云龙1,2, 罗鹏1
, 田雨顺1,2, 丁雄祺1,2, 胡超群1 1.中国科学院南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省应用海洋生物学重点实验室, 广东 广州 510301;
2.中国科学院大学, 北京 101408
收稿日期：2017-08-15；修回日期：2017-11-21；网络出版日期：2018-01-09
基金项目：国家自然科学基金（31370149）；广东省渔业科技攻关项目（20170228-9-3）
*通信作者：罗鹏, E-mail: luopengli@163.com
摘要：[目的]分析创伤弧菌（Vibrio vulnificus）全基因组框架序列，挖掘感兴趣的遗传位点，探索其是否具有CRISPR系统及其特征。[方法]在病虾体内分离获得了一株创伤弧菌TF3，通过Illumina Miseq测序得到基因组框架序列。经注释分析发现其基因组中存在一个CRISPR-Cas系统，命名为CRISPR-CasTF3，进一步分析发现CRISPR-CasTF3位于一个基因岛上，将该基因岛命名为MGIVvuTF3。对CRISPR-CasTF3及MGIVvuTF3的特征和来源进行了分析。[结果]CRISPR-CasTF3属于与大肠杆菌类似的Ι-E型CRISPR-Cas系统，CRISPR-CasTF3包括8个cas基因，其排列为cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2；具有50个重复序列，每二个重复序列间为一个Spacer序列。MGIVvuTF3具有attL和attR序列，含有位点特异性整合、剪切、转移相关的基因。MGIVvuTF3与霍乱弧菌O395基因组中的一个基因岛MGIVch0395具较高相似性，二者最显著的差别在于Spacer序列完全不同，以及各有几个非保守的预测基因。[结论]MGIVvuTF3及CRISPR-CasTF3极有可能通过基因水平转移获得，并且CRISPR-CasTF3系统可以借助MGIVvuTF3实现水平转移。
关键词： CRISPR cas基因 基因岛 创伤弧菌
Analysis of a CRISPR-Cas system and a genomic island, MGIVvuTF3, in complete genome of Vibrio vulnificus TF3
Yun Long1,2, Luo Peng1
, Tian Yushun1,2, Ding Xiongqi1,2, Hu Chaoqun1 1.CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology(LMB), Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology(LAMB), South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, Guangdong Province, China;
2.University of Chinese Academy of Science, Beijing 101408, China
Received 15 August 2017; Revised 21 November 2017; Published online 9 January 2018
*Corresponding author: Peng Luo, E-mail: luopengli@163.com
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31370149) and by the Program of Fishery Problem Tackling of Guangdong Province (20170228-9-3)
Abstract: [Objective]In order to dig interesting genetic regions and explore whether CRISPR-Cas systems exist, the draft genome of Vibrio vulnificus TF3 was analyzed.[Methods]We isolated V. vulnificus strain TF3 from the diseased shrimp Litopenaeus vannamei, and then obtained its genome sequence by Illumina Miseq sequencing. The genomic annotation showed that there was a CRISPR-Cas system in V. vulnificus TF3, named CRISPR-CasTF3. After further analysis, we found that the CRISPR-CasTF3 located in a genomic island, named MGIVvuTF3. The characteristics and sources of CRISPR-CasTF3 and MGIVvuTF3 were analyzed using bioinformatic methods.[Results]We found the CRISPR-CasTF3 belonged to type I-E CRISPR-Cas system similar to that of Escherichia coli. The CRISPR-CasTF3 contained eight cas genes with the order, cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2. CRISPR-CasTF3 had 50 repeats sequences separated by 49 spacer sequences. MGIVvuTF3 featured attL/attR sequences, and key genes participating in site-specific integration, excision, and transfer, and thus it manifested that MGIVvuTF3 represents a genomic island. MGIVvuTF3 had highly similarity to a genomic island, MGIVch0395, found in V. cholerae O395. However, the two genomic islands also had two distinct differences, namely, they had completely different spacer sequences and each of them had several particular predicted genes.[Conclusion]MGIVvuTF3 harboring CRISPR-CasTF3is most likely obtained through horizontal gene transfer, and therefore the CRISPR-CasTF3 system may transfer horizontally by means of MGIVvuTF3.
