叶海斌#, 樊英#
, 王晓璐, 李乐, 盖春蕾, 刘洪军, 李天保 山东省海洋生物研究院, 山东省海水养殖病害防治重点实验室, 山东 青岛 266104
收稿日期：2017-12-18；修回日期：2018-03-16；网络出版日期：2018-06-02
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资助资金（CARS-47）；山东省现代农业产业技术体系虾蟹类产业创新团队（SDAIT-13）
*通信作者：樊英, Tel:+86-532-82688544, Fax:+86-532-82675569, E-mail:fy_fy123@126.com
#并列第一作者
摘要：[目的]在循环养殖系统中应用不同的复合益生菌制剂，探讨凡纳滨对虾肠道菌群结构特征及免疫水平发生的变化。[方法]30 d养殖周期结束后，通过平板计数法分析肠道细菌总数和弧菌总数；基于高通量测序技术分析肠道样品V3+V4区菌群特征；采用实时荧光定量PCR技术分析免疫相关因子TLR1和Dorsal基因表达水平，阐述益生菌制剂应用的意义。[结果]益生菌制剂的应用降低了凡纳滨对虾肠道中细菌总数，抑制弧菌的生长，间接预防疾病的发生。不同益生菌制剂从不同程度上优化了凡纳滨对虾肠道菌群结构，提高高质量序列和有效OTU数量，Chao1、Simpson、Shannon指数显示了丰富度和多样性变化，复合益生菌制剂3效果较好。同时，菌群结构得到优化，其中益生菌制剂1组对拟杆菌门含量百分比产生显著影响。Toll受体TLR1和Toll通路中的Dorsal基因mRNA表达受到益生菌制剂的影响，1、3组促进了TLR 1表达，1、2、3组都促进了Dorsal基因表达。[结论]在循环水养殖系统中添加益生菌制剂可优化凡纳滨对虾肠道菌群特征，提高免疫水平，为病害防控和健康养殖提供理论依据。
关键词： 凡纳滨对虾 肠道微生物 益生菌制剂 高通量测序
Effects of three biological agents on intestinal microbiota of white shrimp (Litopenaeus vannamei) in a water-recirculating cultivation system
Haibin Ye#, Ying Fan#
, Xiaolu Wang, Le Li, Chunlei Gai, Hongjun Liu, Tianbao Li Key Laboratory for Disease Control in Mariculture of Shandong Province, Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, Shandong Province, China
Received 18 December 2017; Revised 16 March 2018; Published online 2 June 2018
*Corresponding author: Ying Fan, Tel:+86-532-82688544, Fax:+86-532-82675569, E-mail:fy_fy123@126.com
Supported by the China Agriculture Research System (CARS-47) and by the Shandong Agriculture Industrial Technology (SDAIT-13)
#These authors were contributed equally to this work
Abstract: [Objective]We studied the effects of three biological agents on intestinal microbiota and immunity of white shrimp (Litopenaeus vannamei) in a water-recirculating cultivation system.[Methods]The composition of three biological agents were Bacillus subtilis, Candida utilis, nitrifying bacteria and photosynthetic bacteria (treatment 1); Proteinase, Acidophilus spp., Bacillus subtilis and Faecalis spp. (treatment 2); and Protease, yeast, Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus (treatment 3). After feeding 30 days, the total numbers of bacteria and Vibrio in the intestine of L. vannamei were calculated using plate counting. The high throughput sequencing of 16S rDNA gene's V3+V4 region was used to determine diversity and composition of bacterial communities. Real time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression levels of Toll-like receptor 1 (TLR1) and Dorsal.[Results]After the application of biological agents, the total number of bacteria in the intestine of L. vannamei was reduced to 7.22 CFU/g, and the growth of Vibrio was inhibited (5.01 CFU/g) in treatment 3. In treatment 3, the percentage of high sequences and Operational Taxonomic Unit (OTU) were increased to 98.8% and 326, Chao1, Simpson, Shannon was 581.34, 0.94, 5.52 respectively, which displayed the changes of bacterium abundance and diversity in intestine. Furthermore, the community structure of intestinal microbiota was optimized. Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Firmicutes, Candidatus Saccharibacteria and Cyanobacteria were the main dominant phyla. However, the proportion of Bacteroidetes was significantly increased (40.7%) in the treatment 1 (P < 0.05). The different expression levels of Toll-like receptor 1 and Dorsal were changed in different probiotics. In treatment 3, the expression level of Toll-like receptor 1 (TLR1) was 3.2 (P < 0.05), which was 220% higher than control, meanwhile, the expression level of Dorsal was 4.7 (P < 0.05), which was 370% higher than control.[Conclusion]Our study revealed that biological agents played an active role in the recirculating system, which could optimize the structure of intestinal microbiota and improve the expression levels of immune genes. In this case, these biological agents could serve as candidates for diseases prevention and healthy aquaculture. And the treatment 3 was the better.
