李峰, 邓江丽, 陈雯雯, 王立华, 毛雅慧
湖北工程学院生命科学技术学院, 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室, 湖北 孝感 432000
收稿日期：2021-01-30；修回日期：2021-04-24；网络出版日期：2021-06-08
基金项目：国家自然科学基金(31700567);2019年中央引导地方科技发展专项(2019ZYYD045)
*通信作者：毛雅慧, E-mail: maoyh3@sina.com.
摘要：[目的] 本研究旨在揭示核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas arboricola pv.juglandis，Xaj）DW3F3中rpfG基因的生物学功能，从而为核桃细菌性黑斑病防治药剂的开发提供作用靶点。[方法] 以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc）8004菌株以及水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）PXO99A的rpfG基因为模板序列，对Xaj野生型菌株DW3F3的基因组序列进行检索。利用同源重组技术，对Xaj中rpfG基因进行敲除，并用生物化学方法对基因缺失菌株的相关毒力因子、抗逆性进行检测。[结果] 通过同源比对，在XajDW3F3的基因组中发现了与XccrpfG、XoorpfG同源的基因，并成功获得rpfG的缺失突变株ΔrpfG。与野生型相比，突变株ΔrpfG的生物被膜形成能力仅为野生型XajDW3F3的44.58%；胞外多糖产量也由野生型的8.47 mg/mL降为5.23 mg/mL；ΔrpfG的絮凝活性增加，能使菌液变澄清；运动性实验显示ΔrpfG的运动直径比野生型增加了12.38%；胞外酶的分泌也发生了不同程度的改变，突变株分泌纤维素酶的能力极显著降低，淀粉酶活性有所提高，而分泌蛋白酶的能力未发生变化；此外rpfG缺失后，Xaj对逆境（盐、酸、SDS、硫酸铜）的耐受力降低。[结论] 结果表明rpfG基因能影响核桃细菌性黑斑病菌的致病相关性状，并赋予了细菌一定的抗逆性。
关键词：核桃细菌性黑斑病菌rpfG基因基因突变株毒力因子
Functional analysis of rpfG gene in Xanthomonas arboricola pv. juglandis
Feng Li, Jiangli Deng, Wenwen Chen, Lihua Wang, Yahui Mao
Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables, College of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Hubei Province, China
Received: 30 January 2021; Revised: 24 April 2021; Published online: 8 June 2021
*Corresponding author: Yahui Mao, E-mail: maoyh3@sina.com.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31700567) and by the Central Government Guides Local Science and Technology Development Project (2019ZYYD045)
Abstract: [Objective] The purpose of this study was to reveal the biological function of rpfG gene in walnut bacterial black spot pathogen (Xanthomonas arboricola pv. juglandis) XajDW3F3, so as to provide a target for the development of prevention and treatment agents for walnut bacterial black spot. [Methods] The rpfG gene of Xanthomonas campestris pv.campestris 8004 and Xanthomonas campestris pv.campestris PXO99A were used as template sequences to search the genome sequence of DW3F3, a wild-type strain of Xaj. With homologous recombination technology to knock out XajrpfG, the virulence factors and stress resistance of the mutant strain were detected by biochemical methods. [Results] Homologous gene was identified in XajDW3F3 genome through sequence homology analysis. The deletion mutant of rpfG was successfully obtained. Compared with the wild type, the mutant reduced the production of biofilm and extracellular polysaccharides, the ability of biofilm formation mutant strains ΔrpfG was only about 44.58% of wild type, the yield of exopolysaccharide decreased from 8.47 mg/mL in wild type to 5.23 mg/mL in ΔrpfG; but ΔrpfG increased the motility and flocculation activity, motility experiments showed that the motility diameter of ΔrpfG increased 12.38% than the wild type. The secretion of extracellular enzymes also changed at different degrees: the ability to secrete cellulase was significantly decreased and amylase activity was increased, but the ability to secrete protease was not changed. What's more, after the deletion of rpfG, the resistance of Xaj to adversity (NaCl, pH, SDS, CuSO4) was decreased. [Conclusion] The results showed that rpfG is an important pathogenic gene of walnut bacterial black spot pathogen, and endows bacteria with a certain degree of resistance to adversity.
