邹淑华, 邓平香, 龙新宪
华南农业大学资源环境学院, 广东 广州 510642
收稿日期：2019-01-22；修回日期：2019-05-20；网络出版日期：2019-07-12
基金项目：国家自然科学基金（41471264）
*通信作者：龙新宪, Tel/Fax:+86-20-85280296, E-mail:longxx@scau.edu.cn.
摘要：重金属胁迫对植物内生细菌群落结构的影响在很大程度上是未知的，目前也很少有研究超积累植物内生细菌的群落结构与多样性对根际土壤中重金属的响应。[目的] 探索在不同镉污染水平下，超积累（HE）和非超积累生态型（NHE）东南景天的根系、茎和叶片中内生细菌的群落结构与多样性的变化及其差异性，试图从植物-内生菌之间的相互关系的角度补充解释2种生态型东南景天对有效态镉忍耐和积累能力的差异。[方法] 采用Illumina新一代测序方法分析了在不同Cd2+浓度土壤上生长的2种生态型东南景天根、茎和叶中的内生细菌群落结构。[结果] 高浓度Cd2+抑制NHE东南景天的生长，内生细菌的丰富度和多样性也降低；然而，高浓度Cd2+促进HE东南景天的生长，茎和根系内生细菌的丰富度增加。在3种土壤上，2种生态型东南景天叶片、茎和根系内生细菌均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）占优势。随着土壤中Cd2+浓度的增加，HE东南景天叶片中Gammaproteobacteria纲、Negativicutes纲和Clostridia纲的相对丰度显著增加，茎中Alphaproteobacteria纲的相对丰度显著增加，Clostridia纲的相对丰度显著减少；NHE东南景天叶片中Alphaproteobacteria纲、Gammaproteobacteria纲和Clostridia纲的相对丰度没有显著变化，茎中Negativicutes纲的相对丰度显著减少，根系中Betaproteobacteria纲和Clostridia纲的相对丰度显著减少，Negativicutes纲却显著增加。在高Cd2+污染土壤（50 mg/kg）上，HE东南景天叶片中Sphingomonas属和茎中Veillonella属的相对丰度均大于NHE，且HE东南景天根系内生细菌的第一、第二、第三优势菌Veillonella、Sphingomonas、Prevotella属细菌均没有出现在NHE东南景天根系。[结论] 土壤Cd2+污染水平对2种生态型东南景天叶、茎、根中的内生菌群落结构有显著影响。
关键词：东南景天内生细菌有效态镉
Impacts of cadmium on the diversity of endophytic bacteria associated with hyperaccumulating and non-hyperaccumulating ecotypes of Sedum alfredii
Shuhua Zou, Pingxiang Deng, Xinxian Long
College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong Province, China
Received: 22 January 2019; Revised: 20 May 2019; Published online: 12 July 2019
*Corresponding author: Xinxian Long, Tel/Fax: +86-20-85280296; E-mail:longxx@scau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (41471264)
Abstract: The effects of heavy metal stress on the community structure of endophytic bacteria in plants are not well understood. To date, few studies have investigated the response of community structure and diversity of endophytic bacteria in hyperaccumulating plants to heavy metals present in soil rhizosphere. [Objective] The objectives of this study were to explore the changes and differences in community structure and diversity of endophytic bacteria in roots, stems, and leaves of hyperaccumulating (HE) and non-hyperaccumulating (NHE) ecotypes of Sedum alfredii under different levels of Cd2+ contamination; as well as to explain their differences in ability to tolerate and accumulate the available cadmium by the two ecotypes of Sedum alfredii, based on the mutual relationship between plant and endophyte. [Methods] The community structures of endophytic bacteria in the roots, stems, and leaves of the two ecotypes of Sedum alfredii grown on soils with different Cd2+ concentrations were analyzed by Illumina high-throughput sequencing technique. [Results] High concentrations of Cd2+ inhibited the growth of NHE Sedum alfredii and decreased the richness and diversity of endophytic bacteria, whereas it promoted the growth of HE Sedum alfredii and increased the richness of endophytic bacteria in stems and roots. Among the three tested soils, the endophytic bacteria in leaves, stems, and roots of two ecotypes of Sedum alfredii were all dominated by Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria. For HE Sedum alfredii, the relative abundances of Gammaproteobacteria, Negativicutes, and Clostridia in leaves as well as Alphaproteobacteria in stems increased significantly with the soil Cd2+ concentration, whereas the relative abundances of Clostridia decreased significantly. For NHE Sedum alfredii, with the increase in soil Cd2+ concentration, the relative abundances for Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, and Clostridia in leaves did not show significant change, while those for Negativicutes in stems as well as Betaproteobacteria and Clostridia in roots decreased significantly, and those for Negativicutes in roots increased significantly. In highly Cd2+-contaminated soils (50 mg/kg), the relative abundances of Sphingomonas in leaves and Veillonella in stems of HE Sedum alfredii were higher than those for NHE Sedum alfredii. Meanwhile, the first, second, and third predominant endophytic bacteria (i.e., Veillonella, Sphingomonas, and Prevotella) that were present in the roots of HE Sedum alfredii did not appear in roots of NHE Sedum alfredii. [Conclusion] The Cd2+-contamination level in soils had significant impacts on the community structure of endophytic bacteria in leaves, stems, and roots of the two ecotypes of Sedum alfredii.