Key words: Litopenaeus vannamei intestinal microbiota biological agents high throughput sequencing
多种多样的微生物在宿主机体、环境中发挥着不容忽视的作用，参与生命过程和生态系统的发展。肠道微生物作为生命系统中的一部分，菌群结构和功能参与养殖动物营养代谢、能量平衡、免疫防御，是维持健康生长及稳定环境的主要因素。外源微生物的干预可能通过影响肠道微生物数量、组成及分布来维持养殖动物及养殖系统的动态平衡。郑晓婷等[1]研究发现，饲料中添加0.5%植物乳酸杆菌能促进对虾肠上皮细胞的高度和微绒毛密度，增强肠道对营养物质的吸收，有助于促进对虾消化酶活性，增强机体对蛋白质、淀粉等营养物质的消化分解，促进对虾生长。王越新等[2]研究发现，南美白对虾养殖中使用光合细菌和芽孢杆菌，可使有益菌大量繁殖，争夺有限的营养空间，限制有害微生物的生长，同时防止水质恶化，优化水环境，从而达到预防疾病的效果。早在2000年，Rengpipat等[3]发现，黑虎虾养殖过程投喂芽孢杆菌S11可明显提高抗病毒能力，实验组黑虎虾的存活率、吞噬细胞活性和抗菌活性均高于对照组。Gullian等[4]研究表明，芽孢杆菌P64、弧菌P62和溶藻胶弧菌均可显著促进对虾的增长速度。本文研究循环养殖系统中添加益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道微生物及免疫水平的影响，探讨益生菌制剂的作用效果，揭示凡纳滨对虾肠道微生物的特征及重要性，为病害防控和生态养殖提供参考。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又称南美白对虾(White Prawn)，分类学上隶属于节肢动物门(Phylum Arthropoda)、甲壳纲(Class Crustacea)、十足目(Order Decapoda)、对虾科(Family Penaeidae)、对虾属(Genus Penaeus)，是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一。养殖条件下，凡纳滨对虾白天一般都静伏池底，入暮后则活动频繁，具有生长快、抗病能力强、经济效益显著等特点。然而，水环境是凡纳滨对虾养殖过程中的重要保障因素，影响着养殖动物的生长、生存；水环境调控则是健康养殖的重要技术环节，循环水养殖系统因其优化的特征在水产养殖中建立了合理的应用模式[5-6]。循环水养殖系统已对欧洲龙虾(Homarus gammarus L.)[7]、凡纳滨对虾[8]养殖产生了明显的优势效果。本研究中的循环水养殖系统与传统养殖模式相比，节约用水、减少污染、高密养殖、调控生态环境，符合健康养殖的要求，降低疾病发生的风险，在此基础上探讨不同益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道微生物菌群产生的影响，以期分析微生物菌群在应用过程中的变化与作用机理，为健康养殖提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 试验材料及养殖条件 健康、规格整齐的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)来自山东潍坊某养殖场，体长约(3.2±0.5) cm，体重约(3.0±0.5) g，随机放入养殖池内500尾/m2。益生菌制剂1来自青岛绿海洋生物技术有限公司，益生菌制剂2来自博尚生化科技实业有限公司，益生菌制剂3来自青岛根源生物技术集团有限公司。
试验水源为地下水，水温(25±1)℃，pH为7.2–7.8，24 h充气，溶氧为5.5–6.5 mg/L，氨氮小于0.4 mg/L。循环水养殖模式：养殖池面积25 m2，水深1 m，养殖水源为地下水曝气消毒后经调温直接流入养殖池中，养殖废水流入沉淀池，经沉淀后流入过滤池，由微滤系统去除残饵、粪便等固体代谢物后，进入生物滤池(内含大孔生物载体，在表面及内部固定硝化细菌等微生物)，结合生物膜反应器对废水中氨氮、亚硝酸盐、微生物菌群等进行调节后再流入养殖池内循环使用，每日添加10%新水作为补充(循环养殖系统为自行设计)。
试验过程中正常管理，每天分别于6:00、14:00、22:00饱食投喂，投饵量以投饵后2 h内吃完为佳。试验所用基础饲料为大乐饲料有限公司对虾专用配合饲料，主要营养成分如表 1。
表 1. 基础饲料成分记录分析 Table 1. Proximate analysis of basal diet
| Nutrient ingredients | Mass fraction/% | Nutrient ingredients | Mass fraction/% |