Keywords: Xanthomonas arboricola pv.juglandisrpfG genemutant strainvirulence factor
我国是核桃种植大国，截止2018年，国家林业局共公布了74个国家级核桃示范基地名单[1]。核桃病害种类多达30多种，严重影响着核桃的产量和品质，其中黑斑病是最为严重的病害之一。该病是由多种致病变种引起的，树生黄单胞菌核桃致病变种(Xanthomonas arboricola pv. juglandis，Xaj)，又称核桃细菌性黑斑病菌，是其中的主要病原[2]。
扩散信号分子(diffusible signal factor，DSF)是2004年首先在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc)中鉴定的一种新型群体感应信号分子[3]。在Xcc中，rpf基因簇参与了DSF的合成和调控，rpfG则位于该基因簇中，其编码蛋白RpfG与RpfC、RpfF、RpfB组成关键元件[4-5]。研究表明在黄单胞菌属中包含两大类致病调控系统，分别是hrp/T3SS和rpf/DSF两大双组分信号传导系统(two-component signal transduction system，TCSTS)[6]。rpfC/rpfG是黄单胞菌属目前研究最多、作用机理最为清楚的TCSTS基因，该调控系统正向调控胞外酶和胞外多糖的合成，负向调控细菌生物被膜形成与解聚等[7]。DSF合成与调控机制如图 1所示，RpfG是一个应答性调节蛋白，具有磷酸二酯酶活性，降解胞内第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)，使c-di-GMP与其结合的全局性转录因子cAMP类受体蛋白(cAMP receptor-like protein，Clp)发生解离，而Clp直接或间接调控相关毒力基因的表达[8]，与病原菌对植物的致病性密切相关。rpfC和rpfG双组分系统在黄单胞菌属中广泛存在，且基因序列非常保守，但其生物学功能在不同的病原菌中不尽相同[9]。
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| 图 1 DSF型QS系统模型[4] Figure 1 Model of DSF type QS system[4]. A: at low cell density, the DSF production is restricted by RpfC, meanwhile, the activity of Clp is inhibited by formation of a c-di-GMP-Clp complex; B: at high cell density, the DSF accumulates and causes the autophosphorylation of RpfC, phosphorylated RpfC loses the inhibition of DSF synthase RpfF and activates RpfG by phosphorylation, as a result, c-di-GMP is degraded by the activated RpfG, the released Clp promotes the expression of virulence genes. |
| 图选项 |
在分类地位上，树生黄单胞菌核桃致病变种属于黄单胞属。通过对Xaj野生型菌株DW3F3的基因组生物信息学分析发现，XajDW3F3的rpf基因簇和Xcc菌株8004的rpf基因簇在基因组成及排列顺序上基本一致，并且两者rpf基因簇所编码的蛋白高度同源，其中RpfG序列同源性 > 90%。鉴于此，我们推测XajrpfG可能具有调控细菌相关毒力因子的功能，并参与群体感应信号的合成。本研究通过基因敲除和表型分析等手段，分析了树生黄单胞菌核桃致病变种的rpfG在胞外多糖合成、胞外水解酶分泌、生物被膜形成、DSF的合成中的功能。DSF依赖的群体感应系统是调控病原微生物致病性和环境适应性的重要方式，也是防治植物细菌性病害的重要切入点。目前尚未见针对黄单胞属核桃致病变种群体感应的研究，本研究将为揭示Xaj的致病机理提供研究证据，同时将为开发核桃细菌性黑斑病防治药剂提供一个新的作用靶点。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 供试菌株与质粒: 树生黄单胞核桃致病变种Xanthomonas arboricola pv. juglandis (Xaj) DW3F3，分离自丹江口核桃园内病变核桃果，保藏于湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室。本研究所用菌株和质粒详见表 1。
表 1. 本研究使用的菌株和质粒 Table 1. Strains and plasmid in this study