Key words: CRISPR cas genes genomic island Vibrio vulnificus
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是海洋环境中常见的革兰氏阴性弧菌，它与霍乱弧菌(V. cholerae)以及副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)并称人类三大致病性弧菌[1]，创伤弧菌同时也是多种水产动物的致病菌[2]。以往的研究表明，创伤弧菌具有高度的遗传多样性，并且具备多种多样的水平转移遗传元件，它们赋予宿主菌多样性的环境适应性功能[2-3]。CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是原核生物抵制噬菌体和质粒等异源核酸入侵、适应环境的功能元件之一[4]，1987年，Ishino等首次在大肠杆菌中发现了CRISPR存在[5]。之后研究人员对其结构和功能进行了深入探究，发现CRISPR系统主要由以Leader序列(L)、Repeat序列(R)和Spacer序列(S)构成的CRISPR位点和与之相互协同作用的cas基因(表达Cas蛋白)构成[6-7]。L序列位于CRISPR位点的上游，是富含AT的不保守序列，具有RNA聚合酶的识别位点，与CRISPR位点的转录有关[8]；在多数情况下，整个CRISPR排列首先转录形成pre-CRISPR RNA，随后加工成为成熟的crRNAs，成熟的crRNA与Cas蛋白形成核糖核蛋白效应体，在crRNA指导下，Cas蛋白特异性锚定和清除异源的病毒(噬菌体)或质粒[9-12]；S序列是CRISPR位点的可变功能序列，其原始来源与入侵的核酸有关，代表对过去入侵异源核酸的“记忆”[9-10]。但是，在已知的数据库中搜索发现创伤弧菌的全基因组中不存在典型的CRISPR结构，而我们在患病凡纳滨对虾体内分离到的创伤弧菌TF3，通过基因组序列分析发现其存在一个CRISPR-Cas系统，并且CRISPR-Cas系统位于一个基因岛上，本研究中对此CRISPR-Cas系统及其所在的基因岛的基因组学特征进行了详细的分析。
1 材料和方法 1.1 菌株及全基因组测序 创伤弧菌TF3分离于广东湛江养殖的患病凡纳滨对虾肠道，并保存于本实验室。采用华大基因Illumina Miseq测序平台进行了全基因组框架图测序。首先对提取的基因组进行机械剪切，剪切后的DNA进行末端补平，再通过3'端加碱基A，使得DNA片段能与3'端带有T碱基的接头连接，用电泳回收目的片段(400–500 bp)连接产物，再使用PCR扩增两端带有接头的DNA片段，最后用检验合格的文库进行Illumina Miseq上机测序。
1.2 创伤弧菌TF3全基因组注释及基因岛分析 采用线上原核生物基因组注释在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok)对创伤弧菌TF3全基因组进行注释。采用IslandViewer 4进行基因岛预测(http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/)。
1.3 CRISPR-Cas系统及其所在基因岛基因组特征分析 采用CRISPRFinder[13]查找CRISPR位点，采用Tandem Repeats Finder[14]查找CRISPR-Cas上下游attL和attR位点，利用WebACT[15]进行基因组比对。
2 结果和分析 2.1 创伤弧菌TF3全基因组框架图测序 对创伤弧菌TF3全基因组框架图测序，91.07%的测序碱基达到Q20值，平均测序深度为350×，共获得145条Scaffold序列，总碱基数达到5077663 bp，与典型的创伤弧菌株CECT 4999基因组总长(5094689 bp, NZ_CP014636.1及NZ_CP014637.1)十分接近，表明本测序获得的基因组框架序列已经覆盖了基因组的绝大部分区域。创伤弧菌TF3的Scaffold序列最长Scaffold为456071 bp，最短Scaffold为202 bp。创伤弧菌TF3基因组GC含量为46.6%，与典型株CECT 4999的GC含量一致。TF3基因组至少包含82个基因岛，已经探测出的基因岛长度介于4039–103724 bp，基因岛占整个基因组大小的20.0%。TF3基因组预测编码4564个基因。根据同源蛋白簇(COG)聚类，共有3492个基因获得聚类，占比76.5%。获得COG聚类的基因中，38.6%的基因与代谢相关，27.2%的基因与细胞进程与信号相关，16.7%的基因与遗传信息储存与加工相关。获得COG聚类的基因的具体功能类别及数量见图 1，由图可见，除了功能未知的基因，最大数量的基因分别被注释到氨基酸转运(E, 307个)、代谢以及信号转导机制(T, 304个)相关的同源蛋白簇中。
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| 图 1 同源蛋白簇(COG)聚类统计图 Figure 1 Statistical graph for clusters of orthologous groups of proteins. A: RNA processing and modification; B: Chromatin structure and dynamics; C: Energy production and conversion; D: Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E: Amino acid transport and metabolism; F: Nucleotide transport