| Crude protein | ≥44.0 | Calcium | ≤5.0 |
| Crude fat | ≥4.0 | Total phosphorus | ≥1.2 |
| Crude fiber | ≤6.0 | Lysine | ≥2.2 |
| Crude ash | ≤16.0 | Moisture | ≤11.0 |
表选项
1.2 试验设计 试验共设3组，对照组、试验组1 (添加益生菌制剂1，包括枯草芽孢杆菌+产脘假丝酵母+硝化细菌+光合细菌)，试验组2 (添加益生菌制剂2，包括蛋白分解酵素+乳酸菌+枯草芽孢杆菌+黄链球菌)，试验组3 (添加益生菌制剂3，包括蛋白酶+酵母菌+枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌)，每组3个平行。益生菌制剂添加量为5 mg/kg，含活菌数分别达109 CFU。养殖周期为30 d。
1.3 试验取样 试验30 d后分别从不同试验组中随机取样，每池选取5点位置(四角和中间)，凡纳滨对虾每点取10尾，冰上无菌条件下获取肠道，用无菌生理盐水冲洗3次，然后将肠道剪开，获取内容物，混合，–80 ℃保存备用；同时将剩下的肠道组织放入离心管中，用组织匀浆机处理后混合，–80 ℃保存备用。
1.4 试验流程、分析 称取0.1 g肠道内容物，加入10倍体积(V/W)无菌预冷重蒸水，在冰浴中(0–4 ℃)充分均匀，以10倍递增稀释法进行稀释，取3个合适的稀释度涂布于2216e、TCBS培养基(北京陆桥技术股份有限公司)，每个稀释度做3个平行，28 ℃培养1–2 d。
利用QUAGEN试剂盒提取肠道内容物基因组总DNA，扩增高可变区(引物319F、806R) (参考陈冠周等[9]的方法)；产物纯化之后进行序列测定。测序平台为杭州联川生物技术股份有限公司Illumina MiSeq 2 × 300 bp paired-end。数据分析流程包括：(1)数据优化及序列统计。测序获得的原始数据去除reads的barcode和接头序列，将每一对paired-end reads拼接合并成一条更长的tag，去除含有N (N表示无法确定碱基信息)的比例大于5%的tags，去除低质量tags (质量值Q < 10的碱基数占整个tag的20%以上)，从而获得Clean数据。(2) OTU (operational taxonomy unit)统计分析。采用CD-HIT将序列相似性大于97%的clean tags定为一个OTU，选择其中序列最长的reads作为该OTU的代表序列，统计多组样品中所共有和独有的OTU数目，发现样品之间组成相似性及特异性。(3)丰度及Alpha多样性。包括Shannon、simpson、chao1指数，且从门和目的水平上对不同菌群分布的均匀度进行统计。
不同试验组将部分肠道组织样品混合，通过大连宝生物工程有限公司TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测条带。然后进行反转录，按照大连宝生物工程有限公司One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit方法进行。Toll受体TLR1[10]和免疫相关转录因子Dorsal[11]基因表达通过大连宝生物工程有限公司实时荧光定量SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒方法进行测定，以β-actin作为内参基因，用2–ΔΔCT的方法计算基因相对表达量的变化。实验中所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 2)。
表 2. 凡纳滨对虾Toll样受体基因与β-actin参照基因引物序列 Table 2. Primer pairs for Toll receptor, Dorsal and β-actin genes
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| β-actin-F | CGCGACCTCACAGACTACCT |
| β-actin-R | CTCGTAGGACTTCTCCAGCG |
| Toll receptor-F | TGAGAGATGCCCACTGCCTG |
| Toll receptor-R | CGCTTGAAGGTTTGTGAGGGAG |
| Dorsal F | GATGGAATGATAGAATGGGAAGC |
| Dorsal R | CACTGGTACTCTTGTCTGGTGGTC |
表选项
1.5 统计分析 数据均用(平均值±标准误)进行表示。用SPSS 17.0中的单因素变量方差分析(One-Way ANOVA)方法进行统计学分析，用Duncan法进行多重比较。显著水平为P < 0.05。