| Strains and plasmids | Relevant characteristics | Sources |
| Escherichia coli | ||
| DH5α | F–φ80ΔlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1endA1hsdR17(rk-, mk+) | Laboratory collection |
| S17-1 | F–, thi pro hsdR (RP4-2 Tc: : Mu Km: : Tn7 (Tp Sm)) | Laboratory collection |
| X. arboricola pv. juglandis | ||
| DW3F3 | Wild-type strain, Cef r | Laboratory collection |
| ΔrpfG | XajDW3F3 rpfG deletion | This study |
| ΔrpfG(rpfG) | ΔrpfG carrying plasmid PS-rpfG, Cef r, Gmr | This study |
| Plasmids | ||
| pSRK-Gm | pBBR1MCS-2-derived broad-host-range expression vector containing the lac promoter, lacIq, and lacZα+, Gmr | Laboratory collection |
| pK18mobsacB | sacB-based gene replacement vector, Kmr | Laboratory collection |
| PK-rpfG | DNA fragment used to deleted rpfG was cloned in pKl8mobsacB, Kmr | This study |
| PS-rpfG | rpfG ORF fragment inserted into vector pSRK, Gmr | This study |
表选项
1.1.2 培养基: YPG培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0。YPGA培养基(g/L)：YPG培养基中含琼脂15.0，pH 7.0。YPGS培养基(g/L)：YPGA培养基中含蔗糖100.0，pH 7.0。胞外蛋白酶检测培养基：YPGA中含1% (W/V)的脱脂奶粉。胞外淀粉酶检测培养基：YPGA中含0.1% (W/V)的可溶性淀粉。胞外纤维素酶检测培养基：YPGA中含有0.5% (W/V)的羧甲基纤维素(CMC)。运动性检测培养基(swarming平板)：YPG中添加0.5% (W/V)琼脂糖。
1.1.3 主要试剂: 头孢氨苄(Cef)，工作浓度为30 μg/mL，卡那霉素(Km)，工作浓度为30 μg/mL，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，工作浓度1 mmol/L，抗生素、IPTG均购于上海生工生物工程有限公司；刚果红、结晶紫购于上海生工生物公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物公司；限制性内切酶、T4连接酶、细菌总DNA提取试剂盒购自大连宝生物公司，PCR扩增酶类购自北京擎科生物公司；引物合成和测序均由上海生工完成，研究所用引物见表 2。其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司(上海)。
表 2. 本研究所使用的引物序列信息 Table 2. Primers used in this study
| Primer name | Primer sequence (5'→3') | Digestion sitesa |
| rpfG Nde I | GATTACCATATGGGTTTTCTTTCCGGTAAGCGC | Nde I |
| rpfG Hind Ⅲ | CTGACTAAGCTTATTTCAGTTCGAGTTCGTTC | Hind III |
| rpfG up for | AGCAGAATTCTGCCGATCGATCTTCAGAAC | EcoR I |
| rpfG up rev | GCTGTCTAGAGGATCCATATGATGTCCCCAATACTG | |
| rpfG dn for | ACATCATATGGATCCTCTAGACAGCCTTTGCTCGACAG | |
| rpfG dn rev | GTTGAAGCTTCAGTTCGGGAAGCGTGTAG | Hind III |
| pK18-R | ACGGACGGCCAGGCGAT | |
| pK18-F | GACCGTAGGCCGCGTCA | |
| pSRK-R | GCCATGAAGATCTCGACTG | |