Keywords: Sedum alfrediiendophytic bacteriaavailable cadmium
东南景天(Sedum alfredii)是一种多年生草本植物，广泛分布于中国长江中下游地区。在水培条件下，浙江省衢州市古老铅锌矿区的东南景天地上部的镉(Cd)和锌(Zn)含量高达9000 μg/g和29000 μg/g，且植物生长旺盛，没有出现任何金属毒性症状，也被称为超积累生态型东南景天[1-2]。研究证明，超积累生态型东南景天对Zn、Cd的抗性和积累能力显著大于来自浙江杭州茶园的东南景天(非超积累生态型)[3-4]。目前，超积累生态型东南景天已被我国****广泛应用于锌、镉污染农田土壤的修复[5-7]。重金属常以阳离子和络合离子形态存在于土壤溶液中，这两种形态的重金属易于植物吸收利用，同时也是重金属对植物产生毒害作用的主要形态，即重金属的有效态。为了提高东南景天吸收重金属的效率，研究者尝试采用各种方法来促进东南景天的生长和(或)提高根际土壤重金属活性，主要包括施加氮肥和磷肥[8-10]、添加有机酸或螯合剂[5-6]和猪粪堆肥[11]，接种根际或内生细菌[12-14]等。
内生细菌是一类生长在植物组织内部的细菌，在植物生长、发育、适应生物与非生物胁迫等方面发挥着重要作用[15-16]。近20年来，超积累植物的内生细菌受到了研究者的高度关注[13, 17-25]。内生细菌可通过以下几种方式促进植物生长和吸收积累金属：(1)改善植物氮、磷、铁营养(如固氮作用、溶磷作用、分泌铁载体)；(2)分泌植物激素(植物生长素、细胞分裂素、赤霉素等)或1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACCase)减少植物中乙烯的产生，调节植物体内激素水平；(3)通过胞外沉淀、胞内积累和隔离，将毒性金属离子生物转化成较少或无毒形式等方式来减轻金属对植物的毒害；(4)通过分泌H+、有机酸、铁载体和生物表面活性剂等增加土壤金属中有效性[26-28]。但是，目前这方面的研究还局限于实验室研究。因此，深入了解土壤环境对超积累植物内生细菌的群落结构和多样性的影响，是利用内生细菌强化植物修复的前提条件。
内生细菌的群落结构和多样性主要取决于各种生物(如细菌种类、宿主植物基因型、生态型和发育阶段等)和非生物(温度、湿度、土壤营养水平和污染状况)因素[16, 29]。Ding等(2013)报道，宿主植物的种类、采样日期和地点对叶片内生细菌的群落结构均有影响，其中宿主植物种类的影响最大，其次是采样日期和采样地点[30]。Bodenhausen等(2013)发现，虽然拟南芥叶片和根系内生细菌的丰富度、多样性和均匀度没有差异，但是二者的内生细菌群落组成差异显著(P=0.001)[31]。Chen等(2014)分析了某铅锌矿土壤上生长的超积累植物龙葵(Solanum nigrum L.)和商路(Radix phytolaccae)的茎中内生细菌群落结构和多样性，发现内生细菌的群落结构受土壤重金属污染水平和植物种类的影响[32]。
目前，基于16S rRNA的高通量测序方法可以更快速、更准确地分析环境微生物的群落结构和多样性[33-34]。这种技术也被研究者应用于拟南芥[35]、马铃薯[36]、莴苣[37]、水稻[38]、番茄[39]和甜菜[40]等植物的内生细菌的研究。然而，很少有高通量测序方法研究超积累植物的内生细菌群落结构的文献报道。我们推测，当超积累和非超积累生态型东南景天生长在Cd2+污染土壤上时，由于二者对Cd2+的耐受性和积累能力差异显著，势必影响植物体内的生理代谢过程，从而使其内生细菌的群落结构也发生改变。反过来，内生细菌将与宿主植物协同作用，可能参与东南景天对Cd2+的吸收、积累和解毒等代谢过程。因此，本研究高通量测序技术评估土壤Cd2+污染水平对超积累和非超积累生态型东南景天的叶片、茎和根的细菌群落结构和多样性的影响，为今后开发内生细菌强化东南景天修复Cd2+污染土壤提供技术参考。
1 材料和方法 1.1 供试植物和土壤 超积累和非超积累生态型东南景天的幼苗分别采集于浙江衢州的古老铅锌矿(118°01'–119°20'E，28°14'–29°30'N)和浙江杭州九溪公园的茶园地(120°09'42“E，30°15'12”N)。供试土壤采自华南农业大学试验站，土壤理化性质如下：pH 5.18 (土:水=1:2.5)，有机质44.92 g/kg，全氮3.06 g/kg，全磷3.09 g/kg，全钾15.45 g/kg，土壤全Cd含量0.68 mg/kg，有效Cd含量0.14 mg/kg。土壤自然风干，过5 mm筛，外源添加CdCl2，使土壤Cd2+添加水平为0、5、50 mg/kg (分别标记为Cd0、Cd5、Cd50)，加入去离子水至最大田间持水量的60%，室温条件下平衡2周后开始盆栽实验。
1.2 盆栽实验 土壤平衡2周后，再次风干，105 ℃高压灭菌1 h，连续3次。每盆装300 g灭菌土壤，每个处理装3盆，每盆移栽4株长势均匀的超积累或非超积累生态型东南景天幼苗。植物在华南农业大学温室培养2个月(2017年2–4月)。植物生长期间，根据植物的生长需要补充灭菌的去离子水。
植物生长60 d后收获，记录株高。植物样品先用自来水洗涤，然后用去离子水漂洗3次，将根、茎和叶分开，记录鲜重。然后将每一盆的叶片、茎和根系样品分为2份。其中一份样品立刻进行表面消毒处理，即分别称量1.0 g叶、1.0 g茎和0.5 g根，依次浸入95%乙醇1 min、30%过氧化氢30 min和3%次氯酸钠30 min，95%乙醇1 min，最后用灭菌的去离子水洗涤3次。为了确保表面消毒过程是成功的，将消毒后的根、茎和叶样品以及最后1次冲洗的去离子水分别涂布在Luria-Bertani’s (LB)琼脂平板上培养7 d，均没有出现细菌的生长。表面消毒处理后的植物样品迅速用液氮冷冻、研磨，保存在–80 ℃冰箱，用于后续DNA提取。将剩余的叶、茎和根样品装入干净的信封，105 ℃下杀青30 min，65 ℃下烘干至恒重，记录每个样品的干重。
1.3 植物和土壤样品的化学分析 将烘干植物样品研磨过0. 4 mm筛，保存在干燥器中，用于Cd2+含量的测定。即准确称取烘干后的植物粉末0.1000 g于50 mL的三角瓶中，加入混合酸(硝酸+高氯酸，比例4:1) 10 mL，加盖过夜，第二天电热板加热，加上漏斗，调温至320 ℃，煮至三角瓶内剩余不到1 mL溶液(呈澄清或者淡黄色)，冷却。用双蒸水冲洗至25 mL比色管中，定容，原子吸收光谱(Z-2000)测定Cd2+含量。