2 结果和分析 2.1 凡纳滨对虾肠道细菌总数和弧菌总数 通过2216e、TCBS培养基对凡纳滨对虾肠道内容物细菌总数、弧菌数进行统计。如表 3所示，试验组细菌总数比对照组显著降低，弧菌数量显著降低，说明不同益生菌制剂有效抑制肠道内弧菌生长。其中，益生菌制剂3组凡纳滨对虾肠道细菌数量达7.22 CFU/g，弧菌数量达5.01 CFU/g (P < 0.05)。
表 3. 益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道细菌总数和弧菌总数的影响 Table 3. Effects of different probiotics on total bacterium counts (TBC) and Vibrios bacterium counts (VBC) in Penaeus vannamei intestinal
| Groups | Total bacterium counts/(CFU/g) | Vibrios bacterium counts/(CFU/g) |
| Control | 8.01±0.08a | 6.51±0.07a |
| Treatment 1 | 7.81±0.08b | 5.31±0.03b |
| Treatment 2 | 7.26±0.11c | 6.13±0.09b |
| Treatment 3 | 7.22±0.04c | 5.01±0.05c |
| Values in each column without a common superscript are significantly different (P < 0.05). | ||
表选项
2.2 凡纳滨对虾肠道内容物高通量测序结果 由表 4可看出，本研究中肠道样品的测序结果能够真实地反映试验组别中优势细菌的关系和变化。统计获得，各组别获得的高质量序列百分比都在90%以上，保持在一个相当的水平，相似性大于97%的OTU数量由于益生菌制剂的作用发生了变化，优质有效序列明显增加，序列间相似度提高，益生菌制剂3组最明显。对各个样品细菌多样性的相互关系进行分析，并构建VENN图(图 1)。应用益生菌制剂后，高质量序列整合发现，OTU数量是对照组 > 益生菌制剂1组 > 益生菌制剂2组 > 益生菌制剂3组，益生菌制剂1组存在74个差异OTU，益生菌制剂2组存在88个OTU，而益生菌制剂3组存在65个差异OTU。反映样品多样性的Chao1、Simpson、Shannon指数值统计结果同样显示，肠道内容物中微生物群落的多样性指数因为益生菌制剂的应用而发生变化，且有进一步的提升。Chao1指数代表群落丰富度，益生菌制剂3提高效果显著；Shannon、Simpson指数与群落多样性指数呈正比，益生菌制剂3组样品微生物群落多样性指数最大。
表 4. 不同处理组肠道样品的丰富度和多样性统计 Table 4. Richness and diversity indexes of gut microflora in different treatments
| Groups | Valid data | High sequences | OTU | Diversity indexes | ||
| Chao 1 | Simpson | Shannon | ||||
| Control | 15618 | 15508 | 408 | 534.91 | 0.84 | 5.25 |
| Treatment 1 | 20777 | 20562 | 384 | 415.96 | 0.85 | 4.25 |
| Treatment 2 | 14977 | 14805 | 380 | 514.14 | 0.91 | 5.47 |
| Treatment 3 | 10901 | 10776 | 326 | 581.34 | 0.94 | 5.52 |
表选项
 |
| 图 1 各样品中细菌多样性的相关性分析 Figure 1 Correlation analysis of bacterial diversity in different treatments. Numbers of OTU in different treatments. |
| 图选项 |
对不同组别凡纳滨对虾肠道内容物样品中细菌门类进行统计(表 5、图 2)。结果显示，不同组别中的优势菌门类包括变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、疣微菌门Verrucomicrobia、厚壁菌门Firmicutes、柔膜菌门植原体暂定种Candidatus Saccharibacteria、蓝菌门Cyanobacteria，其中百分比例最高的是变形菌门，益生菌制剂1组变形菌门比例比对照组低(P < 0.05)，而益生菌制剂2组和3组比对照组稍高(P > 0.05)；与对照组比较，变化最显著的是拟杆菌门，对照组仅有3.1%，益生菌制剂1组达40.7%，益生菌制剂2组达9.1%，益生菌制剂3组达13.8%。