| pSRK-F | CTCAAGGGCATCGATCTGT | |
| Underlined parts are restriction sites. | ||
表选项
1.1.4 主要仪器: 超净工作台SW-CJ-2G (苏州净化设备有限公司)，恒温培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)，立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-75KBS (上海申安医疗器械厂)，双光束紫外-可见分光光度计UV-6100S (上海美谱达)，恒温振荡式摇床ZQTY-50NS (上海知楚)。
1.2 核桃细菌性黑斑病菌中rpfG基因的克隆 以黄单胞菌科的两种细菌水稻白叶枯病菌XooPXO99A和野油菜黄单胞菌Xcc8004的基因组为参照序列，通过NCBI网站上的核酸序列比对功能(BLASTn)，在核桃细菌性黑斑病菌XajDW3F3基因组中寻找是否存在rpfG的同源基因，在获得基因序列后，根据其核酸序列，设计合适引物，进行后续的PCR克隆和定向基因敲除。利用生物信息学软件DNA Star中MegAlign的功能对rpfG基因编码的蛋白RpfG进行同源比对分析，并进一步比较3种细菌中rpf基因簇的异同。
1.3 rpfG基因缺失突变株及回补株的构建
1.3.1 缺失突变体的构建: 本研究采用同源双交换的方法构建了rpfG基因的缺失突变体。以XajDW3F3总DNA为模板，PCR扩增目标基因上下游DNA片段，再采用搭桥PCR将上下游片段融合，限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切后连接到自杀性载体pKl8mobsacB上，筛选重组质粒，将用于基因敲除的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞S17-1中，通过三亲本接合将敲除质粒导入野生型XajDW3F3中。用含有Cef、Km的YPG平板筛选发生同源单交换的一次重组子，同时进行PCR验证。挑取验证正确的一次重组子于28 ℃、180 r/min摇床振荡传代培养，将菌液稀释涂布于含Cef的YPGS平板上，长出的单克隆经PCR验证，筛选出发生双交换的菌株，获得缺失突变体ΔrpfG。
1.3.2 回补菌株的构建: 以XajDW3F3总DNA为模板，PCR扩增目标基因rpfG的完整DNA片段，限制性内切酶Nde I和Hind III酶切后连接到广宿主表达载体pSRK上构建重组质粒，通过三亲本接合将重组质粒导入缺失突变体ΔrpfG中，用含有Cef、Gm抗性的YPG平板筛选接合子，PCR验证正确即为回补菌株ΔrpfG/rpfG。
1.4 生物被膜形成能力检测 用结晶紫染色法检测rpfG缺失后对Xaj生物被膜形成的影响。分别接种XajDW3F3、ΔrpfG、ΔrpfG/rpfG于5 mL YPG液体培养基中，28 ℃振荡培养至对数期，分别稀释至OD600为1.0左右，各取5 mL培养物离心收集菌体，用1 mL YPG培养基重悬菌体，接种至装有4 mL YPG培养基的玻璃指形管中，加入相应抗生素和IPTG，置于28 ℃培养箱中静置培养5 d后，倒掉培养液，无菌水洗管壁3次，烘干加入6 mL 1%的结晶紫染色30 min。倒掉染色液，用无菌水冲洗管壁，烘干指形管，观察管壁上是否有一圈紫色物质，拍照记录；用1 mL无水乙醇溶解管壁结晶紫，测定630 nm处吸收值并记录，试验设置3个重复。
1.5 胞外多糖(EPS) 形成能力检测 利用液体摇瓶发酵法测定各菌株产生EPS的量。分别接种XajDW3F3、ΔrpfG、ΔrpfG/rpfG于YPG液体培养基中，28 ℃振荡培养至平台期，再分别稀释至OD600为1.0左右，按1%–2% (V/V)的量转接至50 mL新鲜YPG液体培养基中，加入相应抗生素和IPTG，28 ℃振荡培养5 d后，向培养液中注入4倍体积的无水乙醇，边注入边搅拌，然后挑出絮状沉淀物，置于55 ℃烘箱中烘干，称重，记录，并计算培养物形成EPS的量(g/L)，试验设置3个重复。
1.6 胞外酶分泌能力的检测 本研究采用平板检测法分别检测了各菌株分泌胞外蛋白酶、胞外淀粉酶及胞外纤维素酶的能力。
1.6.1 胞外蛋白酶: 将过夜培养的待测菌株培养物稀释并调OD600至1.0后，用移液器分别吸取2 μL菌液接种于含1%的脱脂牛奶、相应抗生素和IPTG的YPG平板上，静置10 min。28 ℃培养2 d，通过比较菌落周围水解透明圈的有无或大小判断菌株产胞外蛋白酶的活性，试验设置3个重复。
1.6.2 胞外淀粉酶: 将过夜培养的待测菌株培养物稀释并调OD600至1.0后，用移液器吸取2 μL菌液接种于含0.1%可溶性淀粉、相应抗生素和IPTG的YPG平板上，静置10 min，28 ℃培养2 d后，用体积比为1:100的I2/KI (0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI)溶液染色10 min，然后用70%的酒精洗平板，能产生胞外淀粉酶的菌株，其菌落生长处及周围可形成无色透明圈，观察并测量透明圈的大小，试验设置3个重复。