收获植物后，从每盆采集约100 g土壤，自然风干，过2 mm筛，测定土壤pH和有效Cd含量。土壤pH测定采用玻璃电极法，即称取10.00 g土壤样品于50 mL三角瓶中，按水土比例2.5:1加入25.0 mL上述去离子水，用磁力搅拌器搅拌1 min，静置30 min，用矫正过的pH计测定悬液的pH。土壤有效态Cd含量的测定采用CaCl2浸提-原子吸收分光光度法，即称取过20目筛的风干土5.00 g放入100 mL离心管中，加入25 mL 0.1 mol/L CaCl2浸提液，在200 r/min恒温52 ℃振荡24 h后，4000 r/min离心5 min，过滤，原子吸收光谱测定上清液中Cd2+浓度。
1.4 DNA提取和测序分析 采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取2种生态型东南景天叶片、茎、根系DNA，提取后将同一个处理的3个平行样品的DNA混匀。具体操作方法如下：将0.10 g样品放于液氮预冷的研钵中，加液氮，快速研磨植物样品成粉末状，将粉末收集于2 mL的离心管中，加入0.9 mL CTAB提取液[100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl、2% (W/V) CTAB]，漩涡振荡均匀，65 ℃水浴20–30 min。然后，加入0.9 mL氯仿异戊醇，上下翻转均匀，12000 r/min离心8 min，将510 μL上清液转至1.5 mL离心管中，加入340 μL异丙醇，上下翻转均匀(直到出现白色沉淀)，12000 r/min离心8 min，弃掉上清液。接着用0.7 mL 70%的乙醇清洗沉淀2次，12000 r/min离心2 min，小心地弃掉上清液，于通风橱中使乙醇挥发干净，加入50 μL TE缓冲，将DNA样品保存于–20 ℃冰箱中[41]。
采用引物341F (5′-GACGACGSRGGGCATCC-3′)和806R (5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)扩增细菌16S rRNA基因的V3+V4区域，扩增的DNA片段约610 bp。40 μL的PCR反应体系包括：2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix 20 μL，Forward Primer (5 μmol/L) 1 μL，Reverse Primer (5 μmol/L) 1 μL，Template DNA 10 ng，补充灭菌的去离子水至40 μL。热循环条件为：95 ℃ 3 min；98 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，94 ℃ 20 s，65 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共24个循环，然后94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共16个循环，最后在72 ℃延伸150 s。在2%琼脂糖凝胶中分离PCR产物来分离细菌产物，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒切割并提取合适大小的条带(约610 bp)，测序工作由上海锐翌生物科技有限公司完成。
1.5 数据处理与分析 通过Pandaseq软件利用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads拼接成1条序列，得到高变区的长Reads。然后使用内部撰写的程序对拼接后的Reads进行如下处理，获取Clean Reads：(1)去除平均质量低于20的Reads；(2)去除Reads含N的碱基数超过3个的Reads；(3) Reads的长度范围为220–500 nt，统计Clean Reads的长度分布和数量。使用Qiime软件对序列进行随机抽样，以抽到的有效序列数进行OTU的分析。将拼接的长的Reads中的Singletons (对应的Reads只有1条的序列)过滤掉，利用Usearch在0.97的相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分析的OTU，并分别计算ACE、Chao1、Shannon多样性、Simpson多样性。利用PDP方法将代表序列与已知物种的数据库进行比对，对每个OTU进行物种归类。在门、纲、目、科、属水平，将OTU综合分类表中的信息进行分类，分别统计各样品在不同分类水平上的菌群组成及丰度。
使用CANODRAW for windows 4.5分析土壤Cd2+浓度和植物生态型对内生细菌群落结构的影响，采用冗余分析(RDA)方法分析土壤有效态Cd2+浓度、植物生物量以及叶片、茎和根系Cd2+含量与内生细菌群落之间的关系。
2 结果和分析 2.1 东南景天根系、茎和叶片的生物量和Cd2+含量 Cd离子对超积累生态型(HE)东南景天地上部分的生长有明显的促进作用。例如，其生长在Cd5土壤上时，叶片和茎的干物质量分别比Cd0处理增加了1.5倍和1.8倍；生长在Cd50土壤时，叶片和茎的干物质量分别比Cd0处理增加了1.4倍和2.0倍(图 1-A)。生长在Cd5土壤上的非超积累生态型(NHE)东南景天的叶片和茎的干物质量分别也比Cd0处理增加了49%和65%，但当生长在Cd50土壤上，其叶片干物质量比Cd0处理减少27%，茎和根系的生物量也低于Cd5处理，但与Cd0处理之间没有显著差异(图 1-B)。
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| 图 1 2种生态型东南景天根系、茎和叶片的生物量与Cd2+含量 Figure 1 The dry biomass and Cd2+ concentration in roots, stems and leaves of two ecotypes of S. alfredii. |
| 图选项 |
在Cd0土壤上，2种生态型东南景天的叶、茎、根的生物量之间没有显著差异；但在Cd5土壤上，NHE东南景天的叶片、茎、根系的生物量分别比HE东南景天低30%、37%、23%；在Cd50土壤上，NHE东南景天的叶片、茎、根系的生物量分别比HE东南景天低71%、61%和18% (图 1-A，1-B)。
与Cd0处理相比，生长在Cd5土壤上的HE东南景天的叶片和茎Cd2+含量没有显著增加，但当生长在Cd2+土壤上时，其叶、茎和根Cd2+含量均急剧增加，分别是Cd0处理的6.7、2.3和4.8倍(图 1-C)。随着土壤Cd2+浓度增加，NHE东南景天根、茎和叶片Cd2+含量也不断增加，但其根系、茎和叶片Cd2+含量均远远低于HE东南景天(图 1-D)。例如，生长在Cd50土壤上的NHE东南景天叶、茎、根Cd2+含量分别比HE东南景天低了90%、75%和74% (图 1-C，1-D)。