表 5. 不同处理组肠道样品细菌门的水平及其相对丰度百分比 Table 5. Frequence and levels of phylum in microbial communities from different samples (%)
| Microbial communities | Groups | |||
| Control | Treatment 1 | Treatment 2 | Treatment 3 | |
| Proteobacteria | 73.6 | 51.9 | 78.4 | 75.0 |
| Bacteroidetes | 3.1 | 40.7 | 9.1 | 13.8 |
| Actinobacteria | 3.6 | 5.5 | 3.2 | 6.7 |
| Verrucomicrobia | 6.1 | 1.4 | 1.0 | 2.6 |
| Firmicutes | 1.5 | 0.2 | 6.0 | 0.3 |
| Candidatus Saccharibacteria | 3.5 | 0.3 | 0.5 | 1.1 |
| Cyanobacteria | 7.3 | 0.0 | 0.9 | 0.0 |
表选项
 |
| 图 2 不同处理组肠道样品细菌门的水平及其相对丰度百分比 Figure 2 Frequence and levels of phylum in microbial communities from different samples (%). |
| 图选项 |
进一步对不同组别样品中优势菌进行目的分析(表 6、图 3)，发现优势菌目主要有红细菌目Rhodobacterales、黄杆菌目Flavobacteriaceae、放线菌目Actinomycetales、蓝菌目叶绿体Chloroplast、疣微菌目Verrucomicrobiales、根瘤菌目Rhizobiales、酸微菌目Acidimicrobiales、乳杆菌目Lactobacillales。益生菌制剂1组和2组降低了凡纳滨对虾肠道样品中红细菌目的比例，益生菌制剂3组稍有提高(P > 0.05)；益生菌制剂1、2、3组均提高了样品中拟杆菌目的比例，以益生菌制剂1组最为显著(P < 0.05)。
表 6. 不同处理组肠道样品细菌目的水平及其相对丰度百分比 Table 6. Frequence and levels of order in microbial communities from different samples (%)
| Microbial communities | Groups | |||
| Control | Treatment 1 | Treatment 2 | Treatment 3 | |
| Rhodobacterales | 64.9 | 47.4 | 41.7 | 69.6 |
| Flavobacteriaceae | 2.8 | 39.7 | 8.4 | 12.3 |
| Actinomycetales | 1.6 | 5.2 | 1.9 | 5.8 |
| Chloroplast | 7.3 | 0.0 | 0.9 | 0.0 |
| Verrucomicrobiales | 6.1 | 1.4 | 1.0 | 2.6 |
| Rhizobiales | 4.0 | 0.7 | 1.7 | 1.0 |
| Acidimicrobiales | 1.7 | 0.2 | 1.3 | 0.9 |
| Lactobacillales | 0.9 | 0.0 | 4.7 | 0.1 |
表选项
 |
| 图 3 不同处理组肠道样品细菌目的水平及其相对丰度百分比 Figure 3 Frequence and levels of order in microbial communities from different samples (%). |
| 图选项 |
2.3 凡纳滨对虾肠道组织免疫基因表达 不同益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道组织Toll受体TLR1和Dorsal mRNA表达水平产生了影响(表 7)。益生菌制剂1组和3组TLR1和Dorsal表达水平比对照组均有提高(P < 0.05)；益生菌制剂3对TLR1和Dorsal mRNA表达水平影响尤为显著，TLR1 mRNA相对表达量为3.2 (P < 0.05)，比对照组提高了220%，Dorsal mRNA相对表达量为4.7 (P < 0.05)，比对照组提高了370%。