1.6.3 胞外纤维素酶: 将过夜培养的待测菌株培养物稀释并调OD600至1.0后，用移液器吸取2 μL菌液接种于含有0.5% (W/V)的羧甲基纤维素、相应抗生素和IPTG的YPG平板上，静置10 min。28 ℃培养2 d后，在平板上加入约20 mL 0.1% (W/V)的刚果红(Congo Red)染色30 min，水洗2次，再用20 mL 1 mol/L的NaCl脱色2次，每次约20 min，能产生纤维素酶的菌株，其菌落生长处及周围形成一透明圈，观察并测量透明圈的大小，试验设置3个重复。
1.7 运动性检测 将过夜培养的待测菌株培养物稀释并调OD600至1.0后，用微量移液枪吸取2 μL菌液点接于含有0.5%琼脂糖的半固体培养基平板上(平板使用前在超净台晾5–10 min)，正置于超净台中待晾干，再置于28 ℃正置培养2 d，观察菌苔的扩散情况并测量菌苔直径，进行统计分析，试验设置3个重复。
1.8 菌株的抗逆性分析
1.8.1 耐盐实验: 制备含NaCl浓度分别为0.01、1.5、2.0、2.5 g/mL的YPG固体平板，将培养好的各菌株培养液调至OD600一致，约为1.0，此时菌液浓度约为1×108 CFU/mL，用新鲜的YPG液体培养基将待测菌液进行梯度稀释，稀释倍数依次为100(原液)、10–1、10–2、10–3；分别吸取2.5 μL各稀释梯度的菌液依次滴于上述准备好的平板上，待晾干后，平板置于28 ℃培养2 d，观察菌株生长情况，试验重复3次。
1.8.2 耐酸实验: 用HCl调节YPG培养基的pH值，使其pH值分别为5.0、5.5、6.0、7.0，再向培养基中添加1.5% (W/V)的琼脂，制备成固体培养基。菌液处理方法同耐盐实验，将不同菌株培养液点接于不同pH梯度的固体平板上，检测各菌株对酸的耐受情况。
1.8.3 耐SDS实验: 向YPG中加入灭菌的5% SDS，使培养基中所含SDS浓度分别为0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL，制成相应平板，其他步骤同上。
1.8.4 耐硫酸铜实验: 向YPG中加入灭菌的100 mg/mL GuSO4溶液，使培养基中所含GuSO4浓度分别为80、100、120、140 μg/mL，制成相应平板，其他步骤同上述。
1.9 数据处理方法 采用Excel 2010进行数据处理，并采用t检验进行显著性分析。P < 0.05 (*)，有统计学差异；P < 0.01 (**)，差异显著；P < 0.001 (***)，差异极其显著；P > 0.05差异不显著(NS)。
2 结果和分析 2.1 rpfG的生物信息学分析 通过序列同源比对，在XajDW3F3的基因组中发现了与Xcc8004、XooPXO99A中rpfG同源的基因，我们将其命名为XajrpfG。研究进一步对野油菜黄单胞菌(Xcc)、水稻白叶枯病菌(Xoo)以及树生黄单胞菌核桃致病变种(Xaj) 3种黄单胞菌rpf基因簇进行了比对，rpfG基因在基因组上的位置及其编码的蛋白结构域组成如图 2所示。在XajDW3F3中rpfG与rpfC相邻，且转录方向相同，rpfG基因全长为1148 bp，其编码产物是一个双组分系统响应调控蛋白，由REC和HD-GYP两个结构域组成。REC为磷酸信号识别受体，HD-GYP具有磷酸二酯酶活性。通过对三者rpf基因簇比对分析发现，Xaj的rpf基因簇排布与Xoo完全一致，与Xcc基本一致，Xcc多了一个rpfH基因。通过MegAlign软件对rpfG基因编码的RpfG蛋白同源性进行分析，比对结果显示XajRpfG与XccRpfG蛋白序列相似性为95.9%，XajRpfG与XooRpfG蛋白序列相似性为95.6%。
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| 图 2 rpfG生物信息学分析 Figure 2 Bioinfonnatics analysis of the predicted gene rpfG. |
| 图选项 |
2.2 rpfG基因缺失突变株与回补菌株的构建 本研究构建了rpfG基因缺失突变体。用对应的外部基因敲除引物P1和P4对ΔrpfG和野生型XajDW3F3进行PCR验证，PCR电泳结构显示突变体ΔrpfG扩增出的条带为小于1 kb，而DW3F3扩增条带在2 kb左右，与理论值一致(图 3-A)，表明成功获得rpfG基因的缺失菌株。将克隆得到的rpfG-pSRK重组质粒通过三亲本接合导入到已获得的缺失突变体中，进行PCR验证，电泳结果显示扩增条带正确，即为成功得到回补菌株ΔrpfG/rpfG (图 3-B)。