2.2 东南景天叶片、茎、根系内生细菌的α多样性 利用RDP Classifier过滤掉低质量的序列后，18个样品一共得到822821条有效序列，在97%相似度下共得到1324个OTUs，其中分别从HE和NHE东南景天得到712个和612个OTUs。Chao1指数和Shannon指数分别反映样品中内生细菌的丰富度和多样性。在3种土壤上，HE东南景天叶片中内生细菌的丰富度和多样性均远大于NHE东南景天(表 1)。对于HE东南景天，叶片内生细菌的丰富度在Cd0土壤上最大，而内生细菌的多样性在Cd50土壤上最高，茎和根系内生细菌的丰富度在Cd5土壤上最大(表 1)。对于NHE东南景天，叶片和根系内生细菌的丰富度和多样性均随着土壤Cd2+浓度的增加有所降低，但茎中内生细菌的丰富度和多样性在Cd50土壤上最大(表 1)。
表 1. 2种生态型东南景天叶片、茎、根系中内生菌的α多样性指数 Table 1. Alpha diversity of endophytic bacteria in the leaves, stems and roots samples of two ecotypes S. alfredii
| Ecotypes | Organ | Soil Cd2+/(mg/kg) | Sample number | Read | OTUs | Chao 1 | Shannon | Simpson |
| HE | Leaf | 0 | HE-L-0 | 44682 | 214 | 249.69 | 5.27 | 0.96 |
| 5 | HE-L-5 | 51366 | 45 | 56.00 | 3.80 | 0.86 | ||
| 50 | HE-L-50 | 43105 | 111 | 118.86 | 5.81 | 0.97 | ||
| Steam | 0 | HE-S-0 | 41761 | 41 | 43.80 | 3.60 | 0.88 | |
| 5 | HE-S-5 | 42919 | 48 | 72.43 | 2.98 | 0.77 | ||
| 50 | HE-S-50 | 44799 | 49 | 53.50 | 3.88 | 0.90 | ||
| Root | 0 | HE-R-0 | 53342 | 66 | 87.86 | 3.81 | 0.88 | |
| 5 | HE-R-5 | 46556 | 91 | 120.06 | 3.41 | 0.84 | ||
| 50 | HE-R-50 | 46556 | 47 | 58.67 | 3.57 | 0.87 | ||
| NHE | Leaf | 0 | NHE-L-0 | 49789 | 43 | 68.50 | 2.98 | 0.79 |
| 5 | NHE-L-5 | 46472 | 17 | 22.25 | 2.52 | 0.75 | ||
| 50 | NHE-L-50 | 50430 | 20 | 22.50 | 2.97 | 0.86 | ||
| Steam | 0 | NHE-S-0 | 40563 | 72 | 94.75 | 4.89 | 0.94 | |
| 5 | NHE-S-5 | 43460 | 36 | 43.50 | 3.09 | 0.85 | ||
| 50 | NHE-S-50 | 40748 | 208 | 223.33 | 5.51 | 0.96 | ||
| Root | 0 | NHE-R-0 | 42403 | 93 | 113.33 | 4.73 | 0.92 | |
| 5 | NHE-R-5 | 53627 | 61 | 68.80 | 3.72 | 0.89 | ||
| 50 | NHE-R-50 | 40243 | 62 | 94.50 | 2.97 | 0.78 |
表选项
2.3 土壤镉离子浓度对2种生态型东南景天叶片内生细菌群落结构的影响 HE东南景天叶片内生细菌群落结构：HE东南景天叶片内生细菌归属于10个门，优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria) (图 2-A)。变形菌门的相对丰度在Cd5土壤上最大，分别是Cd0和Cd50处理的1.62倍和1.72倍(图 2-A)，这主要是由于Alphaproteobacteria纲的相对丰度显著增加(图 2-B)；然而，Gammaproteobacteria纲的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 2-B)。厚壁菌门的相对丰度(32.40%)在Cd50土壤上最大，另外2个处理之间无显著差异(图 2-A)；在纲水平上，Cd0、Cd5和Cd50土壤上分别以Bacilli纲、Negativicutes纲和Clostridia纲的相对丰度最大(图 2-C)。拟杆菌门的相对丰度在Cd5土壤上最大(图 2-C)，在3种土壤上均以Bacteroidia纲占优势(图 2-D)。放线菌门的相对丰度在3种土壤上的差异不显著(图 2-A)，且相对丰度最大的均为Actinobacteria纲(图 2-E)。
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| 图 2 2种生态型东南景天叶片内生细菌在门和纲水平的物种Profiling柱状图 Figure 2 Profiling histogram of endophytic bacteria in leaves of two ecotypes of S. alfredii at phylum and class levels. A is profiling histogram of species at phylum level, B, C, D and E are the profiling histogram of Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria at class level, respectively. |
| 图选项 |
RDA分析发现(图 3-A)，第一轴和第二轴分别可以解释67.4%和32.6% HE东南景天的叶片内生细菌群落结构在纲水平的变化，其中以叶片Cd2+含量和土壤Cd2+浓度的影响最大，分别可以解释HE东南景天叶片内生细菌群落结构65.0%和64.7%的变化。同时，Gammaproteobacteria纲、Clostridia纲和Negativicutes纲均与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度成显著正相关关系(P＜0.05)。拟杆菌门中的Bacteroidia纲与叶片Cd2+浓度、土壤Cd2+浓度、生物量、株高为负相关关系，但没有达到显著水平。