and metabolism; G: Carbohydrate transport and metabolism; H: Coenzyme transport and metabolism; I: Lipid transport and metabolism; J: Translation, ribosomal structure and biogenesis; K: Transcription; L: Replication, recombination and repair; M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N: Cell motility; O: Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P: Inorganic ion transport and metabolism; Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R: General function prediction only; S: Function unknown; T: Signal transduction mechanisms; U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V: Defense mechanisms; W: Extracellular structures; Y: Nuclear structure; Z: Cytoskeleton. |
| 图选项 |
2.2 CRISPR-Cas系统基因组特征 通过注释创伤弧菌TF3全基因组，获得其全基因组基因注释表，分析发现，Scaffold19框架序列中存在多个cas基因。进一步采用CRISPR Finder查找Scaffold19的基因组序列，发现创伤弧菌TF3具有一个CRISPR位点，由此说明创伤弧菌TF3具备一个完整的CRISPR-Cas系统，将其命名为CRISPR-CasTF3。
cas系列基因位于该CRISPR位点上游，包括8个串列的cas基因，其排列为cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2 (图 2)，cas基因的数量、排列与Ι-E型大肠杆菌的CRISPR-Cas系统类似[16]，其中cas3是此类型CRISPR的特征基因，能编码单链DNA核酸酶，具有切割DNA的作用[17]。cas1和cas2存在于所有的CRISPR系统中，且都具有核酸内切酶的活性，它们参与获取新的间区序列[17]，cas1能与反转录酶结合获取RNA形式的异源核酸加工成间区序列[18]。
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| 图 2 基因岛MGIVvuTF3结构示意图 Figure 2 Schematic diagrams of genomic island MGIVvuTF3. |
| 图选项 |
CRISPR-CasTF3的CRISPR位点区由R序列与S序列交替形成。R序列为GTCTTCCCCACGCC CGTGGGGGTGTTTC，大小为28 bp，有50个重复，每2个R序列间为1个S序列，因此共有49个S序列。S序列长度不一，其中44个长33 bp，2个为34 bp，3个长度为32 bp。通过对49个S序列逐个进行BLASTn和BLASTx分析，并没有找到与我们搜索的S序列同源性很高的序列。整个CRISPR-CasTF3系统结构如图 2所示，CRISPRFinder数据库显示大多数的创伤弧菌以及其他弧菌菌种并不具有典型的CRISPR系统。
2.3 基因岛的发现与分析 为了探索CRISPR-CasTF3在基因组中的插入位点及其邻近基因的特征，进一步对CRISPR-CasTF3系统所在的Scaffold19分析，发现CRISPR-CasTF3上游存在一个类似基因岛(或前噬菌体)的位点特异性整合酶基因int，通过Tandem Repeats Finder对Scaffold19是否具有重复的att序列进行查找，发现Scaffold19具有2个正向重复的att序列，长16 bp，其序列为ATTAGTTCATGCCGTA，2个att序列所夹区域与采用IslandViewer 4预测的其中一个基因岛完全一致，此区域还包括一些与基因岛(或前噬菌体)相关的基因[19](表 1)，表明其是一个基因岛，将其命名为MGIVvuTF3 (GenBank No. MF663762)，二端的att位点分别命名为attL和attR。MGIVvuTF3全长18113 bp，插入在fis基因的3'末端。MGIVvuTF3包括了int基因、orf1基因、cas系列基因、orf2基因、orf3基因、alpA基因、alpB基因。int负责基因岛的位点特异性整合；orf1根据其结构域功能预测与基因岛的转移相关，属于Fic蛋白家族；orf3包含一个Inovirus Gp2结构，可能与基因岛复制相关；alpA表达后具有转录调节因子活性；alpB表达后具有转录抑制作用。MGIVvuTF3还包含一个orf2基因，编码假想的蛋白，功能未知。整个基因岛的结构如图 2所示。
表 1. MGIVvuTF3与MGIVch0395所含基因对比 Table 1. Comparison of the genes in MGIVvuTF3 and MGIVch0395
| Genes | Locus | Coding for | Similarity with genes in MGIVch0395/% |
| int | 179-1438 | Integrase | 94 |