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| 图 3 rpfG的缺失突变株和回补株的PCR验证电泳图 Figure 3 PCR analysis of the deleted mutation and complementary strains of rpfG. A: Construction and characterization of rpfG mutant strains. The maps of the rpfG deletion mutant and the map of the wild-type allele (on the left) and PCR confirmation for ΔrpfG (on the right). lane 1–4: the PCR product from colony to screen ΔrpfG; lane 5: the PCR product from wild-type strain; M: DL2000 DNA marker. B: PCR confirmation for ΔrpfG/rpfG. lane 1–3: the PCR product from colony to screen ΔrpfG/rpfG; lane 4: rpfG-pSRK plasmid as control. |
| 图选项 |
2.3 rpfG突变对生物被膜形成、胞外多糖产生及絮凝能力的影响 生物被膜(biofilm，BF)是细菌通过胞外基质(多糖、蛋白质、脂肪和核酸等)聚集附着于生物或非生物表面、结构复杂的群落[10]。细菌生物被膜是一个重要的致病因子，在人植物-病原物互作中具有毒性作用[11]。与之相似，胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是植物病原菌产生的与病程密切相关的一类重要致病因子，且胞外多糖是生物被膜的主要组成成分。因此，为了研究rpfG基因是否影响细菌相关毒力因子的分泌，本研究检测了突变体生物被膜形成能力、絮凝能力以及胞外多糖产量。结果显示，突变体ΔrpfG生物被膜形成能力显著降低(P < 0.001)，仅为野生型的44.58% (图 4-A)；胞外多糖产量也由野生型的8.47 mg/mL降为5.23 mg/mL (图 4-B)，表明rpfG基因正调控生物被膜的形成和胞外多糖的产生；而回补株ΔrpfG/rpfG的生物被膜形成量及胞外多糖产量虽有增加，但不能恢复到野生型水平。除此以外，对菌株絮凝情况检测结果显示，野生型在培养基中不形成絮凝，而突变株ΔrpfG出现明显絮凝现象，上层菌液较澄清，底部形成大量絮凝物，表明rpfG基因缺失导致菌株形成絮凝；回补株上层菌液浑浊，底部有少量絮凝物，未能完全恢复至野生型菌液表型(图 4-C)。
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| 图 4 菌株的生物被膜形成、胞外多糖产生、絮凝能力检测 Figure 4 Biofilm, extracellular polysaccharide and flocculation tests of strains. A: Biofilm formation on the surface of finger tube; B: the histogram of biofilm yield; C: comparison of dry weight extracellular polysaccharide; D: flocculation test. Different numbers of star (*) above the bars indicate a significant difference. *: P < 0.05;**: P < 0.01; ***: P < 0.001; t-test. |
| 图选项 |
2.4 rpfG突变对细菌分泌胞外酶的影响 尽管植物的细胞壁是病原菌侵入的主要障碍，但病原菌通过分泌一系列降解表皮角质层和细胞壁的酶，顺利地侵入植物，因此胞外酶的分泌间接反映了病原菌的致病潜力。与致病有关的降解酶包括胞外蛋白酶(extracellular protease)、胞外淀粉酶(extracellular amylase)、胞外纤维素酶(extracellular cellulase)、胞外角质酶(extracellular cutinase)和胞外果胶酶(extracellular pectinase)等。本研究对菌株所产胞外纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的活性进行了检测，结果见图 5。与野生型相比，突变株ΔrpfG分泌纤维素酶所形成的降解圈极显著变小(P < 0.001)，圈直径大小为野生型的52.94%左右，说明rpfG突变后菌株分泌纤维素酶的能力下降，回补株ΔrpfG/rpfG的分泌能力有所升高，是突变株的1.38倍，但未能完全恢复到野生型水平；分泌淀粉酶形成的降解圈显著变大(P < 0.01)，圈直径大小为野生型的123.29%左右，说明分泌淀粉酶的能力提高，而回补株的分泌能力也未能完全恢复至野生型水平；突变株ΔrpfG分泌蛋白酶形成的降解圈与野生型相比，无显著差异(P > 0.05)，说明分泌蛋白酶能力没有变化。这些结果表明rpfG基因正调控XajDW3F3纤维素酶分泌，负调控淀粉酶分泌，对蛋白酶的分泌没有影响。