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| 图 3 超积累(A)和非超积累(B)生态型东南景天叶片内生细菌的RDA分析 Figure 3 RDA analysis of endophytic bacteria in leaves of HE (A) and NHE (B) ecotypes of S. alfredii. |
| 图选项 |
NHE东南景天叶片内生细菌群落结构：NHE东南景天叶片内生细菌归属于5个门，即变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门(Acidobacteria)(图 2-A)。变形菌门的相对丰度在Cd5土壤上最高(46.77%)，但3种土壤上均以Gammaproteobacteria纲的相对丰度最大，其相对丰度在Cd5土壤上最高，Cd0和Cd50土壤上没有明显的差别(图 2-B)。厚壁菌门的相对丰度在Cd50土壤最大(图 2-A)，主要为Negativicutes纲和Clostridia纲(图 2-C)；在Cd0和Cd50土壤上，Negativicutes纲的相对丰度最高，而Cd5土壤上以Clostridia纲的相对丰度最高(图 2-C)。土壤Cd2+浓度对拟杆菌门的相对丰度没有显著影响，但在Cd0和Cd50土壤上均以Bacteroidia纲的相对丰度最大，而在Cd5土壤上以Sphingobacteriia纲的相对丰度最大(图 2-D)。在3种不同Cd2+浓度土壤上，放线菌门的相对丰度没有显著差异(图 2-A)，且主要为Actinobacteria纲(图 2-E)。
RDA分析发现(图 3-B)，第一轴和第二轴分别可以解释NHE东南景天叶片中内生细菌群落结构95.6%和0.4%的变化，其中株高和植株总生物量分别可以解释88.1%和59.5%的变化；Gammaproteobacteria纲与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度均成负相关关系，而其与叶片生物量、总生物量成正相关关系，Clostridia纲与株高成显著负相关关系(P＜0.05)。Actinobacteria纲与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度成正相关关系，与生物量成负相关关系，Bacteroidia纲与株高成正相关关系。
2.4 土壤镉离子浓度对2种生态型东南景天茎内生细菌群落结构的影响 HE东南景天茎中内生细菌群落结构：HE东南景天茎内生细菌归属于9个门，优势菌门仍为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门(图 4-A)。变形菌门的相对丰度在Cd0土壤上显著高于Cd5和Cd50处理，分别是Cd5和Cd50处理的2.67倍和2.32倍(图 4-B)；Alphaproteobacteria纲的相对丰度在Cd5和Cd50土壤上显著减少，而Gammaproteobacteria纲的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 4-B)。厚壁菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 4-A)，其在Cd50土壤上的相对丰度分别是Cd0和Cd5处理的2.56倍和1.25倍，这主要是因Clostridia纲和Negativicutes纲的相对丰度显著增加(图 4-C)。同样，拟杆菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 4-A)，尤其是Bacteroidia纲的相对丰度增加显著(图 4-D)。放线菌门的相对丰度在Cd5土壤显著高于其他2个处理(图 4-A)，但在3种镉离子土壤上，均以Actinobacteria占优势(图 4-E)。
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| 图 4 2种生态型东南景天茎内生细菌在纲水平物种Profiling柱状图 Figure 4 Profiling histogram of endophytci bacteria in stems of two ecotypes of S. alfredii at phylum and class levels. A is profiling histogram of species at phylum level B, C, D and E are profiling histogram of Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria at phylum level, respectively. |
| 图选项 |
RDA分析的第一轴和第二轴分别可以解释HE东南景天茎中内生细菌群落结构的84.6%和15.4%变化，其中茎生物量和植物总生物量分别解释了83.6%和83.7%的内生细菌群落结构的变化(图 5-A)。对HE东南景天茎组织群落结构产生显著影响的物种主要包括厚壁菌门中的Negativicutes纲、拟杆菌门中的Bacteroidia纲和放线菌门中的Actinobacteria纲，它们均与株高、茎生物量、植株总生物量以及土壤Cd2+浓度、茎Cd2+含量成正相关关系，但Alphaproteobacteria纲和Bacilli纲与所有环境因子成显著负相关关系(P＜0.05) (图 5-A)。
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| 图 5 2种生态型东南景天茎组织内生菌RDA分析 Figure 5 RDA analysis of endophytic bacteria in stems of two ecotypes of Sedum alfredii. RDA analysis of endophytic bacteria in stems of HE (A) and NHE (B) ecotypes of S. alfredii. |
| 图选项 |