| orf1 | 1444-2427 | Fic family protein | 95 |
| cas3 | 3381-5993 | Cas3 | 98 |
| cas8e | 5996-7519 | Cas8e | 99 |
| cse2 | 7533-8093 | Cse2 | 99 |
| cas6 | 8086-8733 | Cas6 | 99 |
| cas7 | 8917-9798 | Cas7 | 98 |
| cas5 | 9802-10518 | Cas5 | 95 |
| cas1 | 10521-11396 | Cas1 | 98 |
| cas2 | 11422-11664 | Cas2 | 99 |
| orf2 | 14892-15578 | Hypothetical protein | 91 |
| orf3 | 16423-15773 | InovirusGp2 family protein | 92 |
| alpA | 16797-16576 | Transcription regulator | 92 |
| alpB | 17030-16797 | Transcription repressor | 93 |
表选项
2.4 基因岛比较分析 采用BLASTn对MGIVvuTF3的相似序列进行了搜索，发现仅霍乱弧菌O395基因组中存在一个与MGIVvuTF3类似的基因岛，命名为MGIVch0395 (GenBank No：MF663762)。通过Tandem Repeats Finder找到MGIVch0395具有与MGIVvuTF3相同的attL和attR序列。采用RAST注释该基因岛序列，发现MGIVch0395和MGIVvuTF3包含相同的cas基因及排列，因此该基因岛也可能存在CRISPR位点，通过CRISPRFinder搜索该基因岛，发现该基因岛的CRISPR位点以GTCTTCCCCACGCA GGTGGGGGTGTTTC为R序列，长度为28 bp，它与MGIVvuTF3的R序列仅有2个位点的差异。MGIVch0395的CRISPR系统有39个S序列，但是其S序列与MGIVvuTF3序列完全不同。为了更直观地对2个基因岛进行比较，用WebACT进行两基因岛序列对比，其结果如图 3所示。
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| 图 3 基因岛序列对比图 Figure 3 Comparison diagram of genomic island sequence. Similar areas are shown in gray black and numbers indicate similarity. |
| 图选项 |
由图可见，这2个基因岛之间存在着广泛的相似性和同源性，基因不存在重排，表明它们具有完全相同的结构和基因排列。MGIVch0395整合在霍乱弧菌O395基因组fis基因3'末端，因此二者具有完全相同的整合位点。对2个基因岛相似的基因逐个进行了BLAST比对，其比对结果见表 1。结果表明2个基因岛及其CRISPR-Cas虽然保守的基因高度相似，但并非完全一致。
3 讨论 CRISPR-Cas赋予宿主菌对异源入侵DNA (有些情况是RNA)的抵抗力[4, 7, 11]，关于CRISPR-Cas的起源至今不为人知[20-21]，但是研究者已经指出CRISPR-Cas很可能通过基因水平转移获得[2-23]。本研究中发现CRISPR-CasTF3位于基因岛MGIVvuTF3上。MGIVvuTF3具有att序列以及一系列与基因组整合及剪切相关的基因，并且仅在创伤弧菌TF3中发现了MGIVvuTF3的存在，与之高度相似的基因岛MGIVch0395也仅出现在霍乱弧菌O395基因组中，这些特征均表明MGIVvuTF3及其所携带的CRISPR-CasTF3并非宿主菌固有，而是通过基因水平转移获得，进一步验证了上述研究者的推测。然而迄今为止并未发现任何一类细菌或古菌中具有高频率的CRISPR-Cas系统存在，表明CRISPR-Cas系统的祖先似乎并不存在于目前已经培养的微生物种类中。
CRISPR-CasTF3具有多个相同的S序列。类似的现象也出现在其他的CRISPR-Cas系统中[24]，但目前对于同一个CRISPR-Cas系统中具有多个相同的S序列的生物学意义尚不清楚。CRISPR-Cas系统中，S序列被认为来自于异源入侵的核酸，包括质粒和噬菌体[10, 12, 18]，CRISPR-CasTF3具有多达49个S序列，然而BLAST搜索并没有发现与其序列高度相似的序列，这一方面表明CRISPR-CasTF3的宿主菌可能经历过多次异源DNA的入侵，另一方面表明尽管NCBI已经贮备海量的环境微生物核苷酸序列，但并不足以反映自然界庞大的微生物群体的存在。
早在2009年就有研究者对霍乱弧菌O395上的CRISPR系统进行了报道[25]，但没有对此CRISPR系统所处的位置进行分析，因此没有发现霍乱弧菌O395中具有类似MGIVvuTF3的基因岛。MGIVch0395和MGIVvuTF3具有广泛的相似性和同源性，二者也存在完全一致的基因结构和排列，因此有理由推测二者来源同一个祖先，然而MGIVch0395和MGIVvuTF3不尽相同，特别是int、orf1、R序列，很可能在漫长的进化过程中，2个基因岛已经趋异。此外，二者的S序列完全不同，表明一系列DNA入侵事件很可能发生在宿主菌获得CRISPR系统后。另外，CRISPR-Cas系统是大多数细菌和对抗异源核酸入侵的免疫武器，我们是否能够借助基因岛转移的方式把此系统转移到一些重要的工业或农业应用菌种中，使其获得抵制噬菌体侵染的免疫能力，也需要进一步的探索。
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