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| 图 5 菌株胞外酶产生能力检测 Figure 5 Detection of extracellular enzyme produced by stains. A: The test plates of extracellular enzyme. 1: WT; 2: ΔrpfG; 3: ΔrpfG/rpfG. B: the histogram of enzyme yield. Different numbers of star (*) above the bars indicate a significant difference. ns: not significant; *: P < 0.05;**: P < 0.01; ***: P < 0.001; t-test. |
| 图选项 |
2.5 rpfG突变对细菌运动性的影响 通过图 6-A的运动性平板可观察到，与野生型菌株相比，突变株ΔrpfG菌落边缘向外扩散得更明显，运动性菌苔直径比野生型增加了12.38%，说明此时菌株运动性增强；而回补株ΔrpfG/rpfG的菌苔直径显著减小(P < 0.001)，比野生型减小32.75%，表明rpfG基因对Xaj的运动性有抑制作用，负调控菌株运动性。
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| 图 6 菌株运动性检测 Figure 6 Motility test of strains. A: Colonial morphology on swarming plate. 1: WT; 2: ΔrpfG; 3: ΔrpfG/rpfG. B: Colony diameter on swarming plate. Different numbers of star (*) above the bars indicate a significant difference. **: P < 0.01; ***: P < 0.001;t-test. |
| 图选项 |
2.6 rpfG突变对菌株抗逆性的影响 病原菌对逆境的耐受能力是间接反映其毒力强弱的一项指标，为了研究rpfG在细菌抗逆性方面的功能，分别检测了rpfG基因突变后，Xaj对渗透压(NaCl)、SDS、酸的耐受性。由于目前国内外采用外源喷洒含铜化学农药对该细菌侵染植物形成的黑斑病进行防治，因此Xaj对铜离子的敏感性分析是十分必要的。研究结果如图 7所示，rpfG基因缺失突变后使Xaj在各种逆境条件下的生长均呈现减弱趋势。高渗透压时ΔrpfG生长微弱(图 7-A)；Xaj对SDS的敏感性较高，当SDS浓度从0.02%增到0.03%时，野生型菌株的生长已开始变弱，随着稀释倍数的增加，ΔrpfG的生长变得极其微弱(图 7-B)；在pH值低于5.5的酸性条件下，ΔrpfG几乎不能生长(图 7-C)；当Cu2+浓度达到120 μg/mL时，ΔrpfG则表现出对Cu2+的不耐受，随着菌液浓度不断被稀释，菌株生长逐渐减弱(图 7-D)；而回补株ΔrpfG/rpfG在各种逆境条件下的生长情况与野生型相比仍然较弱。以上现象均表明rpfG基因赋予了Xaj一定的抗逆能力。
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| 图 7 菌株抗逆性检测 Figure 7 Detection of strains stress resistance. A: Comparison of colony growth on different concentration gradient NaCl plates; B: comparison of colony growth on different concentration gradient SDS plates; C: comparison of colony growth on different pH plates; D: comparison of colony growth on different concentration gradient CuSO4 plates. The concentration of bacterial culture suspension of 100 is 1×108 CFU/mL; 10–1, 10–2, 10–3 represents dilution ratio. |
| 图选项 |