NHE东南景天茎中内生细菌群落结构：NHE东南景天茎内生细菌归属11个门，优势菌仍为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。变形菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加先增加后减少(图 4-A)，在纲水平，3种处理之间的差异显著，其中Cd0和Cd50处理以Gammaproteobacteria纲相对丰度最高(分别为17.86%、13.54%)，Cd5处理以Alphaproteobacteria纲(17.60%)的相对丰度最高(图 4-B)。厚壁菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而减少(图 4-A)，其在Cd0土壤的相对丰度高达43.34%，分别是Cd0和Cd50处理的1.28倍和1.65倍；在3种土壤上，均以Negativicutes纲和Clostridia纲的相对丰度最大(图 4-C)。拟杆菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加没有显著性变化(图 4-A)，而放线菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 4-A)。RDA分析的第一轴和第二轴分别可以解释NHE东南景天茎内生细菌群落结构(纲水平) 83.1%和16.9%的变化，其中株高可以解释42.0%的茎内生细菌的群落结构变化(图 5-B)。其Gammaproteobacteria纲和Bacteroidia纲分别与株高成正相关关系，但与茎的生物量成负相关关系，Actinobacteria纲与土壤Cd2+浓度、茎Cd2+含量成正相关关系，但与茎生物量、总生物量成负相关关系。
2.5 土壤镉离子浓度对2种生态型东南景天根系内生细菌群落结构的影响 HE东南景天根系内生细菌群落结构：HE东南景天根系内生细菌主要归属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌。变形菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而降低(图 6-A)，其中Alphaproteobacteria纲的相对丰度在Cd5土壤上最高，Betaproteobacteria纲的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而降低，而Gammaproteobacteria纲的相对丰度在3个处理之间没有显著差异(图 6-B)。厚壁菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 6-A)；在Cd0、Cd5和Cd50土壤上分别以Negativicutes纲、Clostridia纲和Negativicutes纲的相对丰度最高(图 6-C)。拟杆菌门的相对丰度也随着土壤Cd2+浓度的增加而增加(图 6-A)，3种处理均以Bacteroidia纲的相对丰度最高(图 6-D)。放线菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度的增加而减少(图 6-A)，3种Cd2+土壤上均以Actinobacteria纲占优势(图 6-E)，但其在Cd0土壤上的相对丰度显著高于其他2个处理。RDA分析发现，第一轴和第二轴分别可以解释HE东南景天根系内生细菌群落结构71.2%和28.8%的变化，其中土壤Cd2+浓度可以解释根系内生细菌67.4%的变化(图 7-A)。Alphaproteobacteria纲和Clostridia纲均与根系生物量、株高成正相关关系，Bacteroidia纲与土壤Cd2+浓度、根系Cd2+浓度成显著正相关(P＜0.05)，Actinobacteria纲与株高、根生物量、总生物量、土壤Cd2+浓度、根系Cd2+含量成负相关(图 7-A)。
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| 图 6 2种生态型东南景天根系内生细菌在纲水平物种Profiling柱状图 Figure 6 Profiling histogram of endophytic bacteria in roots of two ecotypes of S. alfredii at phylum and class levels. A is profiling histogram of species at phylum level of HE and NHE, B, C, D and E are profiling histogram of Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria at class level respectively. |
| 图选项 |
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| 图 7 2种生态型根系内生菌RDA分析 Figure 7 RDA analysis of endophytic bacteria in roots of two ecotypes of Sedum alfredii. RDA analysis of endophytic bacteria in roots of HE (A) and NHE (B) ecotypes of S. alfredii. |
| 图选项 |
NHE东南景天根系内生细菌群落结构：NHE东南景天根系内生细菌主要包括变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。变形菌门的相对丰度在Cd5土壤上最大，分别是Cd0和Cd50处理的3.56倍和2.03倍(图 6-A)，尤其是Alphaproteobacteria纲的相对丰度高达59.35% (图 6-B)。随着土壤Cd2+浓度的增加，厚壁菌门的相对丰度减少(图 6-A)；在Cd0土壤上以Negativicutes纲的相对丰度最大；在Cd5和Cd50土壤上，第一优势菌为Clostridia纲(图 6-C)。拟杆菌门的相对丰度随着土壤Cd2+浓度增加没有显著性变化，第一优势菌纲均为Bacteroidia纲(图 6-D)。在3种土壤上，放线菌门中均以Actinobacteria纲占绝对优势(图 6-E)，在Cd0和Cd5土壤上相对丰度没有显著差异，而在Cd50土壤上，相对丰度骤增。
RDA分析发现，第一轴和第二轴分别可以解释根系内生细菌78.2%和21.8%的变化，主要受株高的影响，其可以解释65.8%的变化(图 7-B)。Alphaproteobacteria纲与土壤Cd2+浓度、根系Cd2+含量成负相关关系，Clostridia纲与根生物量成正相关关系，但与土壤Cd2+浓度、根系Cd2+含量成负相关关系。Actinobacteria纲与土壤Cd2+浓度、根系Cd2+含量成显著正相关关系(P＜0.05)。