表 7. 不同益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道组织中Toll受体和Dorsal mRNA相对表达的影响 Table 7. Toll receptor and Dorsal mRNA expression levels in the gut of L. vannamei with different treatments
| Groups | Toll receptor TLR1 | Dorsal |
| Control | 1.0a | 1.0a |
| Treatment 1 | 2.2b | 3.0b |
| Treatment 2 | 1.0a | 2.3c |
| Treatment 3 | 3.2c | 4.7d |
| Values with a different superscript letter indicate difference at P < 0.05. | ||
表选项
3 讨论 3.1 复合益生菌制剂对凡纳滨对虾肠道中细菌和弧菌数量的影响 凡纳滨对虾养殖中主要的病害之一即是弧菌病，由条件致病菌——弧菌属细菌引起，其传染性疾病给养殖业带来越来越严重的影响。当养殖条件恶化、生态环境失衡时，凡纳滨对虾自身以及养殖水环境中弧菌数量发生变化，在与有益菌竞争过程中引发细菌性疾病的暴发，最终导致对虾死亡，降低养殖效益。本研究中，不同益生菌制剂的使用都降低了循环水养殖系统凡纳滨对虾肠道细菌总数和弧菌总数，益生菌制剂的有益菌成分在养殖过程中参与了营养物质的竞争，占据生存繁殖空间，从而抑制了有害菌的生长，维持并调控了凡纳滨对虾肠道微生态平衡。胡毅等[12]的研究结果也表明，饲料中添加益生菌能有效降低肠道和粪便中的弧菌数，优化肠道菌群环境，促进凡纳滨对虾生长。Vaseeharan和Ramasamy[13]在研究中论述，益生菌芽孢杆菌能有效抑制哈维氏弧菌(V. harveyi)的生长，降低了斑节对虾肠道弧菌数量。这些均与本研究结果相似。然而，2000年Rengpipat等[3]在室内研究了益生菌对斑节对虾肠道弧菌影响不显著，这可能是养殖环境差异造成的，益生菌的添加效果与养殖动物的生存环境有关，因此对养殖环境进行有效干预可达到促进效果。本研究即体现了这一优势，优化养殖环境的基础上添加益生菌制剂的应用，不同细菌在宿主肠道微生物环境中发挥不同的作用，维持肠道菌群平衡，优化菌群结构，最终达到抑制弧菌等有害菌生长、优化正常细菌总数的效果，这与Tannock[14]的论述相似。
3.2 复合益生菌制剂对循环养殖系统凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响 动物肠道是机体内微生物存在最丰富的场所，受到环境、药物等外界因素影响时，肠道菌群发挥作用以维持肠道正常生理功能，调节机体免疫以及拮抗病原微生物定殖等。研究表明，肠道微生物对宿主健康有极其重要的意义，稳定的肠道生态结构会产生积极的影响，分析动物肠道中微生物菌群的组成、分布，可有效预防疾病的发生[15-16]。在凡纳滨对虾中也不例外，肠道微生物菌群结构和功能发挥重要作用，参与对虾营养代谢、能量平衡、免疫防御等重要生理过程[17-18]。随着益生菌制剂在养殖系统中的应用，它的作用效果得到越来越多的肯定。本研究中体现了不同的益生菌制剂对循环养殖系统凡纳滨对虾肠道菌群结构产生的作用。通过高通量测序技术发现，应用益生菌制剂后凡纳滨对虾肠道菌群中高质量序列数增加，益生菌制剂3组OTU数量发生显著性差异，肠道内微生物菌群受到外界影响后细菌的定殖、繁殖发生一系列变化，不同的细菌其影响耐受性不同，可能益生菌制剂3组的益生菌成分更有利于凡纳滨对虾肠道菌群的适用，机理有待进一步研究。Chao1、Simpson、Shannon指数反映了不同样品的多样性，益生菌制剂3组多样性指数相对较高，但OTU数量则较低，这就说明了益生菌制剂3对肠道菌群的优化度最好，抑制了少量微生物的生长，为优势菌群提供了更多更好的生长空间，相似度 > 97%的细菌较多。有研究认为，益生菌的益生功能不是降低宿主的炎症反应或产生杀菌活性分子，而是由于特异的粘附因子的存在，便于益生菌在宿主机体肠道内的定殖[19]。本研究结果中，不同益生菌制剂组分在凡纳滨对虾肠道中的定殖不同，与肠道固有菌群之间的竞争不同，最终产生了不同的效果，达到优化菌群生态环境的目的。