3 讨论 在本研究中，通过同源比对分析，在核桃细菌性黑斑病菌XajDW3F3中发现了野油菜黄单胞菌Xcc的rpfG基因的同系物，并完成了对该基因的敲除及突变株相关生理生化性状检测。结果显示，rpfG基因的缺失影响Xaj的毒力因子，包括使菌株的生物被膜形成能力减弱，胞外多糖产量降低，出现明显絮凝现象，运动性增强，对逆境的抵抗力减弱。另外rpfG基因突变之后，细菌分泌的胞外酶也发生不同程度的变化。rpfG基因可以调控核桃致病菌Xaj的多种重要的致病因子，而调控机理还有待深入研究，可能与rpfG基因影响病原物体内群体感应信号分子的合成有关。
rpfG基因的缺失导致Xaj生物被膜形成能力、胞外多糖产量、纤维素酶分泌能力均显著降低，表明rpfG基因正调控这些毒力相关基因的表达，然而在研究中发现，尽管基因回补株的各项生理指标均有所升高，但不能回复到野生型水平，推测产生这一现象的原因可能与rpfG的表达水平有关。因为pSRK为高表达载体，其上携带的外源基因rpfG在诱导剂IPTG的作用下发生过量表达(超出基因组本底表达水平)，从而引起细菌体内代谢紊乱，这种代谢紊乱可能与c-di-GMP浓度有关，由于c-di-GMP在细胞内的分布不均匀，过量表达可能打破了局部c-di-GMP浓度环境从而引起整个细胞内c-di-GMP浓度的变化，从而影响c-di-GMP下游相关毒力基因的表达，因此即便回补株中有rpfG基因的存在，但仍不能保持与野生型一致的表型。为了验证此观点，课题组通过RT-qPCR检测了野生型XajDW3F3及回补株ΔrpfG/rpfG中rpfG基因的表达情况，结果显示质粒载体携带的rpfG基因的表达量比野生型染色体上rpfG基因表达量高出9倍之多(结果未列)，这一现象同时表明rpfG在细菌体内的表达需要维持一定水平，过高或过低都将改变细胞本身正常的代谢过程。在检测rpfG基因对胞外酶分泌的影响实验中，结果显示rpfG基因既有促进分泌的作用，又能抑制某些酶的分泌，说明细菌分泌的不同类型胞外酶的活性不同，受rpfG调控的方式也并非一致。曾有文献报道将Xcc的rpfC或rpfG敲除后胞外酶的产量将降低，检测的是果胶酶、葡聚糖酶，与本研究的检测对象不同[12]。
目前许多病原菌中rpfG基因的生物学功能研究比较清楚，尽管在细菌中rpfG基因编码序列具有高度保守性，但不同病原菌的rpfG功能又有所区别。在稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) XocRs105中，rpfG的缺失导致胞外多糖产量和致病力下降，生物被膜形成能力增加，但不影响游动性和胞外蛋白酶活性[9, 13]。在水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) XooKA- CC11313中，rpfG的缺失导致木聚糖酶活性、胞外多糖、游动性及致病力降低[14]。在野油菜黄单胞菌(X. campestris pv. campestri) Xcc8004中，rpfG缺失导致胞外酶活性、生物被膜形成能力、游动性下降[12, 15]，胞外多糖产量下降[12]，同时会降低菌株对寄主植物的致病性[16]。病原菌通过T3SS与寄主或非寄主植物进行互作，hrp基因是T3SS的重要组成部分，rpfG参与群体感应信号分子的合成，对下游基因以及III型分泌系统中的某些基因都具有调控作用。在水稻白叶枯病菌PXO99A中，通过Min系统负调控hrp基因，其中rpfG参与了对hrpG的负调控过程[17]。已知在稻黄单胞菌中，rpfG的缺失引起菌株体内hrp调节子的表达发生改变，并证明rpfG负调控T3SS编码基因的表达，且rpfG的缺失将减弱Xoc对水稻的致病性[18-19]，例如在XocRs105中，RpfG负调控hrpG、hrpX及hrpA的表达[13]。但在不同细菌中，RpfG调控着hrp基因簇中的不同基因。在番茄-辣椒疮痂病菌(Xanthomonas capestris pv. vesicatoria，Xcv)中，RpfG调控hrpA-hrpF及hrpX表达[20]；而在Xcc中RpfG仅调控hrpX表达[21]。另外，从已搜集的相关文献看，rpfG的缺失突变将导致细菌DSF的合成降低[22-24]，这一结论为我们后续对该细菌体内群体感应信号产量的检测提供了一定参考价值。综上，rpfG的功能在不同种属的细菌间不尽相同，RpfG对细菌毒力的调控机制也并非完全一致。为了深入了解rpfG基因如何影响细菌群体感应系统及细菌毒力因子，对T3SS系统相关调控蛋白的合成过程进行研究可作为一种思路，如HrpG为T3SS的主调节器，与其相互作用的蛋白发生磷酸化将减弱HrpG的水解作用，从而抑制T3SS毒力基因表达，降低细菌毒力，而rpfG又被HrpG负调控[25-26]。另外，RpfG的磷酸二酯酶(PEG) 活性的检测也是十分必要的，酶活性高低与胞内c-di-GMP含量密切相关，而胞内c-di-GMP水平又直接影响群体感应信号分子的感知、传导。本研究结果将丰富rpfG的功能多样性，为进一步阐明核桃细菌性黑斑病菌的致病机理奠定基础，为核桃黑斑病的防治提供了新的思路。
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