2.6 高镉环境下2种生态型东南景天内生细菌群落结构的比较 在Cd50土壤上，HE东南景天生长旺盛，NHE东南景天也能正常生长，但其生长受到一定的抑制，其生物量有所降低；同时，HE东南景天的根系、茎和叶片组织中Cd2+含量显著高于NHE东南景天。为了探究是否某些功能菌与HE东南景天吸收和积累Cd2+有关，我们选取Cd50处理来比较2种生态型东南景天内生细菌在属水平的差异(表 2)。
表 2. 2种生态型东南景天在Cd502+土壤上不同组织中相对丰度大于1%的菌属 Table 2. Genus with relative abundance greater than 1% in different tissues of two ecotypes of Sedum alfredii in Cd502+ soil
| Leaves | Stems | Roots | |||||
| HE/% | NHE/% | HE/% | NHE/% | HE/% | NHE/% | ||
| Escherichia/Shigella (16.81) | Veillonella (28.81) | Veillonella (27.71) | Veillonella (22.43) | Veillonella (36.8) | Bradyrhizobium (8.20) | ||
| Veillonella (13.60) | Escherichia/Shigella (21.19) | Bacteroides (18.21) | Faecalibacterium (6.74) | Sphingomonas (14.88) | Methylobacterium (5.10) | ||
| Faecalibacterium (9.95) | Bacteroides (10.17) | Escherichia/Shigella (11.40) | Escherichia/Shigella (6.31) | Prevotella (8.8) | Ralstonia (4.37) | ||
| Bifidobacterium (7.25) | Faecalibacterium (9.32) | Sphingomonas (9.05) | Sphingomonas (5.82) | Bacteroides (7.36) | Rhodococcus (3.28) | ||
| Sphingomonas (6.93) | Bifidobacterium (8.47) | Faecalibacterium (6.82) | Gp6 (5.76) | Escherichia/Shigella (3.68) | Streptomyces (3.10) | ||
| Bacteroides (6.04) | Porphyromonas (5.08) | Bifidobacterium (6.82) | Bacteroides (4.65) | Methylobacterium (3.52) | Escherichia/Shigella (2.19) | ||
| Sphingobacterium (2.28) | Prevotella (4.24) | Neisseria (2.79) | Clostridium sensu stricto (3.05) | Bifidobacterium (2.88) | Bacteroides (2.19) | ||
| Gp6 (1.68) | Sphingomonas (3.39) | Klebsiella (2.46) | Bifidobacterium (2.86) | Faecalibacterium (2.56) | Mycobacterium (2.19) | ||
| Haemophilus (1.55) | Megasphaera (2.54) | Methylobacterium (1.34) | Bacillus (2.12) | Clostridium sensu stricto (2.56) | Delftia (2.19) | ||
| Aquabacterium (1.45) | Clostridium (1.69) | Prevotella (1.98) | Bradyrhizobium (2.4) | Faecalibacterium (2.00) | |||
| Lachnospiracea (1.30) | Gp6 (1.69) | Truepera (1.20) | Klebsiella (1.44) | Rhizobium (1.82) | |||
| Clostridium (1.25) | Megasphaera (1.28) | ||||||
| Brevundimonas (1.23) | |||||||
| Streptococcus (1.08) | |||||||
表选项
Escherichia/Shigella属、Veillonella属和Bacteroides属细菌在HE东南景天叶片中相对丰度显著低于NHE，但HE东南景天叶片中Sphingomonas属细菌的相对丰度大于NHE；此外，有6个属(Sphingobacterium、Haemophilus、Aquabacterium、Lachnospiracea、Brevundimonas和Streptococcus)细菌仅出现HE东南景天叶片中(表 2)。
2种生态型东南景天茎中均以Veillonella属细菌的相对丰度最大，但其在HE东南景天茎中的相对丰度高于NHE，3个属(Neisseria、Klebsiella、Methylobacterium)细菌仅出现在HE东南景天茎中；同时，Bacteroides、Escherichia/Shigella、Sphingomonas、Faecalibacterium和Bifidobacterium属细菌在HE东南景天茎中的相对丰度均高于NHE (表 2)。
HE和NHE东南景天根系中分别有12个和11个属的相对丰度高于1%，单独出现在HE东南景天根中有7个属的细菌(Veillonella、Sphingomonas、Prevotella、Bifidobacterium、Clostridium sensu stricto、Klebsiella、Megasphaera)，其中Veillonella、Sphingomonas和Prevotella属细菌的相对丰度分别高达36.8%、14.88%、8.8%。此外，HE东南景天根系中Bacteroides、Escherichia/Shigella、Faecalibacterium属细菌的相对丰度均大于NHE，而Bradyrhizobium和Methylobacterium属细菌的相对丰度则小于NHE (表 2)。
3 讨论 植物内生菌的群落结构和多样性受宿主植物(基因型、生态型、发育阶段、营养状况、器官等)和生长环境(温度、湿度、土壤营养水平和污染状况等)的影响[42]。一些研究者还指出，内生菌的多样性越高，宿主植物对环境胁迫的适应性越强[43]。HE和NHE东南景天对重金属Cd2+的耐性、吸收和积累能力差异显著，且HE东南景天的根系、茎和叶片中均有丰富的内生细菌[13]，一些内生细菌还能促进东南景天生长和吸收积累Zn和Cd[44]。然而，目前我们对2种生态型东南景天内生菌的群落结构的了解还比较少，因此，本研究采用Illumina MiSeq高通量测序研究土壤Cd2+污染水平对2种生态型东南根系、茎和叶片的内生菌群落结构的影响。
随着土壤Cd2+浓度的增加，NHE东南景天的生长受到一定的抑制，根系、茎和叶组织中Cd2+含量显著增加(图 1)，其内生菌的丰富度和多样性显著降低(表 1)。然而，当HE东南景天生长在Cd5和Cd50土壤上时，其茎和根系中的内生菌的丰富度反而高于Cd0处理，虽然叶片内生菌的丰富度低于Cd0处理，但生长在Cd50土壤上的HE东南景天的叶内生菌的丰富度是Cd5处理的2倍，内生细菌的多样性也显著高于Cd0和Cd5处理(表 1)。其原因可能在于NHE东南景天没有忍耐高Cd2+胁迫的能力，一方面，随着植物组织中Cd2+的积累，其生理代谢功能发生改变，从而间接地影响其内生细菌的增殖；另一方面，叶片和茎积累的高浓度Cd2+对其原有内生细菌产生了选择性压力，一些不能适应Cd2+胁迫的菌群的数量减少或消失，从而导致内生细菌的丰富度降低。Wei等(2014)也发现，随着土壤Mn浓度增加，商陆内生菌多样性指数显著降低[45]。然而，HE东南景天对Cd2+有超强的吸收、积累和解毒能力[2]，且在适当高Cd2+环境下，其生长和代谢更旺盛，从而可以给内生细菌提供更为丰度的营养(图 1)；同时，扦插苗的叶片和茎中Cd2+本底含量高，其原有的内生细菌已经适应Cd2+胁迫，从而在高Cd2+环境下更具有竞争优势。因此，当生长在高Cd2+土壤上，HE东南景天的内生细菌丰富度反而增加。研究也发现，从东南景天不同组织中分离纯化的大部分内生菌中表现出较高的锌和镉抗性，其中14个菌株可分泌IAA，6种菌株可溶解磷酸钙，3种菌株能产生铁载体，土壤接种这些内生菌能促进东南景天生长和提高土壤中锌的生物有效性[13]。接种内生细菌SAMR12后，东南景天体内重金属Cd2+浓度增加，并且植物生物量、根长、根尖数以及根表面积亦增加，同时检测到接种后有机酸(草酸、柠檬酸和琥珀酸)含量增加，说明SAMR12可通过产生有机酸、铁载体和酶等促进东南景天的生长和对镉的吸收[44]。反之，植物组织中重金属的积累对植物内生细菌的群落结构亦有较大的影响。RDA分析也发现，东南景天叶、茎、根内生细菌的群落结构受植物生长量和体内Cd2+的含量影响(图 3、图 5、图 7)。例如，随着土壤Cd2+浓度的增加，HE东南景天叶片的生物量和Cd2+含量增加(图 1)，Gammaproteobacteria纲和Negativicutes纲的相对丰度叶增加(图 2-B)，Clostridia纲在Cd502+土壤上的相对丰度远远大于Cd0和Cd5土壤。RDA分析也发现HE东南景天叶片中的Gammaproteobacteria纲、Negativicutes纲和Clostridia纲均与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度成显著正相关关系(P＜0.05)；Negativicutes纲、Bacteroidia与土壤Cd2+浓度和茎Cd2+含量成正相关(图 3)。
在3种不同Cd2+污染水平土壤上，HE和NHE东南景天的叶、茎、根系内生菌中，变形菌门占绝对优势，其次是厚壁菌门和拟杆菌门(图 2)。研究者也发现Ni超积累植物Thlaspi goesingense[18]、As超积累植物Pteris vittata和Pteris multifida[24]以及普通植物如杨树(Populus deltoides)[46]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[31]、Halimione portulacoides [47]的内生菌中均以变形菌门为主导。在Cd0土壤上，HE东南景天的叶片、茎和根中均以Alphaproteobacteria纲相对丰度最高；NHE东南景天的叶片、茎和根系中均以厚壁菌门中的Negativicutes纲的相对丰度最高。在Cd50土壤上，HE东南景天的叶片以Gammaproteobacteria纲的相对丰度最高，茎和根系中则以Negativicutes纲的相对丰度最高；NHE东南景天的叶片和茎中第一优势菌均为Negativicutes纲，且根系中42.81%的序列在科的水平不能鉴定。这也再次证明内生细菌的群落组成受宿主植物和土壤环境的影响。RDA分析发现，HE东南景天叶片中的Gammaproteobacteria纲与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度成显著正相关关系(P＜0.05)，而NHE东南景天叶片中的Gammaproteobacteria纲与叶片Cd2+含量、土壤Cd2+浓度均成负相关关系(图 3)；HE东南景天茎中的Negativicutes纲与茎的Cd2+含量、土壤Cd2+浓度均成正相关关系，而NHE东南景天茎中的Negativicutes纲与茎的Cd2+含量、土壤Cd2+浓度均成负相关关系(图 4)。研究还发现，在高镉(Cd50)环境下，Escherichia/Shigella属(Gammaproteobacteria纲)、Veillonella属(Negativicutes纲)、Sphingomonas属(Alphaproteobacteria纲)和Bifidobacterium属(Actinobacteria纲)等在HE东南景天叶、茎、根均占绝对优势(表 2)，这些菌属可能影响东南景天的生长和发育，参与Cd2+的吸收、积累和解毒的生理代谢过程。研究发现，内生细菌Sphingomonas SaMR12可以促进东南景天生长和对镉的积累[32]。但是遗憾的是，目前还没有从东南景天体内分离和纯化Escherichia/Shigella、Veillonella和Bifidobacterium属的细菌。
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