高通量测序技术，包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术都被普遍用来分析微生物多样性。王亭芳等[20]和薛明等[21]都分析了凡纳滨对虾养殖水体中的微生物多样性，不同时间的多样性存在相似性，主要以变形菌门和拟杆菌门为主。唐杨等[22]通过DGGE技术获得，健康凡纳滨对虾肠道中菌群结构主要是变形菌门，其次是拟杆菌门，属的水平则包括异养硝化菌属、弧菌属、Anaerospora和小红卵菌属等。本研究结果表明，循环养殖系统健康凡纳滨对虾肠道中主要包括变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、疣微菌门、厚壁菌门等，益生菌制剂的应用提高了变形菌门、拟杆菌门、放线菌门的丰度，降低了疣微菌门、厚壁菌门丰度；目的水平上表现为红细菌目、黄杆菌目、放线菌目、疣微菌目、根瘤菌目等的变化。益生菌制剂1、2组明显降低了样品中红细菌目的丰度百分比，益生菌制剂3组比对照组稍有提高，这跟不同组别中细菌总数和弧菌总数的结果相呼应，可能由于红细菌具有一定的抑制细菌生长作用，所以益生菌制剂3组样品中细菌总数和弧菌总数低。另有研究表明，对虾的肠道内以厚壁菌门、放线菌门、梭杆菌门和变形菌门为主，而拟杆菌门的检出率则比较低[23-24]，本实验得出益生菌制剂1组中拟杆菌门丰度百分比显著提高，可能因为不同种类的益生菌对宿主的益生作用机理不同、代谢作用不同，益生菌制剂1中各组分能有效促进降解纤维素、几丁质、果胶质等不同生物高分子的活性，进而增加拟杆菌门的繁殖和定殖效果。
3.3 复合益生菌制剂对循环养殖系统中凡纳滨对虾肠道免疫因子表达的影响 研究表明，凡纳滨对虾在受到有害微生物威胁时，机体借助PGRP-SA和GNBP-1复合物与病原微生物上病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)结合后激活Spatzle蛋白，被活化的Spatzle蛋白与Toll受体结合，将异物入侵的信号从胞外传递到胞内，从而引起胞内信号级联反应，释放出类似于NF-kB样蛋白的核转录因子，进入细胞核与DNA结合，调节抗菌肽基因的表达[25-27]。在没有刺激的细胞中，大部分的NF-kB二聚体通过与细胞质中3个抑制因子(IkBa，IkBβ，IkBε)中的一个结合而以无活性的状态存在。当益生菌制剂介入后，肠道中IkBs首先是在IkBs激酶(IKK)催化下使其2个保守的丝氨酸残基磷酸化，接着IkBs在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解，活化的NF-kB转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录，提高目的基因表达量，间接提高机体免疫能力。凡纳滨对虾Toll受体在血细胞及鳃中表达量高，在肠、肌肉和肝胰脏中也有表达，表达水平在一定程度上可反映机体对外界入侵信号及时传递并产生相应免疫反应的状况[10]。因此，本研究中选择机体中重要的非特异性免疫组成部分——Toll受体(toll-like receptors，TLRs) mRNA表达水平来反映肠道组织对益生菌制剂应用产生的响应。冯伟等[28]报道，Vc的添加影响着凡纳滨对虾Toll受体的表达；郭腾飞等[10]报道，不同锌水平的添加也影响着凡纳滨对虾Toll受体的表达。本研究中，益生菌制剂1、3使TLR1表达量提高，益生菌制剂2未发生显著变化，表达量与对照组相当。凡纳滨对虾Toll受体mRNA表达水平发生不同程度的变化，可能由于益生菌制剂的给予干预了机体肠道对外界物质入侵时作出的信号传递，阻止或促进了免疫反应的发生，机制探讨有待进一步研究。
Dorsal基因是Toll通路下游的核转录因子[11]，属于Rel/NF-kB家族，当外界刺激存在的条件下，抗菌肽基因的转录即发生，益生菌制剂的给予是否影响Dorsal基因的表达正是本研究的目的，间接反映机体的免疫机制。研究发现，益生菌制剂3组凡纳滨对虾肠道中Dorsal基因表达被显著激活，比对照组提高了370%，诱导效果显著，这说明益生菌制剂组分干扰Toll受体蛋白结合、信号传递、转录表达等一系列级联反应，也可能与肠道结构的变化有关，仍需进一步探讨。
4 结论 本研究中不同益生菌制剂的应用可不同程度地抑制弧菌生长，优化生态环境。通过Illumina Miseq高通量测序技术对16S rDNA V3+V4可变区序列进行测序分析，应用益生菌制剂后肠道微生物高质量序列增多，有效OTU数量得到优化，不同多样性指数均呈现了良好状态；优势细菌丰度变化不同，主要表现在变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、疣微菌门、厚壁菌门、Candidatus Saccharibacteria和蓝菌门；以及在目的水平上，红细菌目和黄杆菌目发生了显著的变化，益生菌制剂1最显著。通过实时荧光定量PCR分析不同益生菌制剂对肠道组织免疫基因表达影响，TLR1和Dorsal mRNA表达量均得到了提高，益生菌制剂3处理组最高。综合说明益生菌制剂达到了优化肠道菌群特征、提高肠道免疫的目的，且益生菌制剂3效果更优。
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