δste50C菌株孢子悬浮液接种于含有细胞壁胁迫试剂100 μg/mL CFW和50 μg/mL SDS的PDA培养基上，以正常PDA培养为对照，黑暗条件下37 ℃培养4 d。测量菌落直径并计算相关抑制率，同时进行拍照(图 7-A)。结果显示，Δste50菌株在细胞壁胁迫条件下的生长抑制率与WT和Δste50C菌株相比没有显著差异(图 7-B)。
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| 图 7 Δste50菌株对细胞壁胁迫的响应 Figure 7 Response of strains to cell-wall stress. A: colony phenotype of indicated strains under different cell-wall stresses; B: growth inhibition rate in A. |
| 图选项 |
3 讨论 HOG通路是酵母中利用MAPK级联传递磷酸化信号的经典通路之一，MAPK级联在真核生物中非常保守[6-7]。在感受外界渗透、氧化和细胞壁等胁迫时，能够通过MAPK级联通路将信号从膜传递到细胞核，并调节转录和翻译等过程从而影响细胞周期进程[7]。前期研究发现，Ste50p是多种真菌中重要的衔接子蛋白。因其能够衔接上游膜蛋白或ATP酶等传递的信号至MAPK级联，且其不只专属于某一特定通路[8-9]，因而具有重要的研究意义。本研究对致病真菌黄曲霉中ste50基因的生物学功能，通过基因敲除和互补进行了相关功能的研究。
在本项研究中我们发现ΔAflste50菌落生长直径及无性孢子的产量均显著小于野生型，同时发现孢子合成相关基因brlA和abaA相对表达量均显著下调。更引起我们注意的是，ΔAflste50孢子呈现浅绿色，这与我们课题组已经报道的属于黄曲霉交配信息素反应通路的ΔAflste11和ΔAflfus3菌株生产的孢子颜色相似[27-28]。据报道，在动物致病模式真菌A. nidulans的研究中发现，交配信息素反应通路中的Anste50对其无性繁殖非常重要，且其与AnSte11p和AnSte7p能够共定位于细胞膜与细胞质中，但是不能随着AnFus3p进入细胞核。有趣的是ΔAnste11和ΔAnste7菌株产生颜色相似但不同于野生型的孢子[15]。在植物致病真菌F. graminearum中，FgSte50p-Ste11p-Ste7p能够形成蛋白复合体，且他们的基因缺失不仅影响菌株的生长，还均会引起与野生型不同的孢子颜色变化[14]。在C. neoformans中，Cnste50通过交配信息素反应通路直接控制其性别分化[13]。通过以上结果我们推测，Aflste50极有可能通过交配信息素反应通路与MAPK级联激酶存在协同作用，从而控制黄曲霉的有性生殖，但是还需要进一步的实验验证。
本研究发现，ΔAflste50菌株合成次级代谢产物AFB1的能力与野生型相比显著下降，qRT-PCR结果也显示出黄曲霉毒素合成基因簇上的调节基因aflR与aflS，结构基因aflK的相对表达量均下调。类似的，在F. graminearum中Fgste50的缺失菌株几乎不能产生呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)，且其也表现出对重要农作物小麦致病能力的缺失[14]。我们的研究结果还发现，黄曲霉中ste50基因的缺失会导致菌株对经济作物花生和玉米的侵染和致病力下降，同时AFB1合成能力也明显降低。ste50基因在C. fructicola中的缺失，与黄曲霉中致病能力的影响方面也具有相似的情况[16]。据研究表明，黑曲霉(A. niger)中AniFus3p和其上游激酶AniSte7p影响其营养生长和次级代谢产物的形成，而A. nidulans则通过AnSte50p-Ste11p- Ste7p-Fus3p组成的MAPK级联，控制了其菌丝生长与次生代谢产物合成[29]。有趣的是，在A. nidulans中发现AnFus3p和细胞核内转录因子AnSte12p相互作用，AnSte12p能够磷酸化全局调控因子AnVeAp，从而影响真菌的有性发育和次级代谢产物的合成[15]。真菌中编码交配信息素反应通路的基因具有高度保守性[30]，黄曲霉中ste50基因缺失所表现出的生长发育和次级代谢产物的合成方面的缺陷，可能主要是通过交配信息素反应MAPK通路进行调控。
ΔAflste50菌株在渗透压胁迫刺激下，具有比WT菌株更高的生长抑制率和更低的MAP激酶Hog1p的磷酸化水平，表明其参与黄曲霉的HOG通路，且在胁迫条件下正调控Hog1的磷酸化。S. cerevisiae中磷酸化的Hog1蛋白会进入细胞核，启动一个复杂的自适应程序，包括暂时停止细胞周期、调节转录和翻译模式、启动甘油合成基因Gpd1的表达等[31]。在黄曲霉中Hog1p的同源蛋白SakA在山梨醇渗透胁迫的刺激下，也能够转运进入细胞核[17]，所以这可能是造成ΔAflste50菌株在渗透压胁迫刺激下生长抑制率更高的原因之一。ScSte50蛋白的RA结构域是HOG通路中将MAPKK激酶Ste11p定位到质膜上所必需的，从而使S. cerevisiae SHO1支路膜信号受体接收到的信号传递到Hog1，说明ScSte50p在HOG MAPK级联中发挥重要作用[32]。虽然在M. robertsii中MrSte50能够与CWI通路的MAPKK激酶Bck1发生相互作用[10]，但是我们发现ΔAflste50菌株并不响应细胞壁胁迫刺激，这可能是因为Ste50p在黄曲霉中主要响应外界渗透压信号，并且参与交配信息素反应通路，也可能与物种的差异性有关。
总的来说，ste50对黄曲霉生长发育和次级代谢产物的合成具有重要影响，同时作为衔接子蛋白参与了HOG通路的调控，更重要的是ste50的缺失能够显著降低黄曲霉对植物的致病能力。这些研究结果将为黄曲霉污染的防治提供一定的理论基